专利名称：一种急性白血病的分型方法
技术领域：
本发明涉及一种急性白血病的分型方法，具体地说涉及一种利用在不同型的急性白血病中的独特分子标记物的不同对急性白血病的分型方法。
背景技术：
随着大量生物体全基因组序列的获得、特别是人类基因组序列草图的完成，人们发现基因表达异常是引起疾病的一个重要环节，cDNA微阵列分析方法证明其进行肿瘤分子特征研究的可行性，但mRNA水平与蛋白质水平并不是一一对应的关系，蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，并且疾病的发生可能与蛋白质修饰状态的改变有关，蛋白质研究是揭示人类自身生命活动和疾病机理的最终阶段。因此蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子，而且也成为大多数药物的药靶。蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平，但与以往蛋白质化学的研究不同，蛋白质组研究的对象不是单一或少数的蛋白，它着重的是从全面、整体、动态、定量的角度去研究基因的功能，利用蛋白质组研究方法从肿瘤细胞蛋白质表达的整体水平上全景式的透视细胞蛋白质表达变化，将更有助于了解肿瘤细胞的生物学特征，故利用蛋白质组学技术研究疾病的本质要比在基因组水平上的研究更能说明问题。因此，蛋白质组学是从结构基因组学转向功能基因组学研究的一个重要组成部分。近年来，蛋白质组学已经成为新世纪生命科学研究的前沿。蛋白质组学技术在研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面进行了有力的探索，为疾病的早期诊断、药靶的发现、疗效和预后的判断提供了重要依据。许多药物发挥作用靶标分子为蛋白质，药物开发一般基于疾病发生过程中特异性上调或下调的蛋白质的表达为候选靶标。利用蛋白质组学方法研究疾病的发生、发展机制、鉴定新的药靶，以及新的生物标志物，并用于指导临床试验。这不但为治疗各种疾病带来新的思路、策略，而且蕴藏着巨大的市场前景。
白血病是一种造血系统的恶性肿瘤，其主要表现为异常的血细胞(即白血病细胞)在骨髓或其它造血组织中进行性、失控制的异常增生，浸润全身各脏器组织，使正常血细胞生成减少，外周血白细胞有质和量的异常变化，从而产生相应的临床表现。白血病占恶性肿瘤总发病率的5％左右，白血病在我国被列为十大高发性肿瘤之一。全国性普查，我国白血病的发病率为2.62/10万。我国白血病在恶性肿瘤发生中，男性为第6位，女性为第8位。目前在急性白血病(acute leukemia，AL)治疗上，无论是成人急性非淋巴细胞白血病(ANLL)还是急性淋巴细胞白血病(ALL)，仍以化疗为主，虽多数患者能够取得完全缓解(或带瘤生存)，但难以根除微小残留病变，获得长期缓解，并且传统的化疗药物由于缺乏对肿瘤细胞特异性的识别，往往同时杀伤正常的造血干细胞，产生严重的中性粒细胞缺乏和血小板减少而危及生命。人们希望使用靶向治疗方法可以选择性地杀灭肿瘤细胞，最大限度地发挥治疗作用，而尽可能地减少传统化疗所具有的毒副作用。近年来在这方面相关的基础和临床研究引起了广泛关注。AL是一种具有特定生物学特征和预后特征的异质性疾病，其正确的分型对治疗方案选择、预后判断等具有十分重要的意义。最初的分型方法是基于不同的临床预后及微细的细胞核特征的差别。随着1976年引入FAB分型方案，以细胞形态学和细胞组织化学为基础进行AL的诊断和分型，FAB分型方案为目前最经典和广泛应用的分型方案，但由于白血病细胞的异质性大，很容易造成分型误差，其对白血病分型的正确率仅为60-70％，免疫表型分析、细胞遗传学和分子遗传学持术的发展进一步补充了FAB分型方案的不足。但是，目前AL的分型方案仍存在不足和易发生错误，最为重要的是现存的分型方案忽略了对临床治疗策略的制定、预后判断等重要指导意义的白血病细胞生物学特征的反映。
AL发生是一个多基因参与、多阶段的复杂过程，但癌变的机理仍然不大清楚，从蛋白质整体水平上研究AL将有助于进一步揭示AL的发病机制，发现AL特异性的标志物及其药物治疗的靶标。并且应用新兴的蛋白质组学技术研究此过程有可能识别癌变相关蛋白质，对提示白血病转化机制具有重要的意义。而不同类AL的独特生物学特征是由于其蛋白表达谱改变所致。具有不同蛋白质表达特征的白血病细胞其具有不同的临床生物学特征，包括对化疗药物的反应，在临床上有可能据此设计对某种白血病细胞特异的、毒性相对较小的治疗方案。结合现有胞浆抗原检测，已经认识到以前诊断的某些未分化型白血病，其实有确定的谱系，故对胞浆蛋白质的研究对发现特异蛋白质标志物有重要的开发前景。目前对FAB分型的各型特定蛋白质表达谱(the distinct protein profiles，DPPs)仍不清楚。通过特定蛋白质表达谱对白血病进行分型目前在国内外未见报道。

发明内容
本发明的目的是通过找到AL特异性的蛋白质分子，作为AL的特异性分子标记物，通过体外的试验检测，提供一种用于AL分型的方法。
本发明的不同型的急性白血病的特异性的分子标记物是通过以下方法筛选的。利用固相PH梯度双向凝胶电泳分离以FAB分型为基础对各型AL细胞及正常白细胞的总蛋白质，凝胶经显色后，利用ImageMaster 2D图象分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)得到相应的肽质指纹图谱(peptide massfingerprint，PMF)，然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。实验结果如下本发明中的各标本AL细胞数均在90％以上，正常淋巴细胞和中性粒细胞比例在90-95％之间。得到分辨率较高、重复性较好的M1，M2，M3，M4，M5和ALL和正常淋巴细胞和中性粒细胞的2-DE图谱。经ImageMaster 2-D Elite3.0软件分析，每块胶大约可观察到1100个左右蛋白点。同一亚型的不同标本2-DE图谱非常相似，其匹配率为85％-95％之间，不同亚型标本的2-DE图谱有明显的不同，其匹配率60％和70％之间。对差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析，获得了以FAB分型为基础的各型AL特异性DPPs。发明人发现了一些已报导过的与白血病分型和发生相关的蛋白，如髓系过氧化物酶(MPO)、Op18(oncoprotein 18)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen，PCNA)等，证明本发明实验体系的可靠性；同时发明人又新发现了一些AL与正常白细胞差异表达蛋白及AL各型间差异表达蛋白。与正常白细胞(NWBCs)相比，一些与正常细胞功能相关的蛋白如MLC-2和MLC-3及基质金属蛋白酶(MMPs)在AL细胞低表达。AML与ALL差异表达蛋白，包括，转录调节相关蛋白(高移动群蛋白HMG andTy5同源物抑制蛋白Supt5H)，耐药相关蛋白，糖化蛋白I，磷酸甘油激酶(PGK1)，分子伴侣(热休克蛋白HSP70，cyclophilins)和RNA识别蛋白(UP1)。发明人也发现一些在ALL中高表达，而在AML和NWBCs中低表达或不表达得到蛋白质，包括Bridgingintegrator-2。另外，如磺基转移酶，磷脂蛋白A2(P36)，乙酰化磷酸核糖转移酶和HSPC124在M5中表达，而在AL的其它亚型中不表达。蛋白酶3、Azurocidin和cationic antimicrobial peptides未在低分化M1中表达，在所有ALL中均无表达，仅在M2、M3和分化的正常中性粒细胞中高表达。延伸因子2和RhoG在M2中高表达。cathepsin G仅在M3中表达，未见在其它类型AL中表达。与其它亚型AL相比，非转移细胞1蛋白non-metastaticcells 1 protein(NM23-H1)在M3型中低表达，进一步显示在M3a中NM23-H1表达与NWBC表达量一样，与M3b有明显差别。在临床观察中，M3a的预后好于其它类型AL，提示NM23-H1是一个重要预后判断的因素。磷酸化OP18在M1型白血病及ALL中高表达，提示其与原始细胞高度增殖特征有关。
本发明实验结果显示白血病的发生是多种致病因素起作用，通过对白血病细胞DPP的不断深入研究，发现FAB AL亚型的疗效与预后存在明显的异质性。各型白血病之间不仅存在不同致病机理，而且药物代谢特点上也存在着差异。本发明针对FAB诊断标准的缺点在FAB分型的框架下，以白血病细胞生物学特征为主线进行白血病细胞DPP的研究，使其更能适合现代白血病治疗策略的制定。DPP分析将AL诊断、治疗策略制定、预后以及发病机制研究中的地位提高到一个新的高度。本发明包括三套DPP，一是可以了解正常细胞与白血病细胞之间的生物学差别；二可以确定白血病的系属髓系或淋巴系白血病；三可认进一步确定系内亚型。各型AL DPP有助于通过体外实验进行AL的分型、鉴别诊断及指导治疗。
实验例3测试喷嘴堵塞将根据实施例1-6和比较例1-6制备的墨水组合物置于SAMSUNGELECTRONICS CO.墨盒M-50上，在环境温度(25℃)和低温(-18℃)保持2周，然后如下评定喷嘴堵塞的程度，喷嘴堵塞以致于当用印刷机(MJC-2400C，由SAMSUNG ELECTRONICS CO.生产)在常用纸(PREMIUM COPY PAPER，由SAMSUNG ELECTRONICS CO.制造)上印刷时其不能喷射墨水，结果示于下表5中。
表5

○所有喷嘴没有观察到堵塞△观察到1或2个喷嘴堵塞×观察到多于3个喷嘴堵塞从表5可以看出根据本发明的墨水组合物即使储存在环境温度或低温后也可以使用，而喷嘴没有堵塞。特别地，对于比较例1、2和4中制备的墨水组合物，出现1或2个喷嘴堵塞，或多于3个喷嘴堵塞，然而对于根据实施例1、2和4的墨水组合物，没有出现喷嘴堵塞，实施例1，2和4使用了根据本发明的可自分散炭黑颜料，其中亲水基团引入到在比较例1、2和4中使用的常用炭黑颜料中。从该结果可以看出根据本发明制备的可自分散颜料提供了与常规颜料的长期储存稳定性相比显著改进的长期储存稳定性。
根据本发明的可自分散着色剂可以由通过一步方法将亲水基团引入着色剂而制备，从而，制备根据本发明的可自分散着色剂的方法所需成本可以显著降低。包含根据本发明的可自分散着色剂的墨水组合物由于即使在

注1-11为与正常血细胞相比，在AL中高表达的蛋白，12-29为在AL中低表达的蛋白二、以FAB分型为基础的各型特定蛋白质表达谱(the distinct proteinprofiles，DPPs)中新发现的蛋白质如下表所示1、AML(主要是M1-M5型AML)中高表达的蛋白


2、急性淋巴细胞白血病(ALL)中高表达的蛋白

3、急性粒细胞白血病(M1-M3型AML)中高表达蛋白；


4、M5型急性白血病中高表达的蛋白

5、M2和M3型急性白血病中高表达的蛋白

6、M2中高表达的蛋白

7、M3型急性白血病中高表达的蛋白

注7，12，13为在M3中低表达的蛋白随着研究方法和手段的不断进展，急性白血病的治疗已从过去单一依靠化疗杀灭白血病细胞向特异性治疗方向转变，此特异性治疗的基础是对白血病的发病机制及其病理生理过程的深入了解，更大程度地选择性杀伤肿瘤细胞，减少对正常造血干细胞的抑制作用，降低对全身其他脏器的毒副作用。
本发明从细胞功能的直接执行者-蛋白质水平进行急性白血病(AL)分型，这样更能反映AL的生物学特征，本发明发现一组AL与正常细胞差异表达的蛋白质，并发现了以FAB分型为基础的各型AL的蛋白质差异表达谱(DDP)。本发明对于筛选潜在的针对白血病等肿瘤的药物靶标分子和功能蛋白质，研制和开发新的AL治疗药物，具有重要的意义，有巨大的市场前景和社会与经济效益。
权利要求
1.一种急性白血病的分型方法，其特征在于通过筛选不同型的白血病的特异性的分子标记物，组成各型急性白血病的特定蛋白质表达谱，利用该特定蛋白质表达谱进行急性白血病分型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中筛选不同型急性白血病的特异性分子标记物的方法包括如下步骤(1)利用双向凝胶电泳分离各型急性白血病细胞及正常白细胞的总蛋白质；(2)利用图象分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质；(3)应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱；(4)鉴定部分差异蛋白质点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特定蛋白质表达谱包括以下三种(1)确定正常细胞与急性白血病细胞之间的生物学差别的特定蛋白质表达谱；(2)确定急性白血病的系属髓系或淋巴系白血病的特定蛋白质表达谱；(3)确定急性白血病系内亚型的特定蛋白质表达谱。
4.根据权利要求3所述的方法，其中确定正常细胞与急性白血病细胞之间的生物学差别的特定蛋白质表达谱包括如下蛋白质(1)PTK9L protein tyrosine kinase 9-like(A6-related protein)；(2)guanine nucleotide binding protein(G protein)(3)Rho GDP dissociation inhibitor(GDI)alpha(4)BCL2-associated athanogene 5；BAG-family molecular chaperone regulator-5(5)TNF inhibitory protein(TIP)(6)voltage-dependent anion channel 2(7)heat shock 27kDa protein 1(HSP 27)(8)apoptosis inhibitor homolog(IAP)(9)Similar to proteasome(prosome，macropain)subunit，alpha type，(10)peroxiredoxin 6；antioxidant protein 2(AOP2)(11)peroxisomal enoyl-CoA hydratase 1(12)ras suppressor protein 1(13)glutathione-S-transferase like；glutathione-S-transferase omega(GST)(14)Chain A，Manganese Superoxide Dismutase(MnSOD)(15)myosin regulatory light chain(MRCL2)(16)similar to Homo sapiens mRNA for KIAA0120 gene with GenBankAccession Number D21261.1(17)myosin regulatory light chain MRCL3(18)GDP dissociation inhibitor 2；(19)actin related protein 2/3 complex subunit 5(20)Chain A，Dimeric Form Of The Haemopexin Domain Of Mmp9(21)Lactoferrin(22)unnamed protein product(23)S100 calcium-binding protein A12(24)Chain A，Crystal Structure Of The Mrp 14 Complexed With Chaps(25)CFAg(AA 1-94)(26)5′-methylthioadenosine phosphorylase(27)endoplasmic reticulum protein 29 precursor(28)Chain B，Crystal Structure Of A Rac-Rhogdi Complex(29)Chain A，Carboxylic Ester Hydrolase，P 1 21 1 Space Group其中(1)-(11)为与正常血细胞相比，在急性白血病细胞中高表达的蛋白质，(12)-(29)为在急性白血病细胞中低表达的蛋白质。
5.根据权利要求3所述的方法，其中确定急性白血病的系属髓系或淋巴系白血病以及系内亚型的特定蛋白质表达谱包括如下蛋白质(1)AML(主要是M1-M5型AML)中高表达的蛋白(1)Uracil DNA glycosylase(2)Hypothetical protein XP_297896(3)BC37295_1(4)Coding sequence(5)Vimentin(6)Unnamed protein product(7)Coactosin-like 1(8)Cytochrome oxidase subunit VIb(9)ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F1 complex(10)Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(11)Heat shock 70kDa protein 8 isoform 2；(12)F-actin capping protein beta subunit；Cap Z(13)Chain A，Crystal Structure Of The Mrp 14 Complexed With Chaps(14)S100 calcium-binding protein A8(Mrp8)(15)glyoxalase I(16)annexin I；lipocortin I(17)phosphoglycerate kinase 1(18)Proteasome beta subunit(19)adenylate kinase，mitochondrial；ATP-AMP transphosphorylase(20)Chain A，structure of up 1-telomeric dna Complex(21)Up1，The Two Rna-Recognition Motif Domain Of Hnrnp A1(22)Nit protein 2(23)Aldolase A(2)急性淋巴细胞白血病(ALL)中高表达的蛋白(1)immunoglobulin heavy chain(2)stathmin；leukemia-associated phosphoprotein p18(OP18)(3)bridging integrator 2；breast cancer associated protein BRAP1(3)急性粒细胞白血病(M1-M3型AML)中高表达蛋白(1)dnaK-type molecular chaperone HSPA5 precursor(2)similar to ribosomal protein S12；40S ribosomal protein S12(3)fatty acid binding protein 5(psoriasis-associated)；E-FABP(4)actin gamma(5)alpha enolase(6)beta5-tubulin(7)BiP protein(8)3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，isoform 2(9)Suppressor of Ty 5 homolog(SupT5H)(10)Peroxiredoxin 2；Thiol-specific antioxidant protein)(TSA)(11)glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(phosphorylating)(12)CDC42 GAP-related protein(13)similar to VENT-like homeobox 2；haemopoietic progenitor homeobox(4)M5型急性白血病中高表达的蛋白(1)adenine phosphoribosyltransferase；AMP pyrophosphorylase；(2)annexin A2；annexin II(lipocortin II)；(3)HSPC124(4)sulfotransferase family，cytosolic，1A，(5)unnamed protein product(6)inorganic pyrophosphatase 2 isoform 2(7)hypothetical protein(8)Unknown(protein for MGC27221)(5)M2和M3型急性白血病中高表达的蛋白(1)Chain A，Cyclophilin B(2)vimentin(3)unnamed protein product(4)annexin I；lipocortin I(6)M2中高表达的蛋白(1)elongation factor 2(2)Small GTP binding protein RhoG(7)M3型急性白血病中高表达的蛋白(1)unnamed protein product(2)Chain A，Human Cathepsin G(3)Human Heparin Binding Protein(4)Chain A，Fkbp-Rapamycin Binding Domain(Frb)Of TheFkbp-Rapamycin Associated Protein(5)azurocidin(6)similar to retinoic acid，EGF，and NGF upregulated；REN(7)non-metastatic cells 1 protein(8)S100 calcium binding protein A 11(calgizzarin)(9)RNA-binding protein regulatory subunit；oncogene DJ1(10)transferrin(11)Chain B，Nmr Structure Of PCAF Bromodomain(12)isocitrate dehydrogenase 3(NAD+)alpha precursor(13)eukaryotic translation initiation factor 5A；(eIF5A)其中(7)(12)(13)为在M3中低表达的蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种急性白血病的分型方法，具体地说公开了一种利用不同型的急性白血病的特异性分子标记物不同对急性白血病分型的方法。筛选特异性的分子标记物包括利用双向凝胶电泳分离各型急性白血病细胞及正常白细胞的总蛋白质，利用图象分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质，应用质谱分析鉴定部分差异蛋白质点。通过本发明筛选得到的各型急性白血病特异性的分子标记物组成的特定蛋白质表达谱，来对急性白血病进行分型，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/558GK1619311SQ20031011502
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者王冠军, 张学敏, 崔久嵬, 王杰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心, 吉林大学第一医院