专利名称：偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物的体内含量测定方法，属于生物技术领域。
背景技术：
中国专利85108520公开了两种偏诺皂苷类化合物在妇科血症方面的应用。但是一个突出的问题是偏诺皂苷类化合物服用剂量很小，体内含量无法直接用普通的——尽管是高灵敏的方法，如高效液相、气相方法等测定。因此偏诺皂苷类化合物的吸收、代谢和动力学特征从未被研究和报道。在已有的研究中，我们证实偏诺皂苷类化合物是以原形在动物体内发挥药理作用。由于其服用剂量极小，体内含量极低，迫切需要一种能快速、简单、干扰小，并且能用于人体的体内含量测定方法。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可以用于偏诺皂苷类化合物各种剂型的生物利用度的测定及偏诺皂苷类化合物体内代谢时间测定的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法。
本发明所述的体内含量测定方法可分为半定量和定量测定，其方法分别如下本发明所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法由以下步骤组成一、收集给药前试验动物的生物样本，作为对照组；二、将偏诺皂苷类化合物给予人或试验动物，剂量为0.005-100mg/kg动物体重，再收集上述试验动物的生物样本，作为试验组；三、分别固相萃取或液相萃取处理步骤一、二所得样本；四、将步骤三所得样本逐一进行液相色谱分离；五、紧接步骤四进行质谱检测。
本发明所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法由以下步骤组成一、收集给药前试验动物的生物样本，作为对照组；二、将偏诺皂苷类化合物给予人或试验动物，剂量为0.005-100mg/kg动物体重，再收集上述试验动物的生物样本，作为试验组；
三、分别固相萃取或液相萃取处理步骤一、二所得样本；四、配制已知分子量的内标物质0.01-0.001mg/mL的溶液，且该溶与步骤三所得样本相混溶；五、精密称取偏诺皂苷类化合物配成0.1-5mg/mL的溶液做为储备液，再进一步配成1-100ng/mL的标准溶液；六、绘制工作曲线分别精密吸取步骤五所得标准溶液0.1μL至200μL若干个梯度以及1-10μL内标液于试管底部，惰性气体吹干后分别加入步骤一所得生物样本0.1-10ml，按步骤三所述样品处理方法与步骤二所得样本做平行处理；以偏诺皂苷类化合物的峰面积与内标峰面积之比对生物样本中偏诺皂苷类化合物浓度进行线性回归，得到回归方程；七、步骤三所得样本分别加入含已知分子量的内标物质0.01-0.001mg/mL的溶液1-10μL，使步骤二所得样品中内标浓度在1-20ng/mL；八、将步骤七所得样本逐一进行液相色谱分离；九、紧接步骤八进行质谱检测；十、以偏诺皂苷类化合物的峰面积与内标峰面积之比代入工作曲线中求出偏诺皂苷类化合物的含量。
本发明所述的偏诺皂苷(pennogenin)类化合物，结构通式为 通式中R2＝H，CH3，CH2OH，＝CH2X＝O，N，SC17位为R-构型或S-构型R1＝由单糖、双糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所组成的各种型式的直链糖链或支链糖链，其糖链组成糖的类型包括β-D-葡萄糖(β-D-glucose)、α-D-葡萄糖(α-D-glucose)、α-L-鼠李糖(α-L-rhamnose)、β-D-半乳糖(β-D-galactose)、α-D-半乳糖(α-D-galactose)、β-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、β-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、α-D-木糖(α-D-xylose)、β-D-木糖(α-D-xylose)、α-D-核糖(α-D-ribose)、β-D-核糖(β-D-ribose)、α-D-来苏糖(α-D-lyxose)、β-D-来苏糖(β-D-lyxose)、α-L-夫糖(α-L-fucose)。
所述的偏诺皂苷类化合物位于甾体骨架第3位的糖不可缺少，并且不限于七糖。
包括4个活性较强的偏诺皂苷类化合物X＝O，R2＝H，[I]R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→4)-α-L-rha·py(1→4)-[α-L-rha-py(1→2)]-β-D-glc·py[II]R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→2)-[α-L-rha·py(1→4)]-β-D-glc·py[III]R1＝-3-O-α-L-ara·fura-(1→4)-[α-L-rha·py(1→2)]-β-D-glc·py[IV]R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→2)-β-D-glc·py。
所述的固相萃取方法为采用市售的固相萃取柱，其填料可为C18、C8、CN和苯基等键合相硅胶或大孔树脂等吸附性材料，其装量规格可为0.01-1克，按固相萃取柱使用说明书方法对柱子进行活化，通常可用甲醇、水各1mL过柱活化，然后(A)取1mL液体的生物样本，如血浆、血清、尿、胆汁、脏器匀浆过滤液等等，上柱，(B)再用1mL甲醇洗脱1-4次，收集甲醇洗脱液，(C)于40℃水浴中用氮气流吹干，残渣加100-1000μL甲醇溶解，得到待测样品。
所述的液相萃取方法为(A)在生物样本血浆、血清、尿样、胆汁、干燥粪便、脏器匀浆中加入浓度为70％以上的含碳数在6及6以下的低级醇2-5倍于样品体积，浸泡提取，离心得到沉淀，再用相同的醇2-5倍重量重复提取沉淀1-4次，合并醇溶液，60℃以下减压浓缩得粗浸膏；B、加适量水使粗浸膏溶解，加氯仿10-300倍重量于粗浸膏萃取，共1-5次，各次氯仿层洗脱液用1/10体积水洗一次，合并氯仿萃取层，减压回收溶剂，得浓缩浸膏，供检测用。
上述处理方法中可加入含内标物质0.01-0.001mg/mL的相混溶的溶液5-10μL，使待测样品中内标浓度在1-20ng/mL，内标物质可以为维拉帕米[MW＝455.2904]，溶剂为甲醇。内标的作用为校正分子量及含量测定参比。内标还可以为其它分子量已知的且大小适中的物质。
(1)、色谱分离条件反相色谱柱，如C18、C8、CN等硅胶键合相色谱柱。
(2)、流动相∶甲醇-水(60-95∶5-40)固定比例或梯度洗脱；流速0.2-2mL/min，柱温10-42℃。
(3)质谱仪条件电喷雾离子化接口飞行时间质谱检测器，质谱工作站；正离子检测，喷嘴电压5000-6000V，喷管电压300-400V，检测电压1500-2500V，喷管温度110-170℃，采样范围(m/z)10-1000；离子选择通道为[M+Na]+、[M+K]+，M表示偏诺皂苷类化合物，[M+Na]+为主峰，离子通道范围可为±0.5amu。
本发明所述的方法对人体无害，可以应用于人体和各种实验动物。
本发明可以用于偏诺皂苷类化合物各种剂型的生物利用度的测定。
本发明可以用于偏诺皂苷类化合物体内代谢时间测定。
本方法的检测限可以达到0.2ng/mL，线性范围2-3个数量级，相关系数r在0.99以上，日内及日间精密度小于15％，绝对回收率在80％以上，相对回收率92％-115％。
本发明的优点在于(1)灵敏度高，样本处理过程即是一浓缩过程，其检测器为质谱检测器，远高于一般液相和气相的紫外检测器，检测限可以达到0.2ng/mL；(2)选择性好，抗干扰性强，生物样本由于有各种有机杂质，极难分离，采用质谱选择性离子检测方式，以[M+Na]+和[M+K]+两个峰为离子选择通道，有效排除干扰；(3)样品处理简单；(4)检测时间短，仅为十几分钟，适用于大批量检测；(5)对人体无害，放射法由于引入放射性元素，虽然灵敏度很高，用于人体却受到限制。本发明方法尤其适合做偏诺皂苷类化合物各种剂型的生物利用度测定。
具体实施例方式
1、偏诺皂苷类化合物生物利用度的测定从志愿者身上取血将，测定血浆中偏诺皂苷化合物IV的含量，计算药-时曲线下面积AUC，与等量偏诺皂苷肌注产生的药-时曲线下面积AUC相比，计算相对生物利用度(％)。未处理过的偏诺皂苷、偏诺皂苷各种制剂的生物利用度的比较液相色谱条件Waters 2690 HPLC(美国Waters公司)，含四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱，碳-18反相色谱柱KromasilC18(5μm，4.6×250mm)。流动相∶甲醇-水(80∶20)、(90∶10)、(85∶15)梯度洗脱；流速0.8mL/min，柱温30℃。二极管阵列检测器，检测波长203nm。
质谱仪条件MarinerTM5410质谱仪(美国Applied Biosystem公司)，电喷雾离子化接口飞行时间质谱检测器，质谱工作站MarinerTM工作站4.0版。质谱仪参数正离子检测，喷嘴电压5500V，喷管电压340V，检测电压2200V，喷管温度140℃，采样范围(m/z)10-1000。
离子选择通道为[M+Na]+、[M+K]+，M表示偏诺皂苷类化合物，[M+Na]+为主峰，离子通道范围可为±0.5amu，即761.4，777.4。
内标取适量维拉帕米用甲醇溶解并稀释至0.2mg/mL作为储备液，用前再稀释至0.01mg/mL。
标准物质精密称取偏诺皂苷类化合物IV配成1mg/mL的甲醇溶液做为储备液，再进一步配成10ng/mL。
工作曲线分别精密吸取上述10ng/mL标准物质0.3μL、0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL以及5μL内标液于具塞尖底试管中，氮气吹干后各加入生物样本血浆1.0ml，按上文所述样品处理方法采用固相萃取法处理；以偏诺皂苷类化合物的峰面积与内标峰面积之比对生物样本中偏诺皂苷类化合物浓度进行线性回归。
精密度和回收率分别取0.3μL、1μL、5μL、20μL及5μL内标液于具塞尖底试管中，氮气吹干后各加入生物样本血浆1.0ml，按上文所述样品处理方法采用固相萃取法处理；各浓度日内重复处理测定6次得日内精密度，连续处理测定三天得日间精密度。将偏诺皂苷类化合物峰面积与内标峰面积之比代入线性回归方程，计算相对回收率。另将偏诺皂苷类化合物标准品配成相应浓度的甲醇溶液，直接进样，以此为标准，将两组峰面积与内标峰面积之比进行比较，计算绝对回收率。
结果本方法检测速度快，只需15分钟就可完成一次检测。
表1偏诺皂苷类化合物生物利用度的测定

同法也可测量其它制剂在人或动物身上的生物利用度。
实施例2偏诺皂苷类化合物代谢时间研究口服给药后，每四小时取血浆一次，固相萃取法萃取，LC-MS法分析。结果如下

给药后第4、8小时可明显检出偏诺皂苷化合物IV[M+Na]+质谱峰(m/z761.4)，给药后第24小时，原形药浓度极低，已接近检测下限，再次富集一倍后才能检出质谱峰。血浆中再次富集后也未能检出PS-M1与PS-M2代谢产物的质谱峰。
结果显示，偏诺皂苷化合物达峰时间长，一般药物给药后1-2小时即达峰值，偏诺皂苷化合物需要8小时左右，说明其生物吸收不佳，生物利用度低；而且半衰期较短，达峰后当日即已基本排泄完毕。
权利要求
1.一种偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于由以下步骤组成一、收集给药前试验动物的生物样本，作为对照组；二、将偏诺皂苷类化合物给予人或试验动物，剂量为0.005-100mg/kg动物体重，再收集上述试验动物的生物样本，作为试验组；三、分别固相萃取或液相萃取处理步骤一、二所得样本；四、将步骤三所得样本逐一进行液相色谱分离；五、紧接步骤四进行质谱检测。
2.一种偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于由以下步骤组成一、收集给药前试验动物的生物样本，作为对照组；二、将偏诺皂苷类化合物给予人或试验动物，剂量为0.005-100mg/kg动物体重，再收集上述试验动物的生物样本，作为试验组；三、分别固相萃取或液相萃取处理步骤一、二所得样本；四、配制已知分子量的内标物质0.01-0.001mg/mL的溶液，且该溶与步骤三所得样本相混溶；五、精密称取偏诺皂苷类化合物配成0.1-5mg/mL的溶液做为储备液，再进一步配成1-100ng/mL的标准溶液；六、绘制工作曲线分别精密吸取步骤五所得标准溶液0.1μL至200μL若干个梯度以及1-10μL内标液于试管底部，惰性气体吹干后分别加入步骤一所得生物样本0.1-10ml，按步骤三所述样品处理方法与步骤二所得样本做平行处理；以偏诺皂苷类化合物的峰面积与内标峰面积之比对生物样本中偏诺皂苷类化合物浓度进行线性回归，得到回归方程；七、步骤三所得样本分别加入含已知分子量的内标物质0.01-0.001mg/mL的溶液1-10μL，使步骤二所得样品中内标浓度在1-20ng/mL；八、将步骤七所得样本逐一进行液相色谱分离；九、紧接步骤八进行质谱检测；十、以偏诺皂苷类化合物的峰面积与内标峰面积之比代入工作曲线中求出偏诺皂苷类化合物的含量。
3.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的偏诺皂苷类化合物结构通式为 通式中R2＝H，CH3，CH2OH，＝CH2X＝O，N，SC17位为R-构型或S-构型R1＝由单糖、双糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所组成的各种型式的直链糖链或支链糖链，其糖链组成糖的类型包括β-D-葡萄糖(β-D-glucose)、α-D-葡萄糖(α-D-glucose)、α-L-鼠李糖(α-L-rhamnose)、β-D-半乳糖(β-D-galactose)、α-D-半乳糖(α-D-galactose)、β-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-甘露糖(β-D-mannose)、α-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、β-D-阿拉伯糖(α-D-aradinose)、α-D-木糖(α-D-xylose)、β-D-木糖(α-D-xylose)、α-D-核糖(α-D-ribose)、β-D-核糖(β-D-ribose)、α-D-来苏糖(α-D-lyxose)、β-D-来苏糖(β-D-lyxose)、α-L-夫糖(α-L-fucose)。
4.按照权利要求3所述的偏诺皂苷类化合物，其特征在于所述的通式中X＝O，R2＝H，R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→4)-α-L-rha·py(1→4)-[α-L-rha-py(1→2)]-β-D-glc·py。
5.按照权利要求3所述的偏诺皂苷类化合物，其特征在于所述的通式中X＝O，R2＝H，R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→2)-[α-L-rha·py(1→4)]-β-D-glc·py。
6.按照权利要求3所述的偏诺皂苷类化合物，其特征在于所述的通式中X＝O，R2＝H，R1＝-3-O-α-L-ara·fura-(1→4)-[α-L-rha·py(1→2)]-β-D-glc·py。
7.按照权利要求3所述的偏诺皂苷类化合物，其特征在于所述的通式中X＝O，R2＝H，R1＝-3-O-α-L-rha·py(1→2)-β-D-glc·py。
8.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的固相萃取中所用的萃取材料其填料为C18、C8、CN和苯基等键合相硅胶或大孔树脂等吸附性材料，其装量规格为0.01-10克。
9.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的固相萃取步骤为固相萃取柱活化后(A)取1mL液体的生物样本上柱，(B)再用1mL甲醇洗脱1-4次，收集甲醇洗脱液，(C)于40℃水溶中用氮气流吹干，残渣加100-1000μL甲醇溶解。
10.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的液相萃取步骤为A在生物样本中加入浓度为70％以上的含碳数在6及6以下的低级醇2-5倍于样品体积，浸泡提取，离心得到沉淀，再用相同的醇2-5倍重量重复提取沉淀1-4次，合并醇溶液，60℃以下减压浓缩得粗浸膏；B、加适量水使粗浸膏溶解，加氯仿10-300倍重量于粗浸膏萃取，共1-5次，各次氯仿层洗脱液用1/10体积水洗一次，合并氯仿萃取层，减压回收溶剂，得浓缩浸膏。
11.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的色谱分离过程中使用反相色谱柱。
12.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的色谱分离过程中使用的流动相是甲醇-水(60-95∶5-40)按固定比例或梯度洗脱。
13.按照权利要求1、2所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法，其特征在于所述的质谱检测过程中离子选择通道为[M+Na]+、[M+K]+，M为偏诺皂苷类化合物，离子通道范围为±0.5amu。
14.权利要求1、2所述含量测定方法可以用于偏诺皂苷类化合物各种剂型的生物利用度的测定。
15.权利要求1、2所述含量测定方法可以用于偏诺皂苷类化合物体内代谢时间测定。
全文摘要
本发明涉及一种化合物的体内含量测定方法，属于生物技术领域。本发明所述的偏诺皂苷类化合物的体内含量测定方法由以下步骤组成1.收集给药前试验动物的生物样本，作为对照组；2.将偏诺皂苷类化合物给予人或试验动物，剂量为0.005－100mg/kg动物体重，再收集上述试验动物的生物样本，作为试验组；3.分别固相萃取或液相萃取处理步骤一、二所得样本；4.将步骤三所得样本逐一进行液相色谱分离；5.紧接步骤四进行质谱检测。本发明可以用于偏诺皂苷类化合物各种剂型的生物利用度的测定。本发明可以用于偏诺皂苷类化合物体内代谢时间测定。
文档编号G01N30/06GK1940551SQ20051001104
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者唐书明, 冯有, 高崇昆 申请人:云南白药集团股份有限公司