专利名称：一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析测试领域，涉及一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用。
背景技术：
香兰素，3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，又称香草醛；甲基香兰素(Vanillin) 3，4-二甲氧基苯甲醛，又称藜芦醛、绿藜芦醛、香草醛甲醚；乙基香兰素(EthylVanillin)，3-乙氧基-4-羟基苯甲醛，又称乙基香草醛、乙基凡尼林，三者均为白色或微黄色结晶性粉末，微溶于水，溶于乙醇、甘油、乙醚、氯仿及香料中；皆具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是重要的食品添加剂，广泛用作食品、饮料以及日化用品等领域。但是，大剂量使用香兰素等香料将有害健康。目前，给婴儿添加配方奶粉成为世界各地普遍采用的做法，而婴幼儿是对有害物质最敏感的群体。近年来由于婴幼儿食品特别是配方奶粉的质量优劣或真假问题而引发的重大食品安全事件屡见不鲜。目前关于乙基香兰素的测定方法主要有分光光度法、电化学法、高效液相色谱法、气相色谱和气质联用法。这些分析方法具有高灵敏度和特异性的特点，但操作繁琐，需要精密仪器和受过专业培训的操作人员，且耗时长。而特异性的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。其中，胶体金免疫层析技术发展迅速，已被人们所熟知，与仪器分析法比较，胶体金层析技术具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作等优点。在胶体金免疫层析分析试纸的制备上，最为重要的环节是被测物的免疫源性物质，即被测物的免疫抗原和免疫抗体的制备，而制备高特异性的抗体首先是要有纯度较高，结构合理的免疫原。因此，研究和筛选特异性更强、灵敏度更高的乙基香兰素免疫分析抗原抗体和对于提高和完善本领域检测手段具有重要意义。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种乙基香兰素半抗原及其制备方法。本发明的目的之二提供一种乙基香兰素完全抗原及其制备方法，乙基香兰素完全抗原是在乙基香兰素半抗原的基础上进一步制备得到。本发明的目的之三提供一种乙基香兰素抗体及其制备方法。本发明的目的之四在于提供一种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸及其制备方法。本发明的目的还在于利用上述乙基香兰素半抗原、乙基香兰素完全抗原及乙基香兰素抗体在应用胶体金免疫层析分析技术检测乙基香兰素中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种乙基香兰素半抗原，具有如式(I)所示的结构:
权利要求
1.一种乙基香兰素半抗原，其特征在于具有如式(I )所示的结构:
2.权利要求1所述的乙基香兰素半抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将乙基香兰素和4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯溶解于强极性有机溶剂中，加入碳酸钾和四丁基碘化铵，15 25V反应12 16h ;反应结束后加入冰水溶解反应液,用乙酸乙酯萃取，水洗涤后收集有机相，干燥得到粗品； (2)将步骤(I)所得粗品溶于无水乙醇中，加入氢氧化锂15 25V反应2 4h，加水稀释，乙醚萃取，取下层，再加入酸调pH至4 6.0，有固体析出，经氯仿洗涤、抽滤、蒸干得到乙基香兰素半抗原。
3.根据权利要求2所述的乙基香兰素半抗原的制备方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的强极性有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或乙腈； 步骤(I)中所述的乙基香兰素、4-溴丁酸乙酯或5-溴戊酸乙酯、碳酸钾的摩尔比为1:1 2:3 5 ; 步骤(I)中所述的四丁基碘化铵的投料量为乙基香兰素质量的10 20% ； 步骤(I)中所述的干燥为通过30 40°C旋转蒸干20分钟干燥； 步骤(2)中所述的氢氧化锂的用量为乙基香兰素质量的20 40%。
4.一种乙基香兰素完全抗原，其特征在于具有如式(II)所示的结构:
5.权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 将权利要求1所述的乙基香兰素半抗原溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，加入DEC盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，15 25°C反应12 16小时，加入到由PBS溶解的载体物质溶液中，15 25°C下反应4 8小时，反应液用PBS在4 20°C下透析2 3天，离心收集上清液，冷冻干燥得乙基香兰素完全抗原； 所述的乙基香兰素半抗原、DEC盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与载体物质的摩尔比为1:1 2:1 2:0.05; 所述的载体物质为牛血清蛋白、鸡蛋白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白；所述的 PBS 为 10mM、pH7.2 7.4 的 PBS ； 所述的离心为4°C、8000r/min离心10分钟。
6.一种乙基香兰素抗体，其特征在于:所述的乙基香兰素抗体利用权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得。
7.权利要求6所述的乙基香兰素抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤:体外通过次黄嘌呤H、氨基蝶呤A和胸腺嘧啶核苷T选择性培养基筛选乙基香兰素杂交瘤细胞；通过ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液中抗体效价，选择高效价高特异性的孔扩大培养；将抗体阳性细胞进行有限稀释克隆筛选；选出只有一个克隆生长的孔，扩大培养，同样方法筛选三次以上，得到稳定分 泌抗体的阳性细胞株，即得到乙基香兰素抗体。
8.—种乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸，其特征在于包括垫衬和垫衬上依次搭接的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的金标垫包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体；所述的硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线区包被有乙基香兰素完全抗原，质控线区包被有羊抗鼠IgG多抗。
9.权利要求8所述的乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)金标垫的制备 用PBS将胶体金标记的乙基香兰素抗体配制成浓度0.5 1.0mg/mL的溶液,均勻地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为30 80μ L/cm2，25 37°C真空干燥12h ； (2)检测线和质控线的制备 检测线:用PBS将乙基香兰素完全抗原配制成浓度0.5 1.0mg/mL的溶液,喷在硝酸纤维素膜的检测区域上； 质控线:用PBS将羊抗鼠IgG多抗配制成浓度0.5 1.0mg/mL的溶液,喷在硝酸纤维素膜的质控区域上； 硝酸纤维素膜在50°C干燥12h ； (3)胶体金免疫层析分析试纸的组装 将样品垫、包被有胶体金标记的乙基香兰素抗体的金标垫、包被有乙基香兰素完全抗原和羊抗鼠IgG多抗的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接组装成测试条，将测试条置于垫衬上固定得到乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸； 步骤(I)和(2)中所述的PBS为10mM、pH7.2 7.4的PBS。
10.权利要求1所述的乙基香兰素半抗原、权利要求4所述的乙基香兰素完全抗原、权利要求6所述乙基香兰素抗体或权利要求8所述的乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸在检测乙基香兰素中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种乙基香兰素抗原和抗体的制备方法及其应用，属于免疫分析测试领域。乙基香兰素半抗原是在乙基香兰素的羟基上连接上一连接臂，其结构如式(Ⅰ)所示，R为碳链长度为C1～C6的亚烷基，X是羧基、巯基或氨基。乙基香兰素完全抗原在乙基香兰素半抗原的基础上偶联了载体物质而得到。再利用完全抗原制备杂交瘤细胞，通过特异性筛选、体外培养、纯化而获得其抗体。本发明通过抗原抗体高效特异性竞争结合特性，制备乙基香兰素检测用胶体金免疫层析分析试纸，具有灵敏度高、特异性强、简单快捷、易于操作等优点。
文档编号G01N33/566GK103172525SQ20131005151
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月17日 优先权日2013年2月17日
发明者丁焕中, 贾慧勤, 沈祥广, 古小燕, 曾振灵, 刘雅红, 黄显会 申请人:华南农业大学