专利名称：冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。
背景技术：
血小板抗体是由异体或自身血小板抗原作用机体产生的，包括同种异体抗体、自 身抗体、同种抗体、药物依赖性抗体和非特异性抗体五类，这些抗体作用于人体血小板可 导致血小板发生破坏并引起胎母同种异体免疫血小板减少症(FMAIT)、血小板输注无效症 (PTR)、输血后紫癜(PTP)等多种血小板免疫疾病。准确、快速、简便的检测和鉴定出血小板抗体对血小板免疫性疾病的诊断、治疗等 方面起着重要的作用。然而，目前国际上尚缺乏标准化的血小板抗原谱细胞供临床常规检 测应用，主要原因是血小板在液态环境下极易发生聚集并丢失其抗原性。目前各实验室在 检测血小板抗体时只能采用自行制备的血小板抗原，因为不知道血小板的抗原，导致同一 份样本在各实验室检测的结果很难一致。另外随机选用的血小板进行血小板抗体检测时极 易造成血小板抗体的漏检，导致错误的检测和诊断结果。

发明内容
本发明的目的是为了解决临床缺乏血小板抗原谱细胞，易出现抗体漏检和不能确 定抗体特异性的问题，组建ΗΡΑ-Γ6，15基因分型的血小板抗原谱细胞系，可广泛应用于血 小板抗体的检测和特异性鉴定的冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法。本发明步骤是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系统基因分型的检测
采集献血员EDTA抗凝全血，通过盐析法提取DNA，其纯度应在1. 6以上；对献血员样本 进行HPA-广6，15系统进行基因分型，扩增条件如下95°C预变性5min后，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30 个循环，72°C延伸 5min ；
b、组建血小板抗原谱细胞系
血小板抗原谱细胞根据0型献血员的血小板抗原分型结果建立10组HPA-广6，15系统 的抗原谱，其抗原分型见表1 ；
c、血小板悬液的制备采集筛选好的10名献血员新鲜EDTA抗凝全血，900rpm离心 30min ；取上层富血小板血浆，3000rpm离心30min ；弃血浆，用冻干保护液充分悬浮压积血 小板，并调节血小板浓度为10(T150X107L ；
d、负载将血小板悬液置于37°C恒温箱中负载4h，期间每隔30min振荡混勻一次；
e、冷冻干燥将负载后的血小板悬液分装后，置于冻干机中进行冷冻干燥；其冻干条 件见表2。本发明冻干保护液包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M pH7. 0 PBS中含30 50 mmol/L的 海藻糖和广3%的牛血清白蛋白。本发明将冻干型血小板抗原谱细胞用生理盐水溶解后，用来进行血小板抗体检测及特异性鉴定实验。本发明的优点用基因分型的0型血献血员的血小板制备成稳定的血小板抗原谱 细胞冻干品，为临床提供可长期保存的抗原，防止临床漏检血小板抗体，也使得血小板抗体 检测和鉴定易于常规化，标准化。本发明关键在于检测0型献血员HPA-广6，15基因分型，根据分型的结果建立血小 板抗原谱。HPA基因分型的血小板抗原谱细胞，经冷冻干燥制备成抗原性稳定的冻干品，在 血小板抗体检测时可确定抗体的特异性，同时解决了血小板抗原难以稳定保存的难题。


图1是本发明固相凝集法反应格局图----------阳性；
图2是本发明固相凝集法反应格局图----------弱阳性；
图3是本发明固相凝集法反应格局图----------阴性。
具体实施例方式本发明步骤是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系统基因分型的检测
采集献血员EDTA抗凝全血，通过盐析法提取DNA，其纯度应在1. 6以上；对献血员样本 进行HPA-广6，15系统进行基因分型，扩增条件如下95°C预变性5min后，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30个循环，72°C延伸5min ；电泳后用凝胶成像系统观察并记录结果。b、组建血小板抗原谱细胞系
HPA是血小板上特异性抗原，具有多态性。在血小板输血、妊娠、移植时易造成产生相应 抗体并引起相关的血小板相关免疫性疾病。血小板抗原谱细胞根据0型献血员的血小板抗原分型结果建立10组HPA-广6，15 系统的抗原谱，其抗原分型见表1 ；
表1. 10组血小板抗原谱细胞的HPA-广6，15系统的抗原分型
权利要求
一种冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法，其特征在于a、血小板抗原HPA 1~6和HPA 15系统基因分型的检测采集献血员EDTA抗凝全血，通过盐析法提取DNA，其纯度应在1.6以上；对献血员样本进行HPA 1~6，15系统进行基因分型，扩增条件如下95℃预变性5min后，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 50s，30个循环，72℃延伸5min ；b、组建血小板抗原谱细胞系血小板抗原谱细胞根据O型献血员的血小板抗原分型结果建立10组HPA 1~6，15系统的抗原谱，其抗原分型见表1； c、血小板悬液的制备采集筛选好的10名献血员新鲜EDTA抗凝全血，900rpm离心30min；取上层富血小板血浆，3000rpm离心30min；弃血浆，用冻干保护液充分悬浮压积血小板，并调节血小板浓度为100~150×109/L ；d、负载将血小板悬液置于37℃恒温箱中负载4h，期间每隔30min振荡混匀一次；e、冷冻干燥将负载后的血小板悬液分装后，置于冻干机中进行冷冻干燥；其冻干条件见表2。
2.权利要求1所述的冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法，其特征在于冻干保护液 包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M ρΗ7· 0 PBS中含30 50 mmol/L的海藻糖和Γ3%的牛血清白蛋白。
3.权利要求1所获得冻干型血小板抗原谱细胞的用途，其特征在于将冻干型血小板 抗原谱细胞用生理盐水溶解后，用来进行血小板抗体检测及特异性鉴定实验。
全文摘要
一种冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法，属于生物技术领域。本发明的目的是为了解决临床缺乏血小板抗原谱细胞，易出现抗体漏检和不能确定抗体特异性的问题，组建HPA-1~6，15基因分型的血小板抗原谱细胞系，可广泛应用于血小板抗体的检测和特异性鉴定的冻干型血小板抗原谱细胞的制备方法。本发明步骤是a、血小板抗原HPA-1~6和HPA-15系统基因分型的检测；b、组建血小板抗原谱细胞系；c、血小板悬液的制备；d、负载；e、冷冻干燥。本发明关键在于检测O型献血员HPA-1~6,15基因分型，根据分型的结果建立血小板抗原谱。HPA基因分型的血小板抗原谱细胞，经冷冻干燥制备成抗原性稳定的冻干品，在血小板抗体检测时可确定抗体的特异性，同时解决了血小板抗原难以稳定保存的难题。
文档编号G01N33/531GK101957364SQ201010285608
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者孔维臣, 杨文冲, 段生宝, 童军, 邰慧波, 鞠海英 申请人:李勇