专利名称：一种卵裂球单细胞的固定方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别是一种卵裂球单细胞的固定方法。
背景技术：
单个卵裂球细胞的固定是极难控制、掌握，但又非常重要的技术，是医学界的一大难题，与传统的多个细胞固定技术不同，卵裂球细胞的固定只对单个细胞进行操作，要求彻底去除胞浆蛋白，保留染色体DNA的完整性。细胞固定的好坏直接影响单细胞荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)的结果。传统的细胞固定方法有两种甲醇/冰醋酸法和Tween-20/HCl法。(I)甲醇/冰醋酸法细胞活检后，用带内径135um的细针Stripper将单个卵裂 球转移到细胞低渗液中2-5min，后将细胞移至玻片背面已画圈标记的区域内，总液体量不超过2ul。在解剖显微镜下观察直至细胞低渗液基本干透形成结晶之前用新鲜配制的甲醇/冰醋酸(3:1)从上方滴向标本固定细胞，此时细胞可能会随着固定液形成的湍流而游走，但很快固定在玻片上，重复数次至胞浆完全溶解。并用钻石笔标记细胞核的确切位置。(2)吐温20/盐酸(又称Tween-20/HCl)法细胞活检后，将单个卵裂球转移到细胞低渗液中2-5min，后将细胞移至玻片上Iul细胞裂解液中固定，在倒置显微镜下观察直至细胞膜破裂，胞浆去除，胞核游离固定，胞浆去除不全影响杂交效果。后滴几滴甲醇/冰醋酸去残留的胞浆，自然干燥，钻石笔标记细胞核的确切位置。上述两种传统的方法的缺点是方法(I)所有的单细胞都需要低渗，因此耗时；细胞在固定过程中由于甲醇/冰醋酸挥发很快，因此细胞漂移非常迅速，极易导致细胞丢失而导致无法诊断；细胞固定的好坏与湿度相关，一般建议在30%湿度下进行，因此固定条件要求高；另外初学者很难掌握。方法(2)同样需要低渗，并且需要自然干燥，因此耗时更长。

发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种卵裂球单细胞的固定方法，可有效解决现有技术操作复杂繁琐，要求条件苛刻，难以掌握，耗时长，细胞固定效果差，胞浆蛋白去除不彻底的问题。本发明的技术方案是包括以下步骤
(1)将单个卵裂球在磷酸盐缓冲液中漂洗，得漂洗的卵裂球细胞；
(2)将步骤(I)所得卵裂球细胞移至载玻片的标定区域内，标定区域内滴加有l-2yL的吐温20和盐酸的混合溶液，将载玻片置于35-38°C的显微镜热台上，液体自然蒸发过程中观察细胞膨胀、破裂、核游离，若细胞膜未完全破裂，可重复滴加吐温20和盐酸的混合溶液；
(3)待在显微镜下观察到步骤(2)中细胞的细胞膜破裂、细胞核游离后，停止滴加吐温20和盐酸的混合溶液，室温15-30°C下干燥后，再在载玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去残留的胞浆。
本发明操作简单方便，耗时短，容易掌握，细胞固定效果好，固定率高，简单高效，大大节省了人力和物力。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
本发明由以下步骤实现
(1)将单个卵裂球在磷酸盐缓冲液中漂洗，得漂洗的卵裂球细胞；
(2)将步骤(I)所得卵裂球细胞移至载玻片的标定区域内，标定区域内滴加有1-2UL的吐温20和盐酸的混合溶液，将载玻片置于35_38°C的显微镜热台上，液体自然蒸发过程中观察细胞膨胀、细胞膜破裂、细胞核游离，若细胞膜未完全破裂，可重复滴加吐温20和盐酸的混合溶液；
(3)待在显微镜下观察到步骤(2)中细胞的细胞膜破裂、细胞核游离后，停止滴加吐温20和盐酸的混合溶液，室温15-30°C下干燥后，再在载玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去残留的胞浆。所述的吐温20和盐酸的混合溶液的为10 μ L质量浓度O. 01%的吐温20、10 μ L摩尔浓度O. OlN的盐酸和10 μ L水混合的混合溶液。所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液为甲醇和冰醋酸按照体积比3:1的比例混合的混合溶液。所述的吐温20和盐酸的混合溶液的温度为35_38°C。本发明所述的方法是对吐温20/盐酸(Tween-20/HCl)法进行了改良，省去了细胞低渗步骤，同时在37°C显微镜热台上观察细胞固定以节约固定时间。即卵裂球不经1%乙酸钠低渗处理，直接在PBS中漂洗后移至载玻片标定区域内的1-2 μ L的
O.01%Tween-20/0. OlN HCl溶液中(37°C显微镜热台上)，液体自然蒸发过程中观察细胞膨胀、破裂、核游离，若细胞膜未完全破裂，可重复滴加Tween-20 /HCl溶液。待细胞膜破裂、细胞核游离、干燥后再在载玻片上滴几滴甲醇/冰醋酸液除去残留的胞浆。本发明所述方法，经反复多次显微观察以及杂交实验证明，均取得了相同或者相近的结果，表明该方法稳定可靠，固定率高，固定所得的单细胞杂交效果良好，且操作简单闻效，有关试验资料如下
在显微镜下观察，发现将活检后的单个卵裂球直接置于37°C的Tween-20/HCl中，细胞膜出现肿胀；置于35-38°C的显微镜热台上，液体不断蒸发，细胞膜逐渐肿胀、破裂，细胞核游离；经甲醇/冰醋酸液除去残留的胞浆，观察到有明显的完整细胞核结构，说明染色体DNA保留完整。实验I 本发明所述固定方法与现有卵裂球固定方法的比较
将288个细胞核明显的卵裂球，随机分为三组，使用三种不同的固定方法，A组甲醇/冰醋酸法；B组常规Tween-20/HCl法；C组本发明所述的改良后的Tween-20/HCl固定法。实验结果见表I :三组方法总共成功固定了 268个单细胞，其中固定成功率A组与B、C组间有显著差异(X2检验，X2 =6. 87,P =0. 032〈0. 05)，而B、C组间无显著差异Gd >
O.05)。如表I所示。
表I卵裂球分组固定的效果
权利要求
1.一种卵裂球单细胞的固定方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将单个卵裂球在磷酸盐缓冲液中漂洗，得漂洗的卵裂球细胞； (2)将步骤(I)所得卵裂球细胞移至载玻片的标定区域内，标定区域内滴加有l-2yL的吐温20和盐酸的混合溶液，将载玻片置于35-38°C的显微镜热台上，液体自然蒸发过程中观察细胞膨胀、细胞膜破裂、细胞核游离，若细胞膜未完全破裂，可重复滴加吐温20和盐酸的混合溶液； (3)待在显微镜下观察到步骤(2)中细胞的细胞膜破裂、细胞核游离后，停止滴加吐温20和盐酸的混合溶液，室温15-30°C下干燥后，再在载玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去残留的胞浆。
2.根据权利要求I所述的卵裂球单细胞的固定方法，其特征在于，所述的吐温20和盐酸的混合溶液为10 μ L质量浓度O. 01%的吐温20、10 μ L摩尔浓度O. OlN的盐酸和10 μ L水混合的混合溶液。
3.根据权利要求I所述的卵裂球单细胞的固定方法，其特征在于，所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液为甲醇和冰醋酸按照体积比3:1的比例混合的混合溶液。
4.根据权利要求I所述的卵裂球单细胞的固定方法，其特征在于，所述的吐温20和盐酸的混合溶液的温度为35-38°C。
全文摘要
本发明涉及一种卵裂球单细胞的固定方法，可有效解决现有技术操作繁琐，要求条件苛刻，难以掌握，细胞固定效果差的问题。解决的技术方案是将单个卵裂球在磷酸盐缓冲液中漂洗，移至载玻片的标定区域内，标定区域内滴加有1-2μL的吐温20和盐酸的混合溶液，将载玻片置于35-38℃的显微镜热台上，液体自然蒸发过程中观察细胞膨胀、破裂、核游离，若细胞膜未完全破裂，可重复滴加吐温20和盐酸的混合溶液；待观察到细胞膜破裂、细胞核游离后，停止滴加吐温20和盐酸的混合液，室温下干燥后，滴加甲醇和冰醋酸的混合液，除去残留的胞浆。本发明操作简单方便，容易掌握，细胞固定效果好，固定率高，简单高效，大大节省了人力和物力。
文档编号G01N1/28GK102706716SQ201210221309
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月30日 优先权日2012年6月30日
发明者孙莹璞, 宋文妍, 彭兆锋, 戴善军, 李刚, 石森林, 辛志敏, 郭艺红, 金海霞 申请人:郑州大学第一附属医院