专利名称：一种检测食品中脂肪酸氯丙醇酯单双酯含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测食品中油脂的方法，尤其是一种利用气相色谱-质谱联用仪检测食品中脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸
2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯四类酯含量的方法。
背景技术：
氣丙醇是熟知的食品加工过程污染物，尤其是3_氣_1，2-丙二醇(简称3-MCPD),因其具有肾脏毒性、生殖毒性、免疫抑制和潜在致癌性等作用而被广泛关注，而脂肪酸氯丙醇酯(氯丙酯)是氯丙醇与脂肪酸酯化而形成的一类物质，是近年来国际上新出现的食品安全问题，尤其在油脂类食品中脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇酯(简称3-MCPD酯)的污染最为严重。目前3-MCPD酯的毒性仍不十分清楚，对其健康风险的担心主要是因为氯丙酯的水解产物有多种毒性，因此，氯丙酯的水解增加了 3-MCPD的暴露水平，摄入量可能是3-MCPD的暂定每日最大耐受量的5 100倍。3-MCPD酯具有3-MCPD单酯和双酯两种异构体，结构上的差异可能导致毒理学作用的差异。Manliu等以大鼠进行试验，发现3-MCPD 二酯会致使大鼠精子减少(即具有生殖毒性)，而3-MCPD单酯不但与3-MCPD 二酯同样具有生殖毒性，还会使大鼠肾小管坏死(即肾脏毒性)。在模拟肠道模型的脂肪酶水解试验中发现，3-MCPD单酯水解成3-MCPD的速率远远超过3-MCPD 二酯的速率。鉴于此，有必要建立对3-MCPD单/双酯分别进行分离和检测的方法，获得食品中3-MCPD单酯、双酯的比例，从而有助于更精确地对3-MCPD酯的健康风险进行评估。目前国际上以水解法间接测定脂肪酸氯丙醇酯总量的研究报道已经较多，但对食品中脂肪酸氯丙醇单/双酯含量分别检测的研究甚少，Seefelder等人利用氨丙基(aminopropyl)固相萃取法，以不同比例的正己烷、乙醚、二氯甲烷以及乙酸乙酯的混合液洗脱，将3-MCPD单酯与双酯分离，再结合GC-MS分别检测各自的含量，由于所用溶剂种类多，溶剂比例复杂，操作非常繁琐(Janis C，Owen W P，Ray H L，et al.Jr.J.Agric.Food Chem.1984，32(3)，474-476.) ;Zelinkov(5等人利用硅胶固相萃取法，采用不同比例的石油醚与乙醚混合溶剂进行洗脱分离MCPD单/双酯，然后结合GC-MS进行分析，但其缺点是所需洗脱溶剂比例多，且消耗溶剂体积多达850 ml，操作繁琐，灵敏度低，且对仪器污染严重(Zuzana Z , Doleqal M, Jan V.Eur Food Res Technol.2009, 228:571 -578.)。为克服上述缺点，本发明采用氨基固相萃取柱，利用正己烷一乙酸乙酯混合溶剂洗脱，并米用碱水解一苯基硼酸衍生化的GC-MS法来测定脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二
醇二酯含量。

发明内容
本发明采用气相色谱-质谱联用仪来检测食品脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，月旨肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯四类单酯或双酯，包括以下步骤:
(一)样品的处理
称取待测食物样品适量于塑料离心管中，加入混合内标溶液，超声混合均匀，其中脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯所对应的内标分别为d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、d5-硬脂酸3-氯-1，3-丙二醇单酯、d5-硬脂酸3-氯_1，3-丙二醇二酯；
(二)萃取分离
上柱:将混合均匀的样品和内标溶液，转入经正己烷活化后固相萃取柱中，并两次以正己烷洗涤离心管，将洗涤液一并转入固相萃取柱中，固相萃取柱的填料为氨基填料、硅藻土中的一种或者混合物，填料的重量为0.5g至5.0 g之间，其中氨基填料的粒度为50目至400目之间；
洗脱:以正己烷为洗脱溶剂将脂肪酸氯丙醇双酯洗脱下来，用玻璃试管收集洗脱液，然后再用正己烧一乙酸乙酯混合溶剂洗脱脂肪酸氯丙醇单酯，用另一支玻璃试管收集该洗脱液，其中正己烷一乙酸乙酯混合溶液中正己烷和乙酸乙酯的任何体积比可以是10:0,9:1、8:2、7:3中的一个；洗脱时采用的任何流速，可以为0.5 ml/min>1.0 ml/min>1.5 ml/min中的一个；
(三)碱水解处理 分别将步骤(二)所得洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干，加入甲基叔丁基醚一乙酸乙酯溶液溶解残渣，再加入硫酸丙醇溶液，然后加入水解试剂水解I min后，迅速加入冰乙酸溶液，充分涡旋混匀，然后加入正己烷脱脂，充分涡旋后静置，待明显分层后去除正己烷层，再用正己烷萃取I次，弃去正己烷相，水相供衍生化用，其中水解试剂为甲醇钠一甲醇溶液或氢氧化钠溶液；
(四)衍生化处理
向上述净化液中加入衍生化试剂，涡旋混匀后于80 °C下衍生20 min,待其冷却至室温后，加入乙酸乙酯充分涡旋，静置分层后，将乙酸乙酯层转移至另一试管中，再重复萃取2次，合并3次萃取液，于氮气流下缓慢吹干，残余物用异辛烷溶解后，以12000转/min的速度离心5 min，取上清液供GC-MS进样分析，其中衍生化试剂为苯基硼酸或七氟丁酰基咪唑溶液；
(五)气相色谱-质谱联用仪分析
分别将步骤(三)、(四)和步骤(五)所得上清液通过气相色谱-质谱联用仪进行检测，气相色谱-质谱联用仪所需条件如下:
色谱柱:DB-5MS毛细管柱；进样口温度:280 V ;柱始温:80 °C保持I min，再以10
V/min的速度程序升温至190 °C，最后以40 V /min的速度升至300 °C，保持5 min ;载气:高纯氦，流速3.0 mL/min ;进样方式:不分流进样；进样体积:1 μ L ；
离子源:电子轰击离子源(EI);电子倍增器增益:+ 250V;灯丝电流:100 μΑ;阱温度:230 V ;传输线温度:250 V ;歧盒温度:50 V ;溶剂延迟:3 min ;质谱采集时间:3-29.75 min ;扫描质量数范围:90-300 ;扫描速率:0.65 s/次；脂肪酸3-氯-1, 2-丙二醇和脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量尚子分别为m/zl47和m/zl96,内标d5-3_氯-1，2-丙二醇和d5-脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量离子分别为m/zl50和m/z201 ；
(六)标准曲线的制备
分别准确称取适量脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，月旨肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯标准品于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烧稀释成25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500ng/ml的标准工作液，各加入与样品相同量的的内标溶液，然后按照步骤(三)、(四)和(五)进行处理分析；
(七)定量方法
以标准品脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸
2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯与各自内标峰面积比值和进样质量计算线性回归方程，通过该方程对样品中的脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸
3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯进行定量。本发明所提供的方法需要溶剂种类和消耗量少，操作简单，灵敏度高，分离能力强、定性分析结果准确、检测限低、分析时间快。
具体实施例方式实验仪器 及材料:
3800型气相色谱仪和Saturn 2200型气相色谱一质谱联用仪(美国Varian公司)；G-560 E型漩涡混合器(美国Scientific Industries公司)；KQ_500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；N-EVAPTM 111 型氮吹仪(美国 Organomation Associates 公司)，Microfuge 型高速离心机(美国Beckman公司);CP 225D电子天平(准确至0.0lmg,德国Sartorious公司，用于称量标准品);YP202电子天平(上海商品公司，用于样品称量)，6 ml聚丙烯固相萃取柱柱筒(Agela公司，配筛板)。玻璃器皿在220°C下烘烤3 h后使用。1.5ml塑料离心管、一次性注射器(lml，上海双鸽实业有限公司)和塑料滴管(Iml和5ml，新康医疗器械有限公司)、IOml玻璃试管。花生油等食用植物油和常见品牌婴幼儿奶粉(包括一、二、三阶段)均购自福州当地超市，奶粉中脂肪提取按国家标准GB/T5413.3-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》法中第一法。甲基叔丁基醚、甲醇钠、氯化钠、正丙醇、浓硫酸、乙酸乙酯(重蒸)和冰乙酸均为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)。正己烷为农残级(Fisher公司)，甲醇、丙酮均为色谱纯((Fisher公司),苯基硼酸(10 g/瓶,Organics公司)。水为纯水。固相萃取柱填料CNWBOND NH2氨基(23(Γ400目，上海安谱科学仪器有限公司)甲基叔丁基醚/乙酸乙酯混合液(￥八=8:2);硫酸/丙醇(￥八=0.5:100);甲醇钠/甲醇(0.5 mol/L，即2.16g甲醇钠溶于40ml甲醇中);冰乙酸溶液(1.0 mL冰乙酸溶于30 mL 20%氯化钠溶液中)；PBA溶液(2.5 g苯基硼酸溶于20 mL丙酮/水(V/V=19:l)中。棕榈酸3-MCPD 单酯(纯度 98%，CAS 号 30557_04_1 )、棕榈酸 3-MCPD 二酯(纯度 98%，CAS号51930-97-3)、硬脂酸2-MCPD 二酯(纯度98%，CAS号267_56_4)、及氘代同位素棕榈酸 d5-3-MCPD 单酯(纯度 99%)，棕榈酸 d5-3_MCPD 二酯(纯度 99%，CAS 号 1185057-55-9)和硬脂酸d5-2-MCPD 二酯(纯度99%)以及其他MCPD酯标准品均购自TRC公司(加拿大)。实施例1:
(一)样品的处理
分别准确称取适量d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、d5-硬脂酸2-氯-1，3-丙二醇单酯、d5-硬脂酸2-氯-1，3-丙二醇二酯于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烷稀释至2.0μδ/πι1的混合内标溶液。称取0.1 g食用油样品于1.5ml塑料离心管中，加入25μ1混合内标溶液，45°C下超声混合5 min。(二)萃取分离
上柱:将混合均匀的样品和内标溶液，转入经4.0ml正己烷活化后的6.0 ml氨基固相萃取柱(氨基填料重量为0.5g，粒度为23(Γ400目)中，并两次以ΙΟΟμΙ正己烷洗涤离心管，将洗涤液一并转入氨基固相萃取柱中；
洗脱:以6.0ml正己烷为洗脱溶剂将脂肪酸氯丙醇双酯洗脱下来，用10 ml玻璃试管收集洗脱液，然后再用6.0ml正己烷和乙酸乙酯以体积比7:3混合而成的正己烧一乙酸乙酯溶液为洗脱溶剂洗脱脂肪酸氯丙醇单酯单酯，用另一支玻璃试管收集该洗脱液；洗脱时，流速均为 1.0 ml/min。(三)碱水解处理
分别将步骤(二)所得洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干，加入0.5ml按甲基叔丁基醚和乙酸乙酯体积比为4:1混合而成的甲基叔丁基醚一乙酸乙酯溶液溶解残渣，再加入用
0.5ml的98%浓硫酸溶于IOOml丙醇配制而成的硫酸丙醇溶液,然后加入0.5 mL浓度为0.5mol/L的甲醇钠一甲醇溶液水解I min后,迅速加入3.0ml用Iml冰乙酸溶于29ml饱和氯化钠中配制而成的冰乙酸溶液，充分涡旋混匀以中和过量的甲醇钠，然后加入3.0 ml正己烷脱脂，充分涡旋后，静置，待明显分层后去除正己烷层，再用3.0 ml正己烷萃取I次，弃去正己烷相，水相供衍生化用。(四)衍生化处理
向上述净化液中加入0.25 ml先将2.5g苯基硼酸溶于20 mL丙酮后，再将所得溶液与水按照体积比19:1混合所配制的苯基硼酸溶液，涡旋混匀后于80 °C下衍生20 min，待其冷却至室温后，加入2.0 ml乙酸乙酯充分涡旋，静置分层后，将乙酸乙酯层转移至另一试管中，再重复萃取2次，合并3次萃取液，于氮气流下缓慢吹干，残余物用0.5 ml异辛烷溶解后，以12000转/min的速度离心5 min，取上清液供GC-MS进样分析。(五)气相色谱-质谱联用仪分析
分别将步骤(三)、(四)和步骤(五)所得上清液通过气相色谱-质谱联用仪进行检测，气相色谱-质谱联用仪所需条件如下:
色谱柱:DB-5MS毛细管柱；进样口温度:280 V ;柱始温:80 °C保持I min，再以10
V/min的速度程序升温至190 °C，最后以40 V /min的速度升至300 °C，保持5 min ;载气:高纯氦，流速3.0 mL/min ;进样方式:不分流进样；进样体积:1 μ L ；
离子源:电子轰击离子源(EI);电子倍增器增益:+ 250V;灯丝电流:100 μΑ;阱温度:230 V ;传输线温度:250 V ;歧盒温度:50 V ;溶剂延迟:3 min ;质谱采集时间:3-29.75 min ;扫描质量数范围:90-300 ;扫描速率:0.65 s/次；脂肪酸3-氯-1, 2-丙二醇和脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量尚子分别为m/zl47、196,内标d5-3_氯-1，2-丙二醇和d5-脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量离子分别为m/zl50、201。(六)标准曲线的制备
分别准确称取适量脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，月旨肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯标准品于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烧稀释成25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500ng/ml的标准工作液，各加入与样品相同量的的内标溶液，然后按照步骤(三)、(四)和(五)进行处理分析。(七)定量方法
以标准品脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸
2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯与各自内标峰面积比值和进样质量计算线性回归方程，通过该方程对样品中的脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸
3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯进行定量。通过结果分析，各脂肪酸氯丙醇单/双酯及其内标的回收率皆在92.2 102%之间，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇二酯的检出限分别为83 μ g/kg、125 μ g/kg、92 μ g/kg、100μ g/kg,定量限分别为 278μ g/kg、417y g/kg、243y g/kg , 333 μ g/kg ;脂肪酸
3-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇二酯的回归方程分别为:Y=0.0246Χ+0.0169, Y=0.0274Χ-0.2664，Y=0.0174Χ-0.0664，Y=0.0133Χ-0.0290，在25 500ng范围线性关系良好，相关系数R都在
0.9994以上。测得脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯含量在83 μ g/kg 5.9 mg/kg之间、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯含量在125 μ g/kg 1.2 mg/kg之间；脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯的含量在92μ g/kg ^2.5 mg/kg之间、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇二酯的含量在100 μ g/kg 0.7 mg/kg 之间。实施例2:
(一)样品的处理
分别准确称取适量d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、d5-硬脂酸2-氯-1，3-丙二醇单酯、d5-硬脂酸2-氯-1，3-丙二醇二酯于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烷稀释至2.0μδ/πι1的混合内标溶液。称取混匀后的奶粉lg，按照国家标准GB/T5413.3-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》法中第一法对其进行脂肪提取，然后取0.1g奶粉的脂肪提取物于1.5ml塑料离心管中，加入25μ1混合内标溶液，45 °C下超声混合5 min ；
(二)萃取分离
上柱:将混合均匀的样品和内标溶液，转入经4.0ml正己烷活化后的6.0 ml氨基固相萃取柱(氨基填料重量为 0.5g，粒度为23(Γ400目)中，并两次以ΙΟΟμΙ正己烷洗涤离心管，将洗涤液一并转入氨基固相萃取柱中；
洗脱:以6.0ml正己烷为洗脱溶剂将脂肪酸氯丙醇双酯洗脱下来，用10 ml玻璃试管收集洗脱液，然后再用6.0ml正己烷和乙酸乙酯以体积比7:3混合而成的正己烧一乙酸乙酯溶液为洗脱溶剂洗脱脂肪酸氯丙醇单酯单酯，用另一支玻璃试管收集该洗脱液；洗脱时，流速均为 1.0 ml/min。(三)碱水解处理
分别将步骤(二)所得洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干，加入0.5ml按甲基叔丁基醚和乙酸乙酯体积比为4:1混合而成的甲基叔丁基醚一乙酸乙酯溶液溶解残渣，再加入用
0.5ml的98%浓硫酸溶于IOOml丙醇配制而成的硫酸丙醇溶液,然后加入0.5 mL浓度为0.5mol/L的甲醇钠一甲醇溶液水解I min后,迅速加入3.0ml用Iml冰乙酸溶于29ml饱和氯化钠中配制而成的冰乙酸溶液，充分涡旋混匀以中和过量的甲醇钠，然后加入3.0 ml正己烷脱脂，充分涡旋后，静置，待明显分层后去除正己烷层，再用3.0 ml正己烷萃取I次，弃去正己烷相，水相供衍生化用。(四)衍生化处理
向上述净化液中加入0.25 ml先将2.5g苯基硼酸溶于20 mL丙酮后，再将所得溶液与水按照体积比19:1混合所配制的苯基硼酸溶液，涡旋混匀后于80 °C下衍生20 min，待其冷却至室温后，加入2.0 ml乙酸乙酯充分涡旋，静置分层后，将乙酸乙酯层转移至另一试管中，再重复萃取2次，合并3次萃取液，于氮气流下缓慢吹干，残余物用0.5 ml异辛烷溶解后，以12000转/min的速度离心5 min，取上清液供GC-MS进样分析。(五)气相色谱-质谱 联用仪分析
分别将步骤(三)、(四)和步骤(五)所得上清液通过气相色谱-质谱联用仪进行检测，气相色谱-质谱联用仪所需条件如下:
色谱柱:DB-5MS毛细管柱；进样口温度:280 V ;柱始温:80 °C保持I min，再以10
V/min的速度程序升温至190 °C，最后以40 V /min的速度升至300 °C，保持5 min ;载气:高纯氦，流速3.0 mL/min ;进样方式:不分流进样；进样体积:1 μ L ；
离子源:电子轰击离子源(EI);电子倍增器增益:+ 250V;灯丝电流:100 μΑ;阱温度:230 V ;传输线温度:250 V ;歧盒温度:50 V ;溶剂延迟:3 min ;质谱采集时间:
3-29.75 min ;扫描质量数范围:90-300 ;扫描速率:0.65 s/次；脂肪酸3-氯-1, 2-丙二醇和脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量尚子分别为m/zl47、196,内标d5-3_氯-1，2-丙二醇和d5-脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量离子分别为m/zl50、201。(六)标准曲线的制备
分别准确称取适量脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，月旨肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯标准品于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烧稀释成25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500ng/ml的标准工作液，各加入与样品相同量的的内标溶液，然后按照步骤(三)、(四)和(五)进行处理分析；
(七)定量方法
以标准品脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯与各自内标峰面积比值和进样质量计算线性回归方程，通过该方程对样品中的脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸
3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯进行定量。通过结果分析，各脂肪酸氯丙醇单/双酯及其内标的回收率皆在92.2 102%之间，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇二酯的检出限分别为95μ g/kg、142y g/kg、84y g/kg , 122 μ g/kg,定量限分别为 316 μ g/kg、473 μ g/kg、298 μ g/kg >406 μ g/kgD 脂肪酸
3-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇二酯的回归方程分别为:Y=0.0246Χ+0.0169, Y=0.0274Χ-0.2664，Y=0.0174Χ-0.0664，Y=0.0133Χ-0.0290，在25 500ng范围线性关系良好，相关系数R都在
0.9994以上。测得脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯含量在95 μ g/kg 1.3 mg/kg之间、脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯的含量在142 μ g/kg 0.6mg/kg之间；脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇单酯、脂肪酸2-氯-1，2-丙 二醇二酯均未检出。
权利要求
1.一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:包括以下步骤: (一)样品的处理 称取待测食物样品适量于塑料离心管中，加入混合内标溶液，超声混合均匀； (二)萃取分离 上柱:将混合均匀的样品和内标溶液，转入固相萃取柱中，并两次以正己烷洗涤离心管，将洗涤液一并转入固相萃取柱中； 洗脱:以正己烷为洗脱溶剂将脂肪酸氯丙醇双酯洗脱下来，用玻璃试管收集洗脱液，然后再用正己烧一乙酸乙酯混合溶剂洗脱脂肪酸氯丙醇单酯，用另一支玻璃试管收集该洗脱液； (三)碱水解处理 分别将步骤(二)所得洗脱液置于氮气流下缓缓浓缩至近干，加入甲基叔丁基醚一乙酸乙酯溶液溶解残渣，再加入硫酸丙醇溶液，然后加入水解试剂水解I min后，迅速加入冰乙酸溶液，充分涡旋混匀，然后加入正己烷脱脂，充分涡旋后静置，待明显分层后去除正己烷层，再用正己烷萃取I次，弃去正己烷相，水相供衍生化用； (四)衍生化处理 向上述净化液中加入衍生化试剂，涡旋混匀后于80 °C下衍生20 min,待其冷却至室温后，加入乙酸乙酯充分涡旋，静置分层后，将乙酸乙酯层转移至另一试管中，再重复萃取2次，合并3次萃取液，于氮气流下缓慢吹干，残余物用异辛烷溶解后，以12000转/min的速度离心5 min，取上清液供GC-MS进样分析； (五)气相色谱-质谱联用仪分析 分别将步骤(三)、(四)和步骤(五)所得上清液通过气相色谱-质谱联用仪进行检测，气相色谱-质谱联用仪所需条件如下: 色谱柱:DB-5MS毛细管柱；进样口温度:280 V ;柱始温:80 °C保持I min，再以10°C/min的速度程序升温至190 °C，最后以40 °C/min的速度升至300 °C，保持5 min ;载气:高纯氦，流速3.0 mL/min ;进样方式:不分流进样；进样体积:1 μ L ； 离子源:电子轰击离子源(EI);电子倍增器增益:+ 250V;灯丝电流:100 μΑ;阱温度:230 V ;传输线温度:250 V ;歧盒温度:50 V ;溶剂延迟:3 min ;质谱采集时间:3-29.75 min ;扫描质量数范围:90-300 ;扫描速率:0.65 s/次；脂肪酸3-氯-1, 2-丙二醇和脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量尚子分别为m/zl47和m/zl96,内标d5-3_氯-1，2-丙二醇和d5-脂肪酸2-氯-1，2-丙二醇的定量离子分别为m/zl50和m/z201 ； (六)标准曲线的制备 分别准确称取适量脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，月旨肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯标准品于IOml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解后定容至刻度，充分混匀得到标准储备液，于-24°C冰箱中放置保存；再分别取适量储备液用正己烧稀释成25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500ng/ml的标准工作液，各加入与样品相同量的的内标溶液，然后按照步骤(三)、(四)和(五)进行处理分析； (七)定量方法 以标准品脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯与各自内标峰面积比值和进样质量计算线性回归方程，通过该方程对样品中的脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯进行定量。
2.如权利要求1所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1，2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1，3-丙二醇二酯所对应的内标分别为d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇单酯、d5-棕榈酸3-氯-1，2-丙二醇二酯、d5-硬脂酸3-氯-1，3-丙二醇单酯、d5-硬脂酸3-氯-1,3-丙二醇二酯。
3.如权利要求1所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:固相萃取柱在上柱前需经正己烷活化。
4.如权利要求1或3所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:固相萃取柱的填料为氨基填料、硅藻土中的一种或者混合物。
5.如权利要求1或3所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:固相萃取柱的填料的重量为0.5g至5.0 g之间。
6.如权利要求4所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:氨基填料的粒度为50目至400目之间。
7.如权利要求1所 述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:洗脱溶剂正己烷一乙酸乙酯混合溶液中正己烷和乙酸乙酯的任何体积比可以是10:0,9:1,8:2，7:3 中的一个。
8.如权利要求1所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:洗脱溶剂正己烷和正己烷一乙酸乙酯混合溶液进行洗脱时采用的任何流速，可以为0.5ml/min>1.0 ml/min>1.5 ml/min 中的一个。
9.如权利要求1所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:水解试剂为甲醇钠一甲醇溶液或氢氧化钠溶液。
10.如权利要求1所述一种检测食品中脂肪酸氯丙醇单双酯含量的方法，其特征在于:衍生化试剂为苯基硼酸或七氟丁酰基咪唑溶液。
全文摘要
本发明涉及一种检测食品中油脂的方法，尤其是一种利用气相色谱-质谱联用仪检测食品中脂肪酸3-氯-1,2-丙二醇单酯，脂肪酸3-氯-1,2-丙二醇二酯，脂肪酸2-氯-1,3-丙二醇单酯，脂肪酸2-氯-1,3-丙二醇二酯四类酯含量的方法。本发明采用氨基固相萃取柱，利用正己烷－乙酸乙酯混合溶剂洗脱，并采用碱水解－苯基硼酸衍生化的GC-MS法来进行测定，包括样品处理、萃取分离、碱水解处理、衍生化处理、气相色谱-质谱联用仪分析、标准曲线的制备、定量方法七个步骤，需要溶剂种类和消耗量少，操作简单，灵敏度高，分离能力强、定性分析结果准确、检测限低、分析时间快。
文档编号G01N30/88GK103245752SQ20131012804
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者傅武胜, 吴少明, 郑奎城 申请人:福建省疾病预防控制中心