专利名称：一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法
技术领域：
一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，具体涉及应用浸入固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术检测白酒中苯酚类化合物的方法，属于白酒风味研究领域。

背景技术：
白酒香味化合物十分复杂，种类繁多，含量微少。深入研究微量成分在白酒中起什么作用，以及它们的含量及量比关系如何影响白酒的质量，将对白酒行业的发展有着深远的意义。白酒中苯酚类化合物，由于它们有着极低的风味阈值，对白酒风味有着重要贡献。近来，越来越受到人们的重视。
苯酚类化合物也称为芳香族化合物，挥发性苯酚类化合物在白酒中的含量极少，大多在几个μg/L到几百个μg/L，但他们的呈香作用却很强，在百万分之一甚至千万分之一就能使人感觉到强烈的香气。挥发性苯酚类化合物在许多食物中都报道过是香气的贡献者。如挥发性酚类在一些红葡萄酒中被描述为“酚味”，“动物臭味”和“马厩味”等异味，因此控制一些异味的苯酚类化合物在白酒中的含量对提高白酒的品质十分重要。然而对于一些苯酚类化合物对白酒风味的作用以及其形成机理至今尚未研究透彻，原因之一是缺少可靠的分析方法来测定它们。
固相微萃取(SPME)，这项技术操作简单、快速，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适于分析挥发性和非挥发性化合物，重现性好等优点。GC/MS兼有色谱分离效率高、定量准确以及质谱的选择性高、鉴别能力强、提供丰富的结构信息便于定性等特点，并具备了两者共有的灵敏度高、分析速度快、所需样品量少等优点。因此，应用DI-SPME方法结合GC/MS可以很好的分析中国白酒中挥发性苯酚类化合物。


发明内容
(1)解决的技术问题 本发明的目的在于提供一种利用浸入固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，以对中国各种香型的白酒进行苯酚类化合物的定性定量分析。
(2)本发明的技术方案一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，先用煮沸后冷却的去离子水将待测酒样稀释到最终酒精含量为5％-20％vol，然后用浸入固相微萃取技术富集白酒中苯酚类化合物，再用气相色谱-质谱联用技术对白酒中苯酚类化合物进行定性定量分析；待测的7种苯酚类化合物为4-甲基苯酚，4-乙基苯酚，苯酚，4-甲基愈创木酚，4-乙基愈创木酚，4-丙基愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚；测定步骤为 (1)浸入固相微萃取吸取17mL稀释后的酒样，加入10μL内标溶液，置于20mL小瓶中，并加入5g NaCl，旋紧瓶盖，插入50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头，50℃预热5min，萃取吸附45min； 内标溶液配制以3，4-二甲基苯酚为内标，溶于色谱级乙醇中，浓度为50mg/L； (2)气相色谱-质谱联用萃取结束后将萃取头插入到联有质谱检测器的气相色谱的进样口，250℃热解吸5min，色谱柱采用DB-Wax，60m×0.25mm i.d.×0.25μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速2mL/min；不分流；检测时的升温程序为50℃恒温2min，以4℃/min的速度升温至230℃，保持15min；MS条件EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35-350amu，得到被测白酒酒样的总离子流图谱； (3)未知挥发性苯酚类化合物的定性分析通过比对未知化合物和7种苯酚类化合物的标准品的保留时间，以及离子图谱来确认检测出的苯酚类化合物； (4)对已确认的挥发性苯酚类化合物进行定量分析以该种已确认的挥发性苯酚类化合物标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，该种已确认的挥发性苯酚类化合物标准品与内标物浓度之比为纵坐标，建立标准曲线，通过标准曲线法来定量。实际酒样中苯酚类化合物的含量通过将峰面积比代入标准曲线方程(C标准品/C内标)＝K(S标准品/S内标)+B计算得出。C标准品/C内标为浓度之比，S标准品/S内标为峰面积比。
原混合标准溶液的配制分别准确称取0.1g左右的7种苯酚类化合物的标准品，各自分别溶于10mL色谱级乙醇中，作为单标储备液。将7种苯酚类化合物的单标储备液各吸取5-500μL放入容量瓶中，用5％-20％vol乙醇溶液定容至50mL，作为原混合标准溶液。
标准曲线的建立制作标准曲线所用的一系列浓度是用5％-20％vol的乙醇溶液逐步稀释原混合标准溶液而得，共得到12个浓度梯度的混合标准溶液。对各浓度梯度准确吸取17mL配制好的混合标准溶液于20mL小瓶中，加入10μL内标溶液，用氯化钠饱和，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行浸入固相微萃取。以7种苯酚类化合物的标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，7种苯酚类化合物的标准品与内标物浓度之比为纵坐标绘制标准曲线。
酒样测定将目标酒样稀释到5％-20％vol，加入10μL内标，运用浸入固相微萃取，气相色谱-质谱联用仪进行定性定量分析，比照标准曲线测定被测酒样中挥发性苯酚类化合物含量。
7种挥发性苯酚类化合物的定量，以3，4-二甲基苯酚为内标，在5μg/L-500μg/L或10μg/L-1000μg/L检测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R2均大于0.99。
7种挥发性苯酚类化合物的检测限均小于7μg/L，酒样3次重复测定的相对标准偏差小于15％，7种苯酚类化合物的回收率为85％-115％。
主要试剂与材料 4-甲基愈创木酚，苯酚，4-乙基愈创木酚，4-甲基苯酚，4-丙基愈创木酚，4-乙基苯酚，4-乙烯基愈创木酚和3，4-二甲基苯酚均购于美国Sigma公司；NaCl(分析纯)购于上海国药集团。
白酒样品浓香型白酒，兼香型白酒，酱香型白酒，其它香型白酒和清香型白酒均为从酒厂直接取样的成品酒。
主要仪器 微萃取头加拿大Supelco公司 固相微萃取自动进样器(MPS 2)德国Gerstel公司 气相色谱质谱联用仪GC 6890-MS 5975美国Agilent公司 回收率测定将含有7种苯酚类化合物的混合标准溶液加入到5％-20％vol乙醇水溶液、浓香型白酒、兼香型白酒、酱香型白酒及其它香型白酒，检测加入前后的含量变化。回收率＝[(加入后检测出的苯酚类化合物含量-加入前检测出的苯酚类化合物含量)/加入苯酚类化合物标准品的量]×100％。所有实验重复3次，取平均值作为最终结果。
酒样测定本发明选取了5种白酒为目标酒样，将白酒稀释到5％-20％vol，加入最终浓度为29.684μg/L的内标，按上述方法测定其中挥发性苯酚化合物的含量。表2列出了所测酒样中苯酚类化合物的含量。
(3)有益效果 本发明应用浸入固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对白酒中挥发性苯酚类化合物进行定性定量分析。本发明建立的方法能够快速检测并准确定量白酒中苯酚类化合物，使用浸入固相微萃取无需繁琐的预处理过程，快速简单，用气相色谱-质谱联用技术检测白酒中苯酚类化合物，提高了结果的准确性。该方法可用于各种香型白酒中挥发性苯酚类化合物的分析检测。



图1不同萃取方式的定量方法比较。a、浓香型白酒1，b、浓香型白酒2，c、其它香型白酒，d、酱香型白酒。
图2挥发性苯酚类化合物的标准曲线。
图3其它香型白酒的总离子流色谱图(TIC)。
各图中4-甲基愈创木酚(MG)，苯酚(P)，4-乙基愈创木酚(EG)，4-甲基苯酚(MP)，4-丙基愈创木酚(PG)，4-乙基苯酚(EP)，4-乙烯基愈创木酚(VG)。

具体实施例方式 实施例1不同萃取方式的定量方法比较 选择浓香型白酒1(a)、浓香型白酒2(b)、其它香型白酒(c)和酱香型白酒(d)四个成品白酒样进行搅拌子吸附技术(SBSE)，顶空固相微萃取(HS-SPME)和浸入固相微萃取(DI-SPME)三种不同萃取方式的定量方法比较，其中固相微萃取方式选取DVB/CAR/PDMS作为萃取头。
用已优化的萃取条件对上述四种白酒进行萃取，SPME无论是顶空(HS)或者浸入(DI)的萃取方式对于白酒中挥发性苯酚类化合物的萃取效果都比SBSE好很多。相对而言，浸入(DI)的萃取方式更好一些，且它对内标化合物(3，4DMP)的萃取效果更稳定，见图1。
实施例2方法的评价 以3，4-二甲基苯酚为内标，7种挥发性苯酚类化合物的线性相关系数R2的变化范围在0.9922(4-甲基愈创木酚)到0.9998(4-甲基苯酚)之间，所得标准曲线的线性良好，见图2。同时标准曲线的线性范围包含了白酒中苯酚类化合物的浓度范围。7种苯酚类化合物检测限均小于7μg/L，其中4-丙基愈创木酚检测限为59.75ng/L。该方法的整体精确度较好，相对标准偏差均在15％以内，能够满足分析的要求。
本发明做了回收率的测定，结果表明该方法回收率均在85％-115％之间，见表1。
表1各酒样及模拟酒中苯酚类化合物回收率及精密度(n＝3)计算
N.D.未检测到。
实施例3实际酒样的测定 本发明选取了浓香型白酒，兼香型白酒，酱香型白酒，其它香型白酒和清香型白酒为目标酒样，将五种白酒稀释到5-20％(v/v)，加入10μg内标，按上述方法测定其中苯酚类化合物含量。表2列出了所测酒样中苯酚类化合物的含量，图3为其它香型白酒酒样的GC-MS总离子流色谱图。
表2不同白酒中各种挥发性苯酚类化合物的含量
N.D.未检测到；T.r.浓度低于标准曲线下限。
权利要求
1.一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，其特征是先用煮沸后冷却的去离子水将待测酒样稀释到最终酒精含量为5％-20％vol，然后用浸入固相微萃取技术富集白酒中苯酚类化合物，再用气相色谱-质谱联用技术对白酒中苯酚类化合物进行定性定量分析；待测的7种苯酚类化合物为4-甲基苯酚，4-乙基苯酚，苯酚，4-甲基愈创木酚，4-乙基愈创木酚，4-丙基愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚；测定步骤为
(1)浸入固相微萃取吸取17mL稀释后的酒样，加入10μL内标溶液，置于20mL小瓶中，并加入5g NaCl，旋紧瓶盖，插入50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头，50℃预热5min，萃取吸附45min；
内标溶液配制以3，4-二甲基苯酚为内标，溶于色谱级乙醇中，浓度为50mg/L；
(2)气相色谱-质谱联用萃取结束后将萃取头插入到联有质谱检测器的气相色谱的进样口，250℃热解吸5min，色谱柱采用DB-Wax，60m×0.25mm i.d.×0.25μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速2mL/min；不分流；检测时的升温程序为50℃恒温2min，以4℃/min的速度升温至230℃，保持15min；MS条件EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35-350amu，得到被测白酒酒样的总离子流图谱；
(3)未知挥发性苯酚类化合物的定性分析通过比对未知化合物和7种苯酚类化合物的标准品的保留时间，以及离子图谱来确认检测出的苯酚类化合物；
(4)对已确认的挥发性苯酚类化合物进行定量分析以该种已确认的挥发性苯酚类化合物标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，该种已确认的挥发性苯酚类化合物标准品与内标物浓度之比为纵坐标，建立标准曲线，通过标准曲线法来定量；
原混合标准溶液的配制分别准确称取0.1g的7种苯酚类化合物的标准品，各自分别溶于10mL色谱级乙醇中，作为单标储备液，将7种苯酚类化合物的单标储备液各吸取5-500μL放入容量瓶中，用5％-20％vol乙醇溶液定容至50mL，作为原混合标准溶液；
标准曲线的建立制作标准曲线所用的一系列浓度是用5％-20％vol的乙醇溶液逐步稀释原混合标准溶液而得，共得到12个浓度梯度的混合标准溶液，对各浓度梯度准确吸取17mL配制好的混合标准溶液于20mL小瓶中，加入10μL内标溶液，用氯化钠饱和，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行浸入固相微萃取，以7种苯酚类化合物的标准品与内标物特征离子峰的峰面积之比为横坐标，7种苯酚类化合物的标准品与内标物浓度之比为纵坐标绘制标准曲线；
酒样测定将目标酒样稀释到5％-20％vol，加入10μL内标，运用浸入固相微萃取，气相色谱-质谱联用仪进行定性定量分析，比照标准曲线测定被测酒样中挥发性苯酚类化合物含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是7种挥发性苯酚类化合物的定量，以3，4-二甲基苯酚为内标，在5μg/L-500μg/L或10μg/L-1000μg/L检测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R2均大于0.99。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是7种挥发性苯酚类化合物的检测限均小于7μg/L，酒样3次重复测定的相对标准偏差小于15％，7种苯酚类化合物的回收率为85％-115％。
全文摘要
一种测定白酒中挥发性苯酚类化合物的方法，属于白酒风味研究领域。本发明应用浸入固相微萃取(DI-SPME)与气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对白酒中挥发性苯酚类化合物进行定性定量分析。本发明建立的方法能够快速检测并准确定量白酒中挥发性苯酚类化合物，使用浸入固相微萃取无需繁琐的预处理过程，快速简单；用气相色谱-质谱联用技术检测白酒中挥发性苯酚类化合物，提高了结果的准确性。7种苯酚类化合物在所测范围内具有良好的线性关系R2＞0.99，7种苯酚类化合物的检测限均小于7μg/L，相对标准偏差小于15％，回收率为85％-115％。本发明为进一步研究挥发性苯酚类化合物的形成机理提供了基础，对提高白酒品质有着重要意义。
文档编号G01N30/72GK101762664SQ20101001815
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者徐岩, 范文来, 朱燕 申请人:江南大学