专利名称：检测膀胱癌的装置的制作方法
技术领域：
本发明关于一种用于检测膀胱癌的装置，尤其关于一种用于检测受检者尿液中的类Polo激酶2 (Polo-like kinase 2，PLK2)，以判断受检者是否罹患膀胱癌的装置。
背景技术：
膀胱癌是最常发生于泌尿系统中的恶性肿瘤，全球每年约有十万人罹患膀胱癌， 其中四分之三为男性，且以中老年人居多。一般认为膀胱癌的发生与饮食、抽烟或化学致癌物质(例如砷)等因素有关。膀胱癌于早期并无明显症状，一旦出现无痛性血尿、尿频、尿痛、小腹胀痛、排尿困难等症状时，通常已进入膀胱癌的中晚期，而膀胱癌肿瘤发展快，且易进行远处及多处的转移，故一旦发现罹癌时，往往已无法有效地进行治疗。此外，膀胱癌的复发率高，更使其难以根治。因此，若能于膀胱癌早期即发现罹癌，则可提升治愈率，此更突显膀胱癌筛检的重要性。目前常见的膀胱癌检测方法包括非侵入性(non-invasive)的尿液细胞学(urine cytology)检查、以及侵入性(invasive)的膀胱镜检查与病理组织切片检查。其中，以细胞形态判读为依据的尿液细胞学检查的灵敏度与准确度均偏低，对于低度变异的细胞往往无法进行判别，因而影响筛检结果。至于膀胱镜检查及病理组织切片检查，其灵敏度与准确度虽较高，但检测费用昂贵，且会造成受检者的痛苦。因此，临床上仍亟须一种可方便、快速且准确地检测膀胱癌的方法。本发明即针对上述需求所为的研究，本发明发明人发现膀胱癌患者尿液中具有高浓度的类Polo激酶2(Polo-like kinase 2，PLI^)，从而开发一种检测膀胱癌的装置，其可用于快速且精确地筛检膀胱癌。

发明内容
本发明的目的在于提供一种可方便、快速且准确地检测膀胱癌的装置。为达到上述目的，本发明采用的技术手段如下一种用于检测膀胱癌的装置，包含一样本接受垫，用于吸收一尿液样本；一检测试剂垫，连接至该样本接受垫，且包含一类polo激酶2 (Polo-like kinase 2,PLK2)的第一抗体、以及一与该第一抗体结合的金属颗粒；一显示膜，其连接至该检测试剂垫，且包含一检验区及一品质管控区；以及一吸收垫，其连接至该显示膜的该品质管控区，其中，该检验区位于该品质管控区与该检测试剂垫之间，且包含一固定于该检验区上的蛋白质，及一结合至该蛋白质上的类Polo激酶2，且其中该品质管控区包含一固定于其上的第二抗体，其是该第一抗体的抗体。本发明的有益效果在于本发明一种检测膀胱癌的装置利用膀胱癌患者尿液中具
3有高浓度的类Polo激酶2 (Polo-like kinase 2，PLI^)，能够快速且精确地筛检膀胱癌。本发明的详细技术及较佳实施形态，将配合附图式而描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。


图1是本发明装置的上视图；图2是本发明装置的剖面图；图3是本发明装置的连接示意图；图4是本发明的一实施形态的剖面图；图5是本发明装置的作用原理的示意6是本发明装置呈阳性反应的示意7是本发明装置呈阴性反应的示意图。主要元件符号说明1样本接受垫6粘着剂3显示膜8第一抗体9金属颗粒-第一抗体复合体4吸收垫11第二抗体
具体实施例方式除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求中)所使用的“一”、“该” 及类似用语应理解为包含单数及数个形式。类Polo激酶(Polo-like kinase，下文简称为PLK)属于丝胺酸/苏胺酸蛋白质激酶家族(serine/threonine protein kinase family)，其于细胞周期中扮演多种角色，例如调节中心体(centrosome)的发育。于PLK中，类Polo激酶2 (Polo-like kinase 2，下文简称为PLK2)极为重要，因其可调控细胞周期与细胞凋亡的进程，且可能与B细胞淋巴癌有关(ift pJ#JAL Syed et al. !Transcriptional silencing of Polo-like kinase 2 (SNK/ PLK2) is a frequent event in B-cell malignancies. Blood 2006 ；107 :250-256.该文献全文并于此处以供参考)。本发明人利用尿液检体易于取得的便利性，以及膀胱癌患者尿液中具有高浓度的PLK2的特性，使用PLK2作为膀胱癌的生物肿瘤标记，而开发一种用于检测膀胱癌的装置。以下将参照图1及图2以说明根据本发明装置的一实施形态，其中，图1及图2分别为该实施形态的上视图及剖面图。如图1所示，根据本发明的用于检测膀胱癌的装置，包含样本接受垫1、检测试剂垫2、显示膜3、以及吸收垫4，且显示膜3包含检验区3A及品质管控区:3B。样本接受垫1用于吸收受检者的尿液样本，以供进行尿液中PLK2的检测。于此， 样本接受垫1可以滴入尿液样本或浸泡至尿液样本中的方式来吸收该样本；较佳地，以滴入尿液样本的方式吸收该样本，因相较于浸泡方式，滴定方式可更为精确地控制受测样本的量，使检测结果具有更高的准确性。样本接受垫1采用对尿液具良好吸收性的材料。举例言之，于本发明一实施形态中，以纤维素纤维作为样本接受垫的材料。
检测试剂垫2连接至样本接受垫1，其包含一 PLK2的第一抗体以及一与该第一抗体结合的金属颗粒。该第一抗体的来源并无特别限制，其可利用一般基因选殖技术或使用胜肽合成仪来制得；也可采用将PLK2接种至一动物体内，使其产生PLK2抗体的方法来获得该第一抗体。此外，该第一抗体经该金属颗粒标定(label)，两者结合而形成一金属颗粒-第一抗体的复合体。此复合体的第一抗体可与PLK2结合，进一步形成一金属颗粒-第一抗体-PLK2的复合体，其可因金属颗粒与PLK2间发生反应而呈色。于检测试剂垫2中，由于金具有良好的生物相容性，且易经由蛋白质(或抗体)上的硫氢基(-SH)而与蛋白质(或抗体)结合，故可采用金颗粒作为所需的金属颗粒。一般采用具纳米等级尺寸的金属颗粒，较佳为粒径不大于100纳米者，更佳为不大于80纳米，例如粒径在15纳米至80纳米的范围。此外，可使用任何合宜的材料以提供检测试剂垫2，只要其可提供所欲的尿液吸收性。举例言之，于本发明一实施形态中，以玻璃纤维提供检测试剂垫。显示膜3用于呈现或显示本发明装置的检测结果，以供判断受检者是否罹患膀胱癌。显示膜3连接至检测试剂垫2，且包含检验区3A及品质管控区:3B，其中，检验区3A位于品质管控区3B与检测试剂垫2之间。检验区3A包含一固定(immobilize)于其上的蛋白质，及一结合至该蛋白质上的 PLK2。该蛋白质的功能类似于锚，可使PLK2固定于检验区3A上。该蛋白质的种类并无特别限制，举例言之，于本发明一实施形态中，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 作为该固定于检验区3A上的蛋白质。借助该蛋白质固定于检验区3A上的PLK2，用于捕捉位于检测试剂垫2但随检测样本传送至检验区3A，且尚未与PLK2反应的金属颗粒-第一抗体复合体。品质管控区IBB包含一固定于其上的第二抗体，其是该第一抗体的抗体。该第二抗体用于捕捉第一抗体，并进行呈色反应，以供确认第一抗体的反应活性，借此检视本发明装置的有效性。该第二抗体的来源并无特别限制，其可利用一般基因选殖技术或使用胜肽合成仪来制得；也可采将第一抗体接种至一动物体内，使其产生第一抗体的抗体来获得该第二抗体。可使用任何合宜的材料以提供显示膜3，举例言之，于本发明一实施形态中，以硝化纤维素(nitrocellulose)作为该显示膜的材料。吸收垫4连接至显示膜3的品质管控区3B，其用于提供本发明装置的毛细流动 (capillary flow)或横向流动(lateral flow)的驱动力，故其对尿液样本的吸收能力较样本接受垫1、检测试剂垫2及显示膜3为强。较佳地，于本装置中，各区的吸收能力为吸收垫4 >品质管控区:3B检验区3A检测试剂垫2 >样本接受垫1，以使尿液可轻易地自样本接受垫1往吸收垫4的方向移动，使本发明装置发生作用。可使用任何合宜的材料以提供吸收垫4，举例言之，于本发明一实施形态中，以纤维素纤维作为吸收垫4的材料。一般而言，本发明装置中的样本接受垫1、检测试剂垫2、显示膜3及吸收垫4，如图1及图2所示般地呈一长条状的形式。于此，较佳地，如图3中虚线处所示，于各相邻区的连接处以交互重叠的方式连接，以提供更为紧密的接合。此外，如图4所示，本发明装置可更包含一背衬5，以支撑样本接受垫1、检测试剂垫2、显示膜3及吸收垫4，其中，可通过一粘着剂6，使样本接受垫1、检测试剂垫2、显示膜3及吸收垫4得以粘附于背衬5上，使彼此更紧密连接。以下将参照图5、图6及图7，以进一步说明本发明装置的作用。就膀胱癌患者而言，当将其尿液样本滴定至样本接受垫1，或将样本接受垫1浸泡于尿液样本中，然后横置本发明装置时，尿液会借助毛细作用原理以及吸收垫4所提供的驱动力，向吸收垫4的方向移动。当尿液移动至检测试剂垫2时，因膀胱癌患者尿液中具有高浓度的PLK2，其会与检测试剂垫2中由金属颗粒7与第一抗体8所组成的金属颗粒-第一抗体复合体9结合，而形成一金属颗粒-第一抗体-PLK2复合体。此复合体会随着尿液继续移动至显示膜3的检验区3A。于此，由于此复合体上的第一抗体8已与尿液样本中的PLK2结合，故不会与固定于检验区3A上的PLK210结合，因此，此复合体会继续往品质管控区:3B的方向移动；而固定于检验区3A上的PLK210则因无法与第一抗体8结合，遂无法与金属颗粒7反应而呈色，因此，在检验区3A处不会有呈色反应。随后，当金属颗粒-第一抗体-PLK2复合体移动至品质管控区:3B时，固定于品质管控区:3B上的第二抗体11会与此复合体上的第一抗体8结合， 使该复合体固定于品质管控区3B处而呈色，至于过量而无法与第二抗体11结合的复合体则继续往吸收垫4移动。因此，对于罹患膀胱癌的受检者而言，其尿液样本经本发明装置的检测分析后，会于显示膜3上呈现单一色带，即于品质管控区:3B所呈现的色带(如图6所示)，说明第一抗体具有反应活性，故本发明装置工作正常，且也说明此测试结果为膀胱癌的阳性反应。另一方面，就正常受检者(即，未罹患膀胱癌的受检者)而言，当将其尿液样本滴定至样本接受垫1，或将样本接受垫1浸泡于其尿液样本中，然后横放本发明装置时，尿液会借助毛细作用原理以及吸收垫4所提供的驱动力向吸收垫4的方向移动。当尿液移动至检测试剂垫2时，因膀胱癌患者尿液中不具有PLK2，或PLK2浓度过低，故检测试剂垫2中由金属颗粒7及第一抗体8所组成的金属颗粒-第一抗体复合体9以未与PLK2结合的形式， 而随着尿液移动至显示膜3的检验区3A。于此，金属颗粒-第一抗体复合体9上的第一抗体8会与固定于检验区3A上的PLK210结合，使金属颗粒-第一抗体复合体9固定于检验区3A处，且使PLK210与金属颗粒-第一抗体复合体9上的金属颗粒7发生反应而呈色，因而在检验区3A处发生呈色反应，而出现一色带。随后，过量而无法与固定于检验区3A上的 PLK210结合的金属颗粒-第一抗体复合体9会继续往品质管控区:3B的方向移动，当其移动至品质管控区3B时，固定于品质管控区:3B上的第二抗体11会与金属颗粒-第一抗体复合体9上的第一抗体8结合，使金属颗粒-第一抗体复合体9固定于品质管控区:3B处而呈色，过量而无法与第二抗体11结合的金属颗粒-第一抗体复合体9则继续往吸收垫4移动。 因此，对于正常受检者而言，其尿液样本经本发明装置的检测分析后，会于显示膜3上呈现两个色带，即于检验区3A与品质管控区:3B所呈现的色带(如图7所示)，说明第一抗体具有反应活性，故本发明装置工作正常，且也说明此测试结果为膀胱癌的阴性反应。于任何情形中，若品质管控区3B未呈现色带，则代表该装置失效，须重新使用另一装置再行检测。综上，本发明提供一种检测膀胱癌的装置，其可方便、快速且准确地进行膀胱癌的早期检测，且可用于监测膀胱癌是否复发。兹以下列具体实施形态以进一步例示说明本发明。其中该些实施形态仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。制备例
依以下步骤制备本发明装置中的样本接受垫、检测试剂垫、显示膜、以及吸收垫。制备样本接受垫及吸收垫样本接受垫及吸收垫使用一材质为非织物、100%纯纤维素纤维的垫片(C048， Millipore，马萨诸塞州，美国)。样本接受垫裁成15X300毫米的尺寸，并使其浸泡于一包含20毫摩尔浓度/公升硼酸钠、2. 0重量/体积％蔗糖、2. 0重量/体积％牛血清白蛋白、 以及0. 1重量/体积％叠氮化钠的缓冲液(pH 8. 0)中，再于56°C下干燥1小时。吸收垫则裁成40X300毫米的尺寸。将样本接收垫及吸收垫置于室温下，以干燥剂储存。制备检测试剂垫使用一含有8. 75重量/体积％蔗糖、8. 75重量/体积％牛血清白蛋白、0. 6摩尔/ 公升氯化钠、10毫摩尔/公升乙二胺四乙酸(EDTA)、及0. 1重量/体积％叠氮化钠的硼酸钠缓冲液(PH 8. 0,20毫摩尔/公升)稀释胶体状的经金(Ag)结合标定的PLK2的单株抗体至最终浓度为2微克/毫升，以制备一检测试剂溶液。将一尺寸为7X300毫米的玻璃纤维垫(型号GFCP203000，4004311，MillipOre，马萨诸塞州，美国)浸泡于该检测试剂溶液中，再于56°C下干燥1小时，以制备一检测试剂垫。将该检测试剂垫置于室温下，以干燥剂储存。制备显示膜[制备检验区试剂]利用一般基因工程技术将PLK2连结至牛血清白蛋白上(即，PLK2-BSA)，以作为检验区的试剂。将5毫克PLK2-BSA溶于4毫升氯化氢(0. 01摩尔/公升，冷却至0至5°C ) 中，并与10毫克亚硝酸钠混合。于4°C下搅拌该混合物达6小时后，添加2毫升磷酸盐缓冲液(0. 1摩尔/公升，pH 8. 6，含有20毫克牛血清白蛋白)，并于4°C下再次搅拌该混合物达6小时。将所得溶液置于室温下一夜，再以kphadex G_50 (购自Roche公司，美国)过滤或以透析方式(使用一磷酸盐(PBS)缓冲液(含有8公克氯化钠、0. 2公克氯化钾、1. 44 公克磷酸氢二钠、0. 24公克磷酸二氢钾(溶于1公升二次水中)纯化PLK2-BSA，即制得检验区的试剂。[制备品质管控区试剂]使用羊的抗老鼠免疫球蛋白(Goat anti-mouse immunoglobulin)作为品质管控区的试剂。以两星期一次的周期，将老鼠的PLK2抗体(即第一抗体)的免疫球蛋白G(先以Freund’ s complete佐剂(Pierce，伊利诺伊州，美国)进行均质化一次，再以Freund’ s incomplete佐剂进行其余均质化程序)接种至一羊体内，使其产生抗体(即第二抗体)，共进行四次。在最后一次接种后，使该羊流血达14天，并收集血清。根据产品说明，使用一蛋白质-G亲合性管柱(protein-G affinity column，Amersham Biosciences,Uppsala, J^dr) 自血清中纯化出羊的抗老鼠免疫球蛋白G抗体(第二抗体)，即制得品质管控区的试剂。[固定检验区与品质管控区的试剂]将以上制备的BSA-PLK2与羊的抗老鼠免疫球蛋白G分别以PBS稀释至1. 0毫克/ 毫升的浓度，并使用一连接至XYZ Biostrip分散器(Bio-Dot，加州，美国)的Quanti 3000 Biojets,以50点/微升/厘米的点状形式，分别施用及固定BSA-PLK2与羊的抗老鼠免疫球蛋白 G 至一膜(HiFlow Plus Cellulose Ester Membrane，300X 25 毫米，Millipore， Bedford，马萨诸塞州，美国)上，以完成包含一检验区与一品质管控区的显示膜。该显示膜的毛细流动时间(capillary flow time)为180秒/4厘米，且厚度为135微米。于40°C下干燥1小时后，将该显示膜密封并置于干燥环境及室温下储存。组装本发明的装置于一塑料衬板上依序粘贴以上制得的样本接受垫、检测试剂垫、显示膜与吸收垫， 并于两端覆盖彩色薄膜，再使用一 CM 4000裁切器(Bio-Dot，加州，美国)将粘贴好的垫片裁切成3毫米宽的长条，即制得本发明的装置。将本发明装置密封于一塑料袋中，并以干燥剂储存于4°C下备用。上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如后述的申请专利范围所列者。
8
权利要求
1.一种用于检测膀胱癌的装置，其特征在于包含一个样本接受垫，用于吸收尿液样本；一个检测试剂垫，连接至该样本接受垫，且包含一类Pol0激酶2 (Polo-like kinase 2,PLK2)的第一抗体、以及一个与该第一抗体结合的金属颗粒；一个显示膜，其连接至该检测试剂垫，且包含一个检验区及一个品质管控区；以及一个吸收垫，其连接至该显示膜的该品质管控区，其中，该检验区位于该品质管控区与该检测试剂垫之间，且包含固定于该检验区上的蛋白质，及结合至该蛋白质上的类Polo激酶2，且其中该品质管控区包含固定于其上的第二抗体，该第二抗体是该第一抗体的抗体。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该样本接受垫及该吸收垫的材料是纤维素纤维。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该检测试剂垫中的金属颗粒的粒径为小于或等于100纳米。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，该检测试剂垫中的金属颗粒的粒径为小于或等于80纳米。
5.如权利要求3或4所述的装置，其特征在于，该检测试剂垫中的金属颗粒是金颗粒。
6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该检测试剂垫的材料是玻璃纤维。
7.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该固定于该检验区上的蛋白质是牛血清白蛋白(bovine serum albumin)。
8.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该显示膜的材料是硝化纤维素 (nitrocellulose)。
9.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该样本接受垫供以浸泡尿液样本的方式来吸收该样本。
10.如权利要求1所述的装置，其特征在于，该样本接受垫供以滴入尿液样本的方式来吸收该样本。
全文摘要
一种用于检测膀胱癌的装置，其包含一样本接受垫，用于吸收一尿液样本；一检测试剂垫，连接至该样本接受垫，且包含一类Polo激酶2的第一抗体、以及一与该第一抗体结合的金属颗粒；一显示膜，连接至该检测试剂垫，且包含一检验区及一品质管控区；以及一吸收垫，其连接至该显示膜的该品质管控区，其中，该检验区位于该品质管控区与该检测试剂垫之间，且包含一固定于该检验区上的蛋白质，及一结合至该蛋白质上的类Polo激酶2，且其中该品质管控区包含一固定于其上的第二抗体，其是该第一抗体的抗体。本装置可方便、快速且准确地检测膀胱癌。
文档编号G01N33/558GK102338802SQ201010238919
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者陈黎明, 高忠汉 申请人:陈黎明, 高忠汉