专利名称：一种血清多肽内标校正检测方法
技术领域：
本发明涉及血清多肽的检测，具体地说是一种利用质谱对血清多肽进行校正检测 的方法。
背景技术：
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption 1 ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-T0F-MS)技术，是近年来飞速发 展的蛋白质组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与 临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高同量的分析测试手段，同时也是一种很好的 筛选疾病的分子标记方法。目前的相关研究大多是多维色谱分离与电喷雾离子化源(ESI源)质谱分析联 用的应用研究，而对于基质辅助激光解析电离(MALDI)源质谱而言，由于每次实验中样本 分离程度、样品在靶上的结晶状况和肽段离子化效率等因素的不同导致实验结果的重现性 差，限制了本技术在临床医学实验室的广泛应用。因为不管是ESI或MALDI离子源，由于分子结构的差异，导致质谱的峰高并不和蛋 白量有绝对的关系，同等量不同的蛋白分子，在质谱上的响应是不同的。到目前为止，还没有能够有效内标校正检测血清多肽技术的相关报道。

发明内容
本发明的目的在于，针对上述不足提供一种内标校正检测血清多肽的方法。本发明血清多肽内标校正检测方法是在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利 用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。这样可以避免血清多肽分子量 的漂移。所述质谱优选为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。尽管生物质谱具有较高的检测灵敏度，但是其检测能力受复杂环境中高丰度的干 扰物质所限制。为此，本发明方法优选还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。上述内标可以加入到经SPE-C磁珠富集处理后的样本中，或者直接加入到血清 中，然后在经SPE-C磁珠富集处理。前一种方式相对于后一种方式简单更容易实现，并且更 容易实现内标和血肽谱峰共同存在，且强度合适。优选加入的多肽为浓度已知的多肽，这样不仅可以校准质谱图横坐标还可以矫正 纵坐标，提高蛋白质分子量和丰度检测的准确度。多肽的浓度可根据样品进行调整，通常以 终浓度(50fmol)为宜。内标的设计，可以采用如下方式进行插空式，即在已有血肽数据基础上，查看哪 些区域没有固有血肽影响，则设计该分子量区间的内标(即内标多肽位于血清多肽指纹图 谱的无干扰区域)。在本发明一个实施例中，选择分子量1964. 09Da作为内标肽，进一步还可以将上 述内标制备成各种检测试剂盒，以方便使用。
本发明通过在血清样本中添加已知质荷比峰的多肽作为内标，在检测血清样本时 用内标进行校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。


图1是经标准品外标校正后的质谱图，其平均分子量偏差小于IOOppm ；图 2.Mr = 1964. 09Da 内标自检，浓度=lfmol/μ 1。图3.血清+内标，内标浓度=IOOfmol/μ 1。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1本例中，将人血清经SPE-C磁珠处理后的富集液，MALDI-T0F得到的谱图为血清多 肽指纹图谱简称血肽谱。在SPE-C磁珠处理后的富集液中加入内标目的是在MALDI-T0F线 性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子 量的漂移。实验目的:以1964. 09作为内标进行校正，优化系统重复性和稳定性。实验材料(1)真空采血管[BD Vacutainer SST (‘tiger-top，)管(Becton Dickinson cat. no. 367988)](2)聚丙烯EP管(适用于_80°C )(3)枪头(Eppendorf)(4)排管(Eppendorf)(5)分装瓶或管[Eppendorf，Biozym PCR 管(H7IO95O)](6)溶剂瓶[Nalgene FEP (Teflon)瓶](7) MTPs (Greiner PP, natural，MTP) (8) 0. 1% TFA(色谱级)1 μ 1 TFA加入到1000 μ 1纯水中，混合均勻(9) 100%丙酮(色谱级)J. K. Baker LOT NO. E32E11(10) 100 % 乙醇(色谱级)J. K. Baker LOT NO. E39B24(11) 100% 乙腈(12) IOmM醋酸铵(色谱级)(13) 77mg醋酸铵溶解于100ml纯水中(14)Peptide Calibration Standard(夕卜 +示)Bruker Daltonik ；cat. no. 206195 ； Protein Calibration Standard I (夕卜f示)Bruker Daltonik ；cat. no. 206355(15)人血清(Sigma ；cat. no. S7023)(16)磁珠SPE-C弱阳离子磁珠试剂盒毅新兴业(北京)科技有限公司
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(17) α -Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA)Bruker Daltonik ；lg#201344， 5g#203072(18)AnchorChip 600 μ m #209514仪器和设备(1)离心机(Bioyong)(2)移液器(Eppendorf)(3)磁 架 Robotic separation device for 96microtiter flate format Magnetseparator(Bruker Daltonik)(4)质谱仪autoflexTM II (Bruker Daltonik)(5)真空旋干机labconco Centrivap Centrifugal Concentratots and Cold Traps(6)相关软件数据采集FlexControl 2. 2 ；看图软件FlexAnalysis3. O ；分析软 件 ClinProTools 2. 1 (Bruker DALTONICS 公司)实验条件(1)样品类型合成多肽1964. 09Da北京中科亚光生物科技有限公司，及货号 H18125601 :CQEESYKEIGHSSPPSVS(2)质谱仪microflex，德国 Bruker(3)分析软件FlexAnalysis3. O,德国 Bruker(4)采集参数采样激光在10% 20%，每50shots采一张图共累加4张图， 200shots，采集范围 800-10000Da实验步骤(1)缓慢地上下振荡采血管5次，使血液中的凝结块混勻。室温(25°C )垂直放置 1小时，使血液凝结。(血液必须精确凝结1小时，否则，样品凝结时间不同会人为地导致肽 谱不同。)室温下，用临床离心机以1.400-2. OOOg离心SST管10分钟。吸取上清液(血清) 到对应的已标记样品管中。立即冻存血清样品于-80°C冰箱。避免反复冻融。(2)从4°C冰箱中取出SPE-CM磁珠悬浮液一管，反复倒置，使磁珠完全、均勻的悬 浮于液相中。在200 μ 1样品管中加入2 μ 1 SPE-CM磁珠混悬液，95 μ 1 SPE_CB、5 μ 1血清， 反复吸打数次，使磁珠与SPE-CB、血清混合均勻，室温静置5min。将样品管置于磁珠分离器 上，使磁珠贴壁lmin，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将上步中的样品管从磁 珠分离器上移走，并在上述样品管中加入100 μ 1 SPE-CW,反复吸打数次，使磁珠与SPE-CW 混合均勻，室温静置2min。将样品管转移到磁珠分离器上，使磁珠贴壁lmin，磁珠与液体分 离，待液体澄清后，吸净液体。将样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入10 μ 1 SPE-CE (由SPE-CE 1、SPE-CE2组成)，反复吸打10次之上，使磁珠与SPE-CE混合均勻，室温 静置5min。(3)100fmol/y 1内标加入到血清提取液中，按照步骤⑷进行点样，质谱检测。(4)取5 μ 1的0. 4mg/ml HCCA基质于0. 5 μ 1样品管，加入0. 8-1. 2 μ 1的样品洗 脱液(根据样品、结晶、温湿度等适当调节洗脱液量)，用加样枪反复吸打10次以上混合均 勻。取1 μ 1上述混合液体，点在600 μ m Anchorchip样品位置上，室温放置至干燥无液体 残留。
实骀结果目前常规检测是毎8个样品中间点一个7个多肽的标准，来校正仪器， 但是还是会存在一定的偏差。在不影响样品出峰的前提下，采用合成多肽分子作为内标，建 立二位标准校正法来校准质谱图横坐标和纵坐标，提高蛋白分子量和丰度检测的准确度。( 一 )外标校正外标矫正结果如图1所示，通过外标校正，使平均分子量偏差小于lOOppm。(二)内标校正内标自检的结果如图2所示，其质荷比峰与理论值相一致。图3中上图是血清单独进行检测的结果，下图是添加了内标后检测的结果。变异系数cv %越小，说明整个实验系统越稳定，数据误差越小，这样也就达到了内 标和外标同时校正的目的。表1对sigma人血清的检测结果
权利要求
一种血清多肽内标校正检测方法，其特征在于，在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述质谱为基质辅助激光解析电离飞行 时间质谱。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多肽的浓度已知。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多肽的质荷比峰位于待检血清多肽 指纹图谱无干扰区域。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在内标校正前还包括采用外标矫正的步马聚ο
全文摘要
本发明提供了一种内标校正检测血清多肽的方法，其是在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。本发明方法可以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确性。在MALDI-TOF线性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。
文档编号G01N27/62GK101963595SQ20101027182
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者任晶, 刘丽华, 张燕, 李燕, 田亚平, 马庆伟 申请人:毅新兴业(北京)科技有限公司