专利名称：一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种过碘酸雪夫氏反应(PAQ法快速染色试剂盒，特别是一种改良的过碘酸雪夫氏反应(PAQ法快速染色试剂盒
背景技术：
真菌是指具有真正细胞核、产生孢子、不含叶绿素，以寄生或腐生方式吸取养料， 能进行有性和(或)无性繁殖，具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、TB、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。目前真菌检测方法主要有形态学检查、培养法及新兴的的血清学检测抗原/抗体、分子生物学检测其靶DNA等。真菌培养法需时间较长，而新兴的多种非培养法的敏感性和特异性仍不能满足临床诊断的需要，更不能指导抗真菌治疗的启动和终止，故真菌染色镜检仍然是真菌实验室常规检测的最重要手段。真菌用H-E染色一般着色不良，因此需用特殊的染色方法来显色，六胺银法(GMQ用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。六胺银染色能显示大多数真菌，并且能很好的将真菌特点显示出来，是显示真菌效果最佳的一种方法，但此方法操作繁琐，技术要求较多，不易控制温度，效果不稳定、不易获得菌体及背景清晰的染色效果等。过碘酸雪夫氏反应(Periodic Acid Schiff，PAS)法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。若用孔雀绿复染，真菌更易区别，PAS染色能特异性着染真菌胞壁，优点是操作简单，不容易过染，并且能较好的显示大多数真菌，包括单细胞型和多细胞型真菌，这两种方法可显示大多数真菌，是最广泛最常用的染色方法。但在临床实验室工作中，这两种方法均不可避免的有需要特殊且危险的化学试剂、操作繁琐、技术要点要求较多不易掌握、效果不稳定、不易区分菌体与背景等缺点。

发明内容
本发明的目的是提供一种改良的过碘酸雪夫氏反应(PAS)法快速染色试剂盒，使用本试剂盒，可使检测流程缩短到10秒钟左右，非常适合大规模临床操作。为达到上述的发明目的，本发明采用以下技术方案这种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，它包括染色液、防脱胶片、盖物片，所述的染色液是活性品红液与固绿工作液的混合液，并用95%乙醇和0. 5%亚硫酸氢钠液稀释制成。所述的活性品红液与固绿工作液按2 1体积比混合，再加入活性品红液两倍体积的95%乙醇以及与活性品红等体积的0. 5%亚硫酸氢钠液，其各成份的体积比为活性品红液固绿工作液95%乙醇0.5%亚硫酸氢钠液=2 1 4 2。加入焦亚硫酸钠的用量与碱性品红用量的重量比为2. 3 2. 5 1。固绿原粉与磷钨酸的重量比为4 3 1。本实验的基理是凡细胞壁主要成分是多糖(80% -90% )的物质，酸性条件下多糖分子内的乙二醇基变为乙二醛基，品红可与醛基反应，生成一种紫红色的产物，固绿也可与醛基反应生产绿色物质，沉淀在多糖、糖蛋白等部位，从而显示物质的形态及结构。本产品使用PAS改良法，即用高碘酸氧化细胞壁的多糖使之游离出醛基，后者与无色品红和固绿结合，根据病原菌细胞壁多糖成分的不同生成新的复合物而被显色成深绿色、红色或蓝色等。本发明的优点1).首次将品红与固绿共同制备成快速生物染色液；快速10秒左右；简便直接观察，免冲洗；2).避免了原有10% KOH法虽显色快但查真菌不能显色的弊端；3).解决了氨银法带来的生物安全差及环境污染的问题，使之无毒无害无环境污染；4).适用范围广适合皮屑、黏液、阴道分泌物等临床上的大量标本；5).将高碘酸附着在载玻片上，既节省了产品的包材，又简化了操作流程，尤其符合临床标本量大的要求；6).高碘酸为易燃易爆产品，由于高碘酸附着在载玻片上，使之由液态变为干燥状态，大大降低了其危险性，也从而解决了其不适宜常规长途储运的弊端；更易做到标准化操作，避免了因人为操作误差造成的可重复性差。预期用途1).主要用于快速检测黏液、小皮屑和小块组织标本中的真菌，也可用于检测上述标本中的寄生虫、螺旋体、原虫(如滴虫、阿米巴原虫)等。2).体液及分泌液的脱落细胞学检查，特别适用于妇科白带常规检查。检查步骤1).将待检标本涂置于防脱胶片上；2).滴加显色液1-3滴于标本上，加盖盖物片，室温静置lOs-lmin，显微镜下观察。染色结果判断染色效果真菌菌丝和孢子绿色或深绿色；原虫、寄生虫及螺旋体等显红色或蓝色，其他细菌、细胞碎片程度不同程度的浅蓝色，织物纤维无色或红色。性能指标1、灵敏度> 95%,特异度> 96% ；批内差异< 2.5% ；批间差异< 3.0% ；


图1 真菌菌丝及孢子(光镜观察40 X)图2 真菌菌丝及孢子(光镜观察20 X)图3 真菌孢子(光镜观察40 X)
图4 真菌孢子(光镜观察20 X)图5 阴道分泌物染色筛查(光镜观察40 X)图6阴道分泌物染色筛查(光镜观察20 X)
具体实施例方式1、染色液的制备1-1活性品红液制备1).碱性品红4 4. 5g加入到1升的去离子水中，95 100°C水浴加热10 15min，并在冷却至48 50°C时，用孔径为80 120微米的滤纸过滤；2).向上述过滤液中加入HCL (IMol/L) 90 100ml，pH值调至< 5，冷却至室温；3).其后加入焦亚硫酸钠9. 5 10. 5g，搅拌5 lOmin，置暗处过夜，加入活性炭粉末，搅拌过滤得无色透明染液，室温避光保存备用。1-2固绿工作液制备1).取固绿原粉1. 8 2. 2g加入到蒸馏水10毫升中，搅拌30分钟至完全溶解，得到浓度为180-220g/L的A液备用。2).取磷钨酸0. 5 0. 6g加入上述IOmlA液中，搅拌30分钟至溶得到B液备用。3).将B液用70%的乙醇20倍(20 X)稀释，搅拌30分后过滤，即得固绿原液，可
长期室温避光保存备用。4).对固绿原液用47. 5%的乙醇进行6倍(6X)稀释后制成工作液后使用。1-3染色液各成分比例活性品红液与固绿工作液按2 1的体积比混合，再加入活性品红液两倍体积的 95%乙醇和与活性品红等体积的0. 5%亚硫酸氢钠液。即各成份的体积比为活性品红 固绿工作液95%乙醇0.5%亚硫酸氢钠液=2 1 4 2。2、防脱胶片的制备2-1高碘酸胶液制备1).取高碘酸晶体5克，加去离子水50毫升(100g/L)，搅拌溶解，用孔径为孔径为 80 120微米的滤纸过滤得到A液，室温保存备用；2).取明胶10克，加入去离子水50毫升O00g/L)，65°C水浴加热搅拌溶解(30分钟)，用孔径为80 120微米的滤纸过滤得到B液，室温保存备用；3).将上述A液和B液混合，搅拌均勻即制成高碘酸胶液，用于下一步制备防脱胶片。2-2胶片制备1).取清洁载物片浸入高碘酸胶液5 8分钟，进入控干缸A、B、C控干，各5 8 分钟，55 60°C温箱烤干1小时，恢复至室温即制成防脱胶片，以用于本试剂盒(称为真灵 I染色试剂盒)2).将涂片放入防潮袋中，室温避光保存。实施例1 足癣患者实验诊断过程如下1).取材采集自北京大学第三医院皮肤科门诊足癣患者，脚趾间不同部位小皮屑3块；
2).分别将此3块小皮屑涂置于防脱胶片上；3).滴加活性品红浓度为4. 3g/L，固绿工作液浓度为1. 6g/L，并与95%乙醇和 0.5%亚硫酸氢钠，按2 :1:4: 2的体积比配制而成的染色液，至完全浸润标本后加盖玻片，10秒钟后显微镜下观察；4).染色结果如图1和图2所示，有大量菌丝和孢子存在，结合菌丝和孢子形态分析推测该患者系皮肤癣菌感染引起的足癣。5).染色效果评价孢子和菌丝染色清晰与背景细胞碎片或细菌区分明显，菌丝形状(如分支结构)得到了很好的保持，说明真菌的自然形态在染色过程中未遭到明显改变，这有利于进一步进行具体的菌属鉴定。实施例2:头癣患者实验诊断过程如下1).取材采集自北京大学第三医院皮肤科门诊头癣患者，头部不同部位小皮屑3 块；2).分别将此3块小皮屑涂置于防脱胶片上；3).滴加活性品红浓度为4. 3g/L，固绿工作液浓度为1. 6g/L，并与95%乙醇和 0.5%亚硫酸氢钠，按2 :1:4: 2的体积比配制而成的染色液，至完全浸润标本后加盖玻片，10秒钟后显微镜下观察；4).染色结果如图表3和图表4所示，有大量孢子存在，结合孢子形态分析推测该患者系皮肤癣菌中的孢子菌属感染引起的头癣。5).染色效果评价孢子染色清晰与背景细胞碎片区分明显，孢子形态得到了很好的保持说明真菌的自然形态在染色过程中未遭到明显改变，有利于进一步进行具体的菌属鉴定，结合该标本染色后以孢子为主，少见菌丝推测其为皮肤癣菌中的孢子菌属感染。实施例3 霉菌性阴道炎患者实验诊断过程如下1).取材采集自北京大学第三医院妇科门诊阴道炎患者，清晨白带标本少许(注意无菌操作保留)；2).将少许白带标本涂置于防脱胶片上；3).滴加活性品红浓度为4. 3g/L，固绿工作液浓度为1. 6g/L，并与95%乙醇和 0.5%亚硫酸氢钠，按2 :1:4: 2的体积比配制而成的染色液，至完全浸润标本后加盖玻片，10秒钟后显微镜下观察；4).染色结果如图表5和图表6所示，有大量孢子存在，结合孢子形态分析推测该患者系由霉菌(白色念球菌)感染引起的阴道炎5).染色效果评价孢子染色清晰与背景细胞碎片区分明显，孢子形态得到了很好的保持说明真菌的自然形态在染色过程中未遭到明显改变，有利于进一步进行具体的菌
属鉴定。
权利要求
1.一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，其特征在于它包括染色液、 防脱胶片、盖物片，所述的染色液是活性品红液与固绿工作液的混合液，并用95%乙醇和 0. 5%亚硫酸氢钠液稀释制成。
2.根据权利要求1所述的一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，其特征在于活性品红液与固绿工作液按2 1体积比混合，再加入活性品红液两倍体积的95%乙醇以及与活性品红等体积的0.5%亚硫酸氢钠液，其各成份的体积比为活性品红液固绿工作液95%乙醇0.5%亚硫酸氢钠液=2 1 4 2。
3.根据权利要求1或2所述的一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，其特征在于所述的活性品红液是通过以下工艺获得的将碱性品红加入到去离子水中，得到浓度在4. 0-4. 5g/L之间的溶液，95 100°C水浴加热10 15分钟，并在冷却至48 50°C时用孔径为80 120微米的滤纸过滤，向上述过滤液中加入浓度为lmol/L的HCL，pH 值调至< 5，冷却至室温，其后加入焦亚硫酸钠，其用量与碱性品红用量的重量比为2. 3 2.5 1，搅拌5-10分钟置暗处过夜，加入活性炭粉末，搅拌过滤得无色透明染液。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒， 其特征在于所述的固绿工作液是通过以下工艺获得的将固绿原粉加入到去离子水中， 搅拌溶解得到浓度在180 220g/L之间的A液；在A液中加入磷钨酸，固绿原粉与磷钨酸的重量比为4 3 1，搅拌至溶解得B液；将B液用70%的乙醇20倍稀释，搅拌过滤即得固绿原液，对固绿原液用47. 5%的乙醇进行6倍稀释后制成工作液。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，其特征在于所述的防脱胶片是通过下列方法获得的取清洁载物片浸入高碘酸胶液中的时间为5-8分钟，进入控干缸A、B、C控干，各5-8分钟，55-60°C温箱烤干1小时，恢复到室温即制成防脱胶片。
6.根据权利要求5所述的一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，其特征在于所述的高碘酸胶液制备方法是1)向高碘酸晶体加入去离子水，搅拌溶解，其其浓度为80-120g/L，用孔径为80-120 微米的滤纸过滤，过滤得到A液；2).向明胶中加入去离子水，浓度为180-220g/L，65°C水浴加热搅拌溶解，用孔径为 80-120微米的滤纸过滤，得到B液，3).将上述A液和B液混合，搅拌均勻即制成高碘酸胶液。
全文摘要
一种改良的过碘酸雪夫氏反应法快速染色试剂盒，它包括染色液、防脱胶片、盖物片，所述的染色液是活性品红液与活性固绿液的混合液，并用95％乙醇和0.5％亚硝酸氢钠液稀释制成。本发明的优点首次将品红与固绿共同制备成快速生物染色液；快速10秒左右；简便直接观察，免冲洗；适用范围广适合皮屑、黏液、阴道分泌物等临床上的大量标本；将高碘酸附着在载玻片上，既节省了产品的包材，又简化了操作流程，尤其符合临床标本量大的要求；高碘酸为易燃易爆产品，由于高碘酸附着在载玻片上，使之由液态变为干燥状态，大大降低了其危险性，易做到标准化操作，避免了因人为操作误差造成的可重复性差。
文档编号G01N33/52GK102243226SQ20101016734
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者付红伟, 张丹, 王雷明, 韩亚京 申请人:北京世济合力生物科技有限公司