专利名称：荧光定量pcr技术检测gjb2基因突变的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及以一种以引物特异的实时定量PCR技术检测耳聋相关基因GJB2 235delC突变的方法及其试剂盒。
背景技术：
耳聋发病率高，目前证实约60%的耳聋由遗传因素引起，由遗传因素引起的耳聋，30%的患者属于综合征型耳聋(SHI)，70%的患者属于非综合征型耳聋(NSHI)。NSHI 中常染色体隐性遗传占75% —80%，即患儿双亲听力正常，但均是致病基因突变的肯定携带者，多散发存在，目前认为约50%的常染色体隐性遗传性NSHI由GJB2基因突变引起，且不同种族、地区的人群存在不同的热点致病位点，对于我国，日本，韩国等亚洲人群， 235delC突变位点是GJB2基因的主要致病突变位点，我国的研究资料证实，20-30%的耳聋由GJB2235delC突变引起，正常听力人群中GJB2235delC突变的携带者频率为2_3%。因此，临床上检测GJB2235delC突变可以明确耳聋病因，进而指导临床；尤其是和新生儿期听力筛查的同步检测，可以提高新生期耳聋的检出率，提高出生缺陷的三级预防；对孕期/孕前夫妇进行GJB2235delC突变检测可以筛查出携带者，进而指导产前诊断，降低耳聋发生率，提高出生缺陷的二级预防。目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR 产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP) 检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的专利(专利号200810222745. 7)采用了等位基因特异PCR技术，在一个PCR反应体系中使用了 4条引物，对于多位点检测有优势，但是该方法在PCR反应结束后需要后续的凝胶电泳分析结果，具有开放式操作，凝胶电泳污染环境等缺点，不适合临床推广。采用引物特异荧光定量PCR扩增法，针对GJB2基因235突变位点设计野生型引物和突变型引物，对一个待测样本分别用含野生型引物的荧光PCR体系和突变型引物的荧光 PCR体系进行检测，通过比较两次反应的Ct值和两者的差值(ACt)大小，判断样品是否存在GJB2235delC突变。具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种GJB2基因235delC突变的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒，可用于临床样品的检测。本发明的一个具体技术路线为1)在GJB2基因第233463nt区域设计反向突变型引物(SEQ ID NO 2)和反向野生型引物(SEQ ID NO :3)。反向引物的3’端倒数第二个或第三个碱基可以与GJB2基因序列不配对，反向引物的长度为15-30碱基之间，优选地位于第233-254nt区域。2)在GJB2基因第l-200nt区域设计正向野生型引物(SEQ ID NO :1)，正向引物的长度为15-40碱基，优选观-30碱基之间，引物序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是GJB2基因第l-200nt区域的任意一段符合引物要求的核苷酸序列。3)设计寡核苷酸探针，探针位于正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突变型引物(SEQ ID NO 2)之间(SEQ ID N0:7)，长度为15_35bp碱基，探针5，端标记荧光发生基团FAM或HEX，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突变型引物(SEQ ID NO 2)之间的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5’端标记的荧光发生基团及其相应的3’端荧光淬灭基团可以是本领域中任何可用的荧光基团，如FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE等。4)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括野生型检测体系(A)、 突变型检测体系(B)，每个检测体系都包括耐热DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，寡核苷酸探针(SEQ ID NO :7)，正向野生型引物(SEQ ID NO=D ；不同的是检测体系A 中含反向野生型引物(SEQ ID NO :3)，检测体系B中含反向突变型引物(SEQID NO :2)。5)从待测样本中提取DNA，加入前述的两个反应体系，进行荧光定量PCR反应。6)确定样本在野生型检测体系、突变型检测体系的Ct值，分别标记为CtA，CtB，Ct 值是指使用FQ-PCR反应方法检测DNA序列突变时，获得超过荧光信号阈值所需的PCR循环数目。△ Ct代表两者差值的绝对值；纯合子阈值和杂合子阈值是为判定检测结果而设定的两个不同的ACt，其中纯合子阈值大于杂合子阈值。ACt <3，判断为杂合型，ACt >5， 判断为纯合型。当Δ Ct彡5，如果CtA < CtB,则该样品为野生型纯合子，如果CtA > CtB, 则该样品为突变型纯合子。本发明的另一个具体技术路线为1)在GJB2基因第210-235nt区域设计正向突变型引物(SEQ ID NO 5)和正向野生型引物(SEQ ID NO :6)。正向引物的3’端倒数第二个碱基或倒数第三个碱基可以与GJB2 基因序列不配对，引物长度为15-40碱基，优选18-30碱基之间。GJB2基因第266_375nt区域设计反向野生型引物(SEQ ID NO :4)。引物序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是GJB2基因第266-375nt区域的任意一段符合引物要求的核苷酸序列。2)设计寡核苷酸探针(SEQ ID NO :8)，探针位于正向突变型引物(SEQ ID NO 5) 和反向野生型引物(SEQ ID NO 4)之间，探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列，可以是正向突变型引物(SEQ ID NO 5)和反向野生型引物(SEQ ID NO 4)之间的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5’端标记的荧光发生基团及其相应的3’端荧光淬灭基团可以是本领域中任何可用的荧光基团，如FAM HEX可以由其他荧光基团或染料代替， 如 VIC，JOE 等。3)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括野生型检测体系(A)、 突变型检测体系(B)，每个检测体系都包括耐热DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，寡核苷酸探针(SEQ ID NO :8)，反向野生型引物(SEQ ID NO 4)；不同的是野生型检测体系中含正向野生型引物(SEQ ID NO :6)，突变型检测体系中含正向突变型引物(SEQ ID NO 5)。
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4)从待测样本中提取DNA，加入前述的两个反应体系，进行荧光定量PCR反应。5)结果分析同前一个技术路线。本发明提供的GJB2基因235delC突变检测试剂盒主要包括以下组分野生型PCR 反应液，突变型PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品，DNA裂解液，红细胞裂解液和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选的实施方案，试剂盒中的野生型PCR反应液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向野生型引物(SEQ ID NO :1)、反向野生型引物 (SEQID NO :3)，荧光探针(SEQ ID NO 7)；突变型 PCR 反应液含有IXPCR Buffer、dNTP、 Mg2+、Taq酶、去离子水、正向野生型引物(SEQ ID NO :1)、反向突变型引物(SEQ ID NO :2)、 荧光探针(SEQ ID NO :7)。正向野生型引物(SEQID NO 1) :5，-agatgagcaggccgacttt-3，反向野生型引物(SEQ ID NO 3) :5，-gacacgaagatcagctgcagtg-3，反向突变型引物(SEQ ID NO 2) :5，-gacacgaagatcagctgcagtc-3，荧光探针(SEQ ID NO 7) :5，FAM_ctacttccccatctcccaca_TAMRA3，根据本发明的一个优选的实施方案，试剂盒中的野生型PCR反应液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去离子水、正向野生型引物(SEQ ID NO 6)、反向野生型引物(SEQ ID NO :4)、荧光探针(SEQ ID NO 8)；突变型PCR反应液含有=IXPCR Buffer、 dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去离子水、正向突变型引物(SEQ ID NO :5)、反向野生型引物 (SEQ ID NO :4)、荧光探针(SEQ ID NO :8)。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的荧光探针(SEQ ID NO :7)，荧光探针 (SEQID NO 8)也可以使用荧光染料STOR GREENI替代。正向野生型引物(SEQ ID NO 6) :5，-atctcccacatccggctatgggcac-3，正向突变型引物(SEQ ID NO 5) :5，-atctcccacatccggctatgggcat-3，反向野生型引物(SEQ ID NO 4) :5，-tcttctcatgtctccggtagg-3，荧光探针(SEQ ID NO 8) :5，FAM_cagctgatcttcgtgtccac_TAMRA3，根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阴性质控品为蒸馏水、纯水或生理盐水；阳性质控品为经过测序检验结果为GJB2235位点野生纯合型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的质粒载体。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中待检测靶核酸样品来自从各种途径获取的被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织等等。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的DNA提取液主要包含Chelex-IOO。 也可以使用其它试剂盒或方法提取的DNA作为进行荧光定量PCR时的模板。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中用于判定检测方法有效性的标准是 每次检测都使用野生型PCR反应液、突变型PCR反应液分别检测阳性质控品和阴性质控品，对于阳性质控品，依据两次荧光PCR所得出的△ Ct值作为质量控制标准，阳性质控品的 Δ Ct值应大于等于阈值。阴性质控品两次荧光PCR检测结果应为阴性。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒检测结果的阈值可以根据不同标本类型或者不同的灵敏度及特异性要求设为3-9之间的任意值。根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，在试剂盒的PCR缓冲液中加入甲酰胺或二甲基亚砜等PCR反应添加剂减少高GC含量或二级结构对PCR 反应的影响。


图1显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，靠近左边的‘S’型曲线是野生型PCR反应液生成的曲线，靠近右边的‘S’型曲线是突变型PCR反应液生成的曲线。可见野生型PCR反应液Ct值明显低于突变型PCR反应液生成的曲线。图2显示阴性质控品的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度， 可见野生型PCR反应液、突变型PCR反应液均无扩增曲线。图3显示试剂盒检测GJB2235delC野生型人外周血组织标本的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，靠近左边的‘S’型曲线是野生型PCR反应液生成的曲线，靠近右边的‘S’型曲线是突变型PCR反应液生成的曲线。可见野生型PCR反应液Ct 值明显低于突变型PCR反应液生成的曲线。图4显示试剂盒检测GJB2235delC突变型人外周血组织标本的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，靠近左边的‘S’型曲线是突变型PCR反应液生成的曲线，靠近右边的‘S’型曲线是野生型PCR反应液生成的曲线。可见突变型PCR反应液Ct 值明显低于野生型PCR反应液生成的曲线。图5显示试剂盒检测GJB2235delC杂合型人外周血组织标本的扩增曲线。横轴表示循环数(Ct值)，纵轴表示荧光强度，两条‘S’型曲线分别表示突变型PCR反应液生成的曲线和野生型PCR反应液生成的曲线。可见突变型PCR反应液Ct值和野生型PCR反应液 Ct值接近。图6显示DNA提取失败的人外周血组织的扩增曲线，图6A中野生型PCR反应液、 突变型PCR反应液均无扩增曲线，说明DNA提取失败。图6B管无特异性增长曲线且CtA > 33,说明DNA浓度太低，不能用于PCR检测。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用试剂盒的组成野生型PCR反应液1管(500ul)、突变型PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1 管QOul)，阴性质控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反应液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 3(SEQ ID NO :3)、0. 2uM 荧光探针 7 (SEQ ID NO :7)。突变型PCR 反应液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 2(SEQ ID NO :2)、0. 2uM 荧光探针 7 (SEQ ID NO :7)。操作步骤1)基因提取取IOOul EDTA抗凝外周血，加入600ul红细胞裂解液，室温放置 5-10分钟，期间混勻数次，5000rpm离心5分钟，弃上清，然后加入DNA裂解液IOOul，混勻，99度10分钟，离心，取上清作为DNA摸板进行后续工作。也可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行基因提取，提取过程按照相应的试剂盒说明进行。2) PCR检测取野生型PCR反应液23ul，突变型PCR反应液23ul分别置入PCR管中，分别加入2ul样品DNA，混勻后置于荧光定量PCR仪中。阳性质控分别取阳性质控品2ul分别加入野生型PCR反应液和突变型PCR反应液中，余同样品操作。阴性质控分别取阴性质控品2ul分别加入PCR反应液中，余同样品操作。PCR扩增参数50 "C 2min，95 "C 2min, 然后进行40个循环 950C 30sec — 61°C 20sec，反应结束后将结果保存待进一步分析。3)结果分析确定样本在野生型检测体系、突变型检测体系的Ct值，△ Ct代表两者差值的绝对值；Δ Ct ^ 3，判断为杂合型，ACt ^ 5，判断为纯合型。当ACt彡5，野生型 Ct值<突变型Ct值，则该样品为野生型纯合子，如果野生型Ct值>突变型Ct值，，则该样品为突变型纯合子。实施例2 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用试剂盒的组成野生型PCR反应液1管(500ul)、突变型PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1 管QOul)，阴性质控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反应液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0· 2uM 引物 3(SEQ ID NO :3)、0· 5X SYBR GREEN I。突变型PCR 反应液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 3(SEQ ID NO :2)、0· 5X SYBR GREENI。操作步骤及结果分析同实施例1。实施例3 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用试剂盒的组成野生型PCR反应液1管(500ul)、突变型PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1 管QOul)，阴性质控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反应液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :4)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0. 2uM 荧光探针 7 (SEQ ID NO :7)。突变型PCR 反应液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 5 (SEQ ID NO :5)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0. 2uM 荧光探针 7 (SEQ ID NO :7)。操作步骤及结果分析同实施例1。实施例4 :GJB2基因235delC突变检测试剂盒及其使用试剂盒的组成野生型PCR反应液1管(500ul)、突变型PCR反应液1管(500ul)、阳性质控品1 管QOul)，阴性质控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，红细胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反应液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :4)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0· 5X SYBR GREEN I。突变型PCR 反应液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :5)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0· 5X SYBRGREEN I。
操作步骤及结果分析同实施例1。
权利要求
1.一种采用引物特异性实时荧光聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测GJB2基因235delC 突变方法，其特征在于以GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异性引物，对于每一个样品，确定突变与否需同时进行两次FQ-PCR，使用附加质控品和被检测样品自身质控判定检测的有效性以及根据每个样品两次FQ-PCR检测得到的△ Ct值判断检测结果。
2.一种用荧光定量PCR方法检测GJB2基因235delC突变的试剂盒，其特征在于试剂盒主要包括野生型PCR反应液，突变型PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品。
3.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，GJB2基因第l-200nt区域设计正向野生型引物(SEQ ID NO :1)，其长度为1848bp之间的核苷酸序列，第233463nt 区域设计反向突变型引物(SEQ ID NO 2)和反向野生型引物(SEQ ID NO :3)，反向突变型引物(SEQ ID NO 2)其特征在于3，端碱基能够与GJB2基因235delC突变区结合，反向野生型引物(SEQID NO 3)其特征在于3，端能够与GJB2基因235delC未突变区结合。
4.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，GJB2基因第^6-375nt 区域设计反向野生型引物(SEQ ID N0:4)，其长度为1848bp之间的核苷酸序列，第 210-235nt区域设计正向突变型引物(SEQ ID NO 5)和正向野生型引物(SEQ ID NO 6), 正向突变型引物(SEQ ID NO 5)其特征在于3，端碱基能够与GJB2基因235delC突变区结合，正向野生型引物(SEQ ID NO 6)其特征在于3，端能够与GJB2基因235delC未突变区纟口口。
5.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于，PCR反应液中包含荧光检测物质。荧光检测物质为荧光探针或荧光染料STOR GREEOT。
6.根据权利要求1、2、3、5所述的方法及其试剂盒，其特征还在于荧光探针的序列位于正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突变型引物(SEQ ID NO 2)之间(SEQID NO :7)，其中探针5’端标记荧光发生基团，3’端标记荧光淬灭基团。
7.根据权利要求1、2、4、5所述的方法及其试剂盒，其特征还在于荧光探针的序列位于正向突变型引物(SEQID NO 5)和反向野生型引物(SEQID NO 4)之间(SEQ ID N0:8)，其中探针5 ‘端标记荧光发生基团，3’端标记荧光淬灭基团。
8.根据权利要求1、2、3、5、6所述的方法和试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内容野生型PCR反应液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向野生型引物 (SEQID NO :1)、反向野生型引物(SEQID NO :3)、荧光探针(SEQ ID NO :7)。突变型PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去离子水、正向野生型引物(SEQID N0:1)、反向突变型引物(SEQ ID NO :2)、荧光探针(SEQ ID NO 7)或荧光染料STOR GREEN I。
9.根据权利要求1、2、4、5、7述的方法和试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内容 野生型PCR反应液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去离子水、正向野生型引物 (SEQID NO :6)、反向野生型引物(SEQID NO :4)、荧光探针(SEQID NO :8)。突变型PCR反应液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去离子水、正向突变型引物(SEQ ID NO: 5)、反向野生型引物(SEQID NO :4)、荧光探针(SEQ ID NO 8)或荧光染料STOR GREEN I。
10.根据权利要求1、2所述的方法及其试剂盒，其特征在于待检测靶核酸样品来自被检测者的血液、唾液、羊水细胞或其它人体组织；阴性质控品为蒸馏水、纯水或生理盐水； 阳性质控品为为经过测序检验结果为GJB2235位点纯合野生型的组织、血液、或细胞系提取的DNA或相应的质粒载体。
全文摘要
本发明提供了一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋相关基因GJB2235delC突变的方法及其试剂盒。本试剂盒针对GJB2基因235delC突变位点，设计特异性的寡核苷酸引物，利用荧光物质，对一个待测样本分别用野生型荧光PCR体系和突变型荧光PCR体系进行检测，通过比较两次反应的Ct值和两者的差值(ΔCt)大小，判断样品是否存在GJB2235delC突变。本发明的使用不仅能为耳聋患者的病因诊断提供有价值的临床参考信息，而且可以筛查孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断提供帮助。试剂盒使用特殊的PCR反应体系和反应条件，特异性检测GJB2235delC突变位点，具有高通量，闭管自动化操作的优点，适合临床实验室使用。
文档编号G01N21/64GK102465174SQ20101053637
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者王宝恒 申请人:王宝恒