专利名称：检测样品微阵列中的分析物的方法和实施所述方法的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉 及检测样品中目标分析物的方法和实施该方法的装置。
背景技术：
有各种各样的技术，其寻求提供检测样品中生物分析物的方法。例如，美国专利号6，361，944、美国专利号6，506，564、美国专利号6，750，016和美国专利号6，767，702 公开了通过观察寡核苷酸与核酸杂交时的颜色改变来检测核酸的方法。Yguerabide等人(Journal of Cellular Biochemistry Supplement (细胞生物化学杂志 ±曾干Ij ) 37 71-81(2001))公开了共振光散射(RLS)颗粒作为标记物用于分析物检测的应用。Foultier 等人(IEEProc. -Nanobiotechnol (电气工程师学会学报-纳米生物技术)，第152卷，第1 号，2005年2月)公开了荧光标记技术在视觉检测样品中目标分析物的存在或不存在中的应用。尽管可获得这些不同的方法，已经发现通过光学手段检测生物分析物往往是不令人满意的。本发明旨在向公众提供解决这种问题的改进的方法，或至少一种备选方法。发明概述根据本发明的第一方面，提供了一种使用电磁波或单色光检测样品中目标分析物的方法，包括(a)通过至少一种电磁波或单色光照射样品组，该样品组包括潜在含有该目标分析物的多个样品，(b)检测在被该电磁波或单色光或每种电磁波或单色光照射时由该样品组反射、吸收或发出的电磁波的强度，(c)记录与由该样品组反射、吸收或发出的光强度相关的一个或多个数值组，其中该数值组或该数值组中的每一组与由该样品组反射、吸收或发出的每种各自的电磁波或单色光相关，(d)比较与该电磁波或单色光或每种电磁波或单色光相关的一个或多个数值组，(e)选择具有较高信号的数值组或数值组之一，和(f) 基于从步骤(d)中选择的数值组确定目标分析物的存在或不存在。当使用电磁波或单色光照射时，目标分析物可以产生可检测的电磁信号。该样品可以使用含有信号增强剂的标记物进行预处理以增强反射、吸收或发出的电磁波的强度。通过比较一个或多个数值组，可使用最佳指示该目标分析物的存在或不存在的数值组。在一个实施方案中，在上述步骤(a)中，样品组可通过至少两种电磁波或单色光进行相继照射。优选地，该信号增强剂可以是纳米_尺寸的颗粒。更特别地，该纳米_尺寸的颗粒可以是金属颗粒、纳米_金颗粒或纳米_银颗粒。该纳米_尺寸的颗粒可通过分子结合与目标分析物联合。该方法可用于检测生物学样品中存在的目标分析物；该目标分析物可以是DNA或肽分子。优选地，该单色光可具有380nm至750nm的频率。在一个实施方案中，该单色光之一是蓝色单色光，或具有范围在IOnm至IOOOnm的波长的电磁波或单色光或电磁波或单色光之一。在其他实施方案中，该单色光或单色光之一可以是紫光、蓝光、绿光、黄光、橙光或红光。还在其他实施方案中，该电磁波或该电磁波之一可以是紫外线或红外线，或可具有IOnm 至 380nm(紫外线)、380nm 至 450nm (紫光)、450nm 至 495歷(蓝光)、495nm 至 57Onm (绿光)、57Onm 至 59Onm (黄光)、59Onm 至 62Onm (橙光)、62Onm 至 75Onm (红光)或 75Onm 至 IOOOnm(红外线)的波长。所选的该单色光可具有跨越这些范围中的两个的波长。在一个实施方案中，在确定目标分析物存在或不存在之前，数值组之间相互比较。 然而，数值组可以以这种方式与预定的参比值相比较，即如果一个或多个数值组与参比值相比较具有更高的值，那么该比较将导致确定目标分析物存在，反之亦然。在备选的实施方案中，数值组与照射一组用作阳性对照的样品获得的数值组相比较。如果该数值组或该多个数值组与来自阳性对照的数值组是相当的，那么该比较将导致确定目标分析物存在。或者如果该数值组或该多个数值组与来自作为阴性对照的数值组是相当的，那么该比较将导致确定目标分析物不存在。根据本发明的第二方面，提供了一种用于检测在样品微阵列中含有纳米-尺寸的金-和/或银-的检测标记物的方法，其中所述标记物指示样品中目标分析物的存在或不存在，所述方法包括(a)使用至少两种不同的电磁波或单色光相继照射至少两个样品组， 该电磁波或单色光具有IOnm至IOOOOnm的波长，该样品组包括包含至少一个潜在含有目标分析物的样品的第一样品组，和用作阳性对照或阴性对照的第二样品组，(b)检测在使用每种电磁波或单色光照射时由每组所述样品组反射、吸收或发出的光的强度，(c)记录与由该样品组反射、吸收或发出的光强度相关的数值组，其中每个数值组对每组样品组而言与每种单色光相关，(d)比较与所述样品组和每种所述单色光相关的数值组；和(e)基于步骤 (d)中的比较确定目标分析物的存在或不存在，其中所述单色光包括至少一种电磁波或单色光，该电磁波或单色光具有范围在IOnm至IOOOnm的波长。通过比较，可使用最佳指示该目标分析物的存在或不存在的数值组。在一个实施方案中，至少两个样品组可使用所述单色光之一进行同时照射。优选地，该样品组可包括包含至少一个潜在含有目标分析物的样品的第一样品组，用作阳性对照的第二样品组，和用作阴性对照的第三样品组。通过两个比较，确定目标分析物的存在或不存在的可靠性将得到增强。在一个具体实施方案中，虽然可使用任何合适的图像捕获手段，但是由样品组反射、吸收或发出的光可通过CDC照相机进行检测。在一个实施方案中，在步骤(C)之后，提供了对每个样品组中样品的光强度取平均值和产生与每种单色光相关的至少两个平均值的步骤，其中一个平均值与潜在含有分析物的样品组相关，另一个平均值或其它平均值之一与用作阳性对照或阴性对照的样品组相关。平均值的使用是有优势的，因为出于比较的目的它可提供更多有代表性的数字并且也可更方便地进行比较。更特别地，可以提供对与潜在含有分析物的样品组和用作阳性对照或阴性对照的样品组相关的多个平均值的绝对值取差值的步骤，因此产生至少两种差值， 其中每种差值与各自的单色光相关。在产生至少两种差值后，提供将该差值与预定的差值比较的步骤。在另一个实施方案中，可以提供产生绝对值的至少两种差值的步骤，其中该差值之一与潜在含有分析物的样品组和用作阳性对照的样品组相关的平均值的比较相关，并且另一个平均值或另一些平均值之一与潜在含有分析物的样品组和用作阴性对照的样品组相关的平均值的比较相关。通过这个步骤，可以提供产生绝对值的至少四种差值的步骤，该四种差值中的两种与通过该单色光之一照射样品组相关的值相关，而其他两种与通过其它单色光之一照射样品组相关的值相关。然后，可以提供在确定样品中目标分析物的存在或不存在时，确定使用所述至少四种差值中的哪两种或至少哪两种的步骤。 根据本发明的第三方面，提供了检测样品微阵列中的含有纳米_尺寸的金-和/ 或银-的检测标记物的方法，该标记指示样品中目标分析物的存在或不存在，所述方法包括(a)使用至少两种不同的预定单色光相继照射至少两个样品组，该单色光具有不同的频率，该样品组包括包含至少一个潜在含有目标分析物的样品的第一样品组，和用作阳性对照或阴性对照的第二样品组，(b)检测在使用每种电磁波或单色光照射时由每组样品组反射、吸收或发出的光的强度，(c)记录与由该样品组反射、吸收或发出的光强度相关的数值组，其中每个数值组对每组样品组而言与每种单色光相关，(d)比较与所述样品组和每种所述单色光相关的数值组，(e)在步骤(d)之后产生差值数据，(f)选择具有最高值的差值数据，和(g)基于来自步骤(e)的具有最高值的差值数据确定目标分析物的存在或不存在。在一个实施方案中，可通过具有IOnm至IOOOnm的波长的电磁波或单色光之一同时照射至少两个样品组。在另一个实施方案中，该样品组可包括(a)包含至少一个潜在含有目标分析物的样品的第一样品组，(b)用作阳性对照的第二样品组和(c)用作阴性对照的第三样品组。由该样品组反射、吸收或发出的光可通过CDC照相机或任何合适图像捕获手段进行检测。在另一个实施方案中，在步骤(C)之后，提供了对每个样品组中样品的光强度取平均值和产生与每种电磁波或单色光相关的至少两个平均值的步骤，其中一个平均值与潜在含有分析物的样品组相关，另一个平均值或其它平均值之一与用作阳性对照或阴性对照的样品组相关。可以提供对与潜在含有分析物的样品组和用作阳性对照或阴性对照的样品组相关的多个平均值的绝对值取差值的步骤，因此产生至少两种差值，其中每种差值与各自的单色光相关。也可以提供比较所述差值和预定的差值的步骤。在另一个实施方案中，提供了产生绝对值的至少两种差值的步骤，其中该差值之一与潜在含有分析物的样品组和用作阳性对照的样品组相关的平均值的比较相关，并且另一种差值或另一些差值之一与潜在含有分析物的样品组和用作阴性对照的样品组相关的平均值的比较相关。然后可以存在产生绝对值的至少四种差值的步骤，该四种差值中的两种与使用该单色光之一照射样品组相关的值相关，且其他差值中的两种与使用其它单色光之一照射样品组相关的值相关。可以存在在确定样品中目标分析物的存在或不存在时，确定使用所述至少四种差值中的哪两种或至少哪两种的步骤。在优选的实施方案中，样品组可包括以微阵列格式排列的许多样品。


现通过引用附图仅通过示例性方式描述本发明，其中_图1是样品微阵列的图示；图2a和图2b是在一些条件下样品微阵列的照片；图3a和图3b是在一定条件下与图2a和图2b中的相同的样品微阵列的照片；
图4a和图4b是在一些条件下与图2a和图2b中的相同的样品微阵列的照片；
图5a和图5b是在一些条件下与图2a和图2b中的相同的样品微阵列的照片；图6a至6e是在一段时间内所拍摄的样品微阵列的照片；图6f是一张表格，用作微阵列中样品的定位的图例；图7包括图像的信息和一张表格，该表格表明了当通过不同颜色的光或不同频率的光对微阵列进行照射时的差别；和图8至11中的每个图与图7是类似的，除了该信息涉及当微阵列中的反应在一段时间内持续时在不同时间照射的微阵列。为了更好地说明，还附上一套彩色的图1至11。本发明优选实施方案的详细描述已知在某种情况下检测一些生物学样品是很难的。例如，当目标生物学样品的浓度非常低时，能够可靠地检测目标样品是尤其困难的。Yguerabide等人(Journal of Cellular Biochemistry Supplement (细胞生物化学杂志增刊)37 :71_81 (2001))提出使用共振光散射粒子作为超灵敏标记物用于检测生物物质。美国专利号6，767，702提出了一种检测核酸的方法。Foultier等人(IEE Proc. -Nanotechnology.(电气工程师学会学报_纳米生物技术)，第152卷，第1号，2005年2月)比较了使用纳米颗粒和银增强作用来检测DNA的不同方法。(这些文献内容的全文通过引用并入本申请中)。尽管可得到这些不同的方法，但是还没有一种方法可普遍地能够用来有效地和可靠地检测各种各样的生物学样品。本发明试图提供一种新的和用户友好的检测生物学物质的方式。本发明现在将通过下列的非限制性的实施例和实验进行描述。通过介绍的方式，注意到本发明的实质不是关于待检测样品的类型，而是关于检测的方法。只要有关的样品是通过或可通过信号增强剂标记的，那么它可以是根据本发明检测的对象。由此可见目标样品可以是DNA分子、肽分子或任何有机分子或无机分子，其可通过信号增强剂，例如纳米_尺寸的颗粒、纳米_金颗粒或纳米_银颗粒标记。该信号增强剂优选是纳米_尺寸的颗粒。纳米_尺寸的颗粒意指颗粒具有ΙΟ—9 级别的尺寸。实验1在这个实验中，目标分析物是乙型肝炎病毒且信号增强剂是纳米-尺寸的金颗粒。将使用纳米-尺寸的金颗粒标记的乙型肝炎病毒(HBV)探针用作阳性对照。特别地， 看图1，显示了芯片薄片上的样品微阵列的示意图。芯片薄片根据图1所示的模式进行点样。特别地，将芯片薄片划分为六个区域，即区域A至F。区域A、D和E是暗区且这些区域代表了具有乙型肝炎病毒探针的阳性对照的区域，该探针已通过信号增强剂标记。浅灰色区即区域F用非特异的目标物进行加样，其用作阴性对照。白区即区域B和C并不含有任何点样的样品，它们用作阴性对照。通过这种配置，阳性结果或较深的颜色应在用HBV探针进行点样的区域中观察到，而阴性结果或最少的颜色应在其它区域中观察到。第一个实验的下一步是通过着眼于有效地和精确地确定HBV探针的存在或不存在，来确定任何研究HBV探针的存在的方法是否是有优势的。图2a和图2b是分别通过CDC 照相机和B/W CDC照相机拍摄的图像，该图像是当与如上 所述的相同的样品微阵列通过具有450nm至495nm波长的蓝色光源进行照射时拍摄的。图3a和3b、图4a和4b、图5a和5b 与图2a和2b是类似的，虽然不同的是图像是在芯片薄片上的样品微阵列分别通过白光、具有495nm至570nm波长的绿光和具有620至750nm波长的红光的光源进行照射时拍摄的。
首先看图4a至4b，虽然区域A、D和E确实含有HBV探针并且应当产生具有明显的阳性结果的图像，但是如可以由该附图中所见地，该图像并不明显。特别地，区域A、D和 E和区域B、C和F之间的反差并不高。因此，这意味着当通过绿光照射样品微阵列时，尽管 HBV探针(或可能含有HBV的真正样品，或任何其它可以含有目标分析物或生物制品的样品)实际存在，但很难可靠地得出是否真正的存在所述目标样品的结论。换言之，对该特定样品微阵列使用绿颜色并不是特别地可靠。 看图5a至5b，同样地，区域A、D和E确实含有HBV探针并应当产生明显的阳性结果。显示出和区域B、C、F相比，区域A、D和E确实显示相对更高反差的红点(当和图4a和 4b的相应反差进行比较时)。这意味着检测HBV探针的存在使用红光比使用绿光是具有相对优势的。看图3a和3b，同样地，区域A、D和E确实含有HBV探针并应当产生明显的阳性结果。显示出和区域B、C、F相比，区域A、D和E确实显示相对更高反差的紫色的点(当和图 4a和4b的相应的反差进行比较时，及当与图5a和5b进行比较时和区域B、C、F相比具有类似的相应反差)。这意味着当与使用红光进行比较时，使用白光检测HBV探针的存在是相似地有效的，但比使用绿光是更有效和有优势的。看图2a和2b，同样地，区域A、D和E确实含有HBV探针并应当产生明显的阳性结果。显示出和区域B、C和F相比，区域A、D和E确实显示最高反差的明显的蓝色的点(当比较图3a和3b、图4a和4b和图5a和5b的每个图的区域A、D和E和区域B、C、F之间的相应的反差比较时)。这表明在通过蓝光、白光、绿光和红光照射标记有增强剂的HBV样品之中，使用蓝光来检测HBV探针的存在是最有效的。实验2图6a至11显示了与图1至5b中所示的和如上所述的类似的实验数据和结果。特别地，使用了芯片薄片并将其类似地划分为六个区域，即区域A至F，其中样品包括加载到其中的目标分析物、阳性对照和/或阴性对照。区域A和D加载特异性探针。区域E和F 加载特异性探针但分别稀释100倍和10倍。区域C加载非特异性探针且区域B仅加载缓冲液。图例见图6f。所述特异性探针与HBV探针类似。然而，与显示于图1至5b的实验相比较，在本实验中有许多差异。第一，允许反应在芯片薄片上进行，并且当反应已经进行少于6分钟(见图6a)、约6分钟(见图6b)、在约10分钟(见图6c)、在约14分钟(见图 6d)和超过14分钟(见图6e)时，拍摄芯片薄片的图像。原则上，随着反应进行，将有一个时间范围，在该时间范围中分析物的存在的检测和指示是特别明显的。在这个特别的实验中，芯片薄片在不同的时间通过白光进行照射然后通过图像捕获手段捕获相应的图像。该白色单色光是具有可见光范围内的波长的单色光的组合。除了在特定时间(例如图6a至6f中所示的少于6分钟)通过特定的光或单色光 (例如如图6a至6f中所示的白色单色光)照射薄片芯片外，芯片薄片还通过其它单色光进行相继照射，并且捕获相应的芯片薄片图像。图7说明其它单色光包括红外单色光、红色单色光、橙色单色光、黄色单色光、绿色单色光和蓝色单色光，它们的波长已在上面提到。图7 还总结了数值数据，该数据反映由芯片薄片上的样品反射或发出的电磁波或光的强度。特别地，还可检测电磁波或光的吸收水平。因此，应当理解实际上当检测不到电磁波或光时， 那么它表明有关样品已吸收了照射在其上的所有电磁波或光。备选地，很多时候当电磁波或光被部分吸收时，吸收的程度可通过传统的方法进行测量。由此可见在电磁波或光被最少地吸收的情况下，将认为吸收的水平是不显著的。总之，本发明的步骤之一是检测来自各个样品的电磁波或光的发射、吸收或反射。既然其中仅加载有缓冲液的部分作为阴性对照，当比较目标分析物的数值数据和缓冲液的数值数据时，从该比较中产生的δ值(delta value)指示该目标分析物的存在或不存在。图7说明与使用蓝色单色光相关的δ值将提供最好的结果，这表明在这个特定实验中，使用蓝色单色光检测该分析物是最有效的。 图8是与图7类似的，虽然它显示了该反应已在芯片薄片上进行了约6分钟时拍摄的一系列图像。值得注意的是与黄色单色光相关的S值是最高的，这表明在这个特定实验中，使用黄色单色光在这个反应时间检测该分析物是最有效的。图9是与图7类似的，虽然它显示了该反应已在芯片薄片上进行了约10分钟时拍摄的一系列图像。值得注意的是与橙色单色光和黄色单色光相关的S值是最高的，其中与橙色单色光相关的δ值高于与黄色单色光相关的δ值。这表明在这个特定实验中，使用橙色单色光在这个反应时间检测该分析物是最有效的。图10是与图7类似的，虽然它显示了该反应已在芯片薄片上进行了约14分钟时拍摄的一系列图像。值得注意的是与红色单色光相关的S值是最高的，这表明在这个特定实验中，使用红色单色光在这个反应时间检测该分析物是最有效的。图11是与图7类似的，虽然它显示了该反应已在芯片薄片上进行了超过14分钟时拍摄的一系列图像。值得注意的是与红外线相关的S值是最高的，这表明在这个特定实验中，使用红外线在这个反应时间检测该目标分析物是最有效的。从上面的实验，可以得出结论在某些情况下使用某种单色光应该是最有效的。然而，预测在特定时间使用哪种特定单色光却是很难的。因此，在根据本发明的一个方面的优选实施方案中，样品可通过一定范围的不同的预选的单色光进行相继照射。产生最佳S值的数据可用于确定目标分析物的存在或不存在。在上面的实验中，芯片薄片加载作为阳性对照和阴性对照的样品。然而，在备选实施方案中，与阳性和/或对照的值相对应的预先确定的值可用于比较目的。可提供合适的计算机软件以实施比较的练习。如实验1中所示，对芯片薄片上不同区域的反差进行视觉测定。然而，在实验2中， 检测由样品反射、吸收或发出的光强度然后数字化地转换为数值数据。应当理解本发明的某些特征(如通过上述实验的方式解释的)可在单个实施方案中组合提供。相反地，本发明的多种特征(如通过上述实验的方式解释的)为简洁的原因在一个实验的上下文中进行了描述，但是可以单独提供或以任何适当的亚组提供。
权利要求
1.一种使用电磁波或单色光检测样品中目标分析物的方法，包括(i)使用至少一种电磁波或单色光照射样品组，该样品组包括潜在含有该目标分析物的多个样品；(ii)检测在被该电磁波或单色光或每种电磁波或单色光照射时由该样品组反射、吸收或发出的电磁波的强度；(iii)记录与由该样品组反射、吸收或发出的电磁波或光的强度相关的一个或多个数值组，其中所述数值组或所述数值组中的每一组与由该样品组反射、吸收或发出的各自的电磁波或单色光相关；(iv)比较与该电磁波或单色光或每种电磁波或单色光相关的一个或多个数值组； (ν)选择具有较高信号的数值组之一；和(vi)基于从步骤(ν)中选择的数值组确定目标分析物的存在或不存在。
2.权利要求1的方法，其中所述样品或所述样品中的一些通过使用含有信号增强剂的检测标记物进行预处理。
3.权利要求1的方法，其中所述目标分析物通过含有信号增强剂的物质进行标记。
4.权利要求1的方法，包括，在步骤(i)中，使用至少两种电磁波或单色光相继照射所述样品组。
5.权利要求2的方法，其中所述信号增强剂是纳米-尺寸的颗粒。
6.权利要求5的方法，其中所述颗粒是金属颗粒。
7.权利要求5的方法，其中所述纳米-尺寸的颗粒是纳米-金颗粒。
8.权利要求5的方法，其中所述纳米-尺寸的颗粒是纳米-银颗粒。
9.权利要求1的方法，其中所述目标分析物存在于生物学样品中。
10.权利要求1的方法，其中所述单色光或所述单色光之一具有380nm至750nm的波长。
11.权利要求1的方法，其中所述单色光或所述单色光之一是蓝色单色光，或所述电磁波或单色光或所述电磁波或单色光之一具有范围在IOnm至IOOOnm的波长。
12.权利要求1的方法，其中在步骤(iv)中所述数值组之间相互比较，或与预定的参比值相比较。
13.权利要求1的方法，其中在步骤(iv)中所述数值组之间相互比较，或与照射用作阳性对照的样品组获得的数值组相比较。
14.权利要求1的方法，其中在步骤(iv)中所述数值组之间相互比较，或与照射用作阴性对照的样品组获得的数值组相比较。
全文摘要
一种用于检测样品微阵列中与含有纳米-尺寸的金-和/或银-的检测标记物相关的目标分析物的方法，其中该标记物指示样品中目标分析物的存在或不存在，所述方法包括(i)使用至少两种不同的单色光相继照射至少两个样品组，所述的样品组包括(a)包含至少一个潜在含有目标分析物的样品的第一样品组，和(b)用作阳性对照或阴性对照的第二样品组，(ii)检测当使用每种所述单色光照射时由每组所述样品组反射、吸收或发出的光的强度，(iii)记录与由该样品组反射、吸收或发出的光强度相关的数值组，其中每个数值组对每组样品组而言与每种单色光相关，(iv)比较与所述样品组和每种所述单色光相关的数值组；和(v)基于步骤(iv)中的比较确定目标分析物的存在或不存在，其中所述单色光至少包括蓝色单色光或具有范围在10nm至100nm的频率的单色光。还公开了用于执行所述方法的装置。
文档编号G01N33/53GK102171568SQ200980139247
公开日2011年8月31日 申请日期2009年10月9日 优先权日2008年10月10日
发明者于常海, 刘乐庭 申请人:海康生命科技有限公司