专利名称：一种荧光标记试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光标记试剂(或称荧光标记探针)。
背景技术：
近年来，荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用。尤其作为分子探针在生命科学、超分子光化学方面的研究在全世界范围内备受瞩目，是目前热门的研究课题之一。众所周知，化学，生物学里的关键过程是分子识别和组装，对这些分子水平的微观过程的观测与研究对人类认识整个世界有极其重要的意义。经过特殊设计的荧光分子探针具有高灵敏度，高特异选择性，可进行实时单分子检测，安全方便等特点，可将微环境的变化信息转变为光信号，从而使人-分子的对话成为可能，架起宏观世界与微观世界的桥梁。除了作为强大的分析检测工具而外，荧光分子的另一个重要应用是作为分子开关中的光信号单元，由于能够对环境刺激作出荧光发射的“开”或“关”的控制，因此可能被应用为未来分子计算机的信息处理逻辑开关。
荧光团(即荧光染料母体)上引入活性基团，如琥珀酰亚胺，异硫氰酸酯，马来酰亚胺等，可以与生物分子上的氨基，巯基等基团通过共价键特异性结合，从而对生物分子进行荧光标记。二十世纪九十年代中期的重要科技成果基因芯片的关键技术之一就是核苷酸的荧光标记。荧光标记技术的飞速发展，尤其近年来以荧光染料为标示剂的生物芯片的出现，使荧光染料在DNA自动测序、免疫分析、临床诊断、新药设计和开发中有了更加广阔的应用前景。染料的荧光性能、稳定性、溶解性是影响其在生物分析领域中应用的重要因素。目前在生命科学领域应用极为广泛的Cy3-dutp、Cy5-dutp就是典型的核酸标记荧光探针。该类染料具有良好的荧光性能，其结构特点是吲哚环中N原子上的取代基至少有一个为羧戊基。吲哚环5位上的磺酸使该染料具有良好的水溶性，它们是目前应用最好的荧光探针之一，但光稳定性差，影响分析的可靠性，仍是其不足。与此同时，Cy3-NHS、Cy5-NHS作为蛋白质标记用荧光染料也被广泛使用，但由于其遇水极易分解，长期保存十分困难。另外，由于Cy3、Cy5系列荧光染料的原料价格昂贵，合成路线较长，产品收率很低，导致最终目标化合物的生产成本太高。这些缺点大大限制了此类荧光标记探针的进一步推广应用。

发明内容
本发明目的在于，提供一种价格相对低廉且具有良好荧光性能和光稳定性的荧光标记试剂(或称荧光标记探针)，克服现有技术中的不足。
发明概述由于8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈分子结构强化了其刚性共平面性，具有较强的缺电子性，扩大了共轭体系，非常容易与亲核试剂发生亲核取代反应，本发明利用此特点，将含有不同取代基的氨基化合物与8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈分子进行亲核取代反应，开发新型的荧光标记探针。通过在氨基化合物中引入羧基，进而生成染料—琥珀酰亚胺活化酯或染料—萘酰亚胺活化酯，藉此，此活化酯就可以与烷胺基核苷中的胺基结合，形成本发明所指的用于核苷酸标记的荧光标记探针；当然，烷胺基核苷中的胺基也可以直接与与8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈分子发生亲核取代反应，得到本发明所指的荧光标记探针。
本发明所说荧光标记试剂(或称荧光标记探针)，其为式(1)所示的化合物 式(1)中R1为H或C1-C8烷基；R2为 或 其中m，n分别为1-8中一整数；R3为 或 R3’为H、SO3H或C1-C8的烷基；A为核苷。
在本发明中，优选的R1为H或C1～C4的烷基，最佳的R1为H；优选的m，n分别为1～4中一整数；优选的R3’为H或C1～C4的烷基。
所说的核苷(A)由式(2)所示的四个碱基中任何一个与式(3)所示的戊糖组成
(2)式中，Z是H或NH2，折线为与式(1)中“乙炔基”连接端，R4是戊糖，其结构如式(3)所示 (3)式中，R5为H，PO3H2，P2O6H3或P3O9H4，或为所述磷酸的盐；R6为H，OH，F，N3或NH2；R7为H或OH；R8为H或OH；且(a)当R7＝R8＝H时，则R6＝H，OH，F，N3或NH2；(b)当R7＝H且R8＝OH时，则R6＝H或OH；(c)当R7＝OH且R8＝H时，则R6＝OH。
(3)式中折线为与式(2)中“碱基”连接端。
制备本发明所述荧光标记试剂的方法是以8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈为起始原料，将8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈与带有氨基连接臂的核苷(α)进行反应，得到染料(8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)-三磷酸核苷化合物(目标化合物之一)；或由8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈先与R1NH(CH2)nCOOH反应，所得产物再与N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)或碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)或N-羟基1，8-萘酰亚胺缩合，得(8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)-琥珀酰亚胺活化酯(目标化合物之二)，最后将所得(8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)-琥珀酰亚胺活化酯与带有氨基连接臂的核苷(β)进行反应，得到染料(8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)-三磷酸核苷化合物(目标化合物之三)。
其中带有氨基连接臂的核苷(α)为R1NH(CH2)mC≡CA，带有氨基连接臂的核苷(β)为NH2(CH2)mC≡CA，R1，m和A的含义与前文所述相同。8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(起始原料)的制备参见ZL 02148400.7，带有氨基连接臂的核苷制备参见US 5,047,519，其它原料及试剂为市售品。
所说制备方法的合成路线如下 其中R1，R3，m，n和A的含义与前文所述相同。
与现有的荧光标记试剂相比，本发明所说的荧光标记试剂具有价格低廉、制备简单且具备良好荧光性能和光稳定性等优点。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明之目的。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围实施例13-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的合成 20mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈加入到20ml乙腈中，再加入22mmol 6-氨基己酸，常温搅拌半小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.35的深红色强荧光谱带，蒸去溶剂得到产品。MS(ESI-)358.0。
3-(ε-羧戊基琥珀酰亚胺酯)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物1)的合成 10mmol 3-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于2ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入30mmol碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)和0.1ml绝对无水吡啶，氩气保护下55-60℃搅拌反应4小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.42的深红色强荧光谱带，蒸去溶剂得到产品。MS(ESI+)457.2。
实施例23-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈-dUTP(化合物2)的合成 5-(3-炔丙胺)-2’-脱氧尿苷三磷酸30μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀酰亚胺酯)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)862.1。
实施例33-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈-dCTP(化合物3)的合成
5-(3-炔丙胺)-2’-脱氧胞苷三磷酸30μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀酰亚胺酯)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)861.1。
实施例43-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈-ddUTP(化合物4)的合成 5-(3-炔丙胺)-2’，3’-二脱氧尿苷三磷酸30μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将45μmol的3-(ε-羧戊基琥珀酰亚胺酯)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)846.2。
实施例5[8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈]-dUTP(化合物5)的合成 5-(3-炔丙胺)-2’-脱氧尿苷三磷酸30μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将45μmol的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)749.1。
实施例6[8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈]-ddUTP(化合物6)的合成 5-(3-炔丙胺)-2’，3’-二脱氧尿苷三磷酸25μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将40μmol的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)733.1。
实施例7[8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈]-dCTP(化合物7)的合成 5-(3-炔丙胺)-2’-脱氧胞苷三磷酸30μmol溶于1ml Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)中，将45μmol的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于1ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入到前述溶液中，室温搅拌反应12小时后，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH9.4)稀释到10ml，半制备HPLC分离纯化得到目标化合物(反相C18柱，TEAA-CH3CN梯度洗脱)，冷冻干燥后-20℃保存。MALDI-TOF-MS(基质CHCA)748.1。
实施例83-(ε-羧戊基萘酰亚胺酯)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物8)的合成 10mmol 3-(ε-羧戊基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈溶于2ml绝对无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入30mmol N-羟基1，8-萘酰亚胺和0.1ml绝对无水吡啶，氩气保护下55-60℃搅拌反应4小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液二氯甲烷-乙酸乙酯(5∶1，V/V)，收集Rf＝0.42的深红色强荧光谱带，蒸去溶剂得到产品。MS(ESI+)555.2。
权利要求
1.一种荧光标记试剂，其特征在于，所说的荧光标记试剂为具有式(1)所示的化合物 式(1)中R1为H或C1-C8烷基；R2为 或 其中m，n分别为1-8中一整数；R3为 或 R3’为H、SC3H或C1-C8的烷基；A为核苷。
2.如权利要求1所述的荧光标记试剂，其特征在于，其中R1为H或C1～C4的烷基。
3.如权利要求2所述的荧光标记试剂，其特征在于，其中R1为H。
4.如权利要求1所述的荧光标记试剂，其特征在于，其中m，n分别为1～4中一整数。
5.如权利要求1所述的荧光标记试剂，其特征在于，R3’为H或C1～C4的烷基。
6.如权利要求1～5所述的任意一种荧光标记试剂，其特征在于，其中所用的核苷(A)为由式(2)所示的四个碱基中任何一个与式(3)所示的戊糖组成 (2)式中，Z是H或NH2，R4是戊糖，其结构如式(3)所示 (3)式中，R5为H，PO3H2，P2O6H3或P3O9H4，或所述磷酸的盐；R6为H，OH，F，N3或NH2；R7为H或OH；R8为H或OH；且(a)当R7＝R8＝H时，则R6＝H，OH，F，N3或NH2；(b)当R7＝H且R8＝OH时，则R6＝H或OH；(c)当R7＝OH且R8＝H时，则R6＝OH。
7.如权利要求6所述的荧光标记试剂，其特征在于，所说的荧光标记试剂为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7或化合物8。
全文摘要
本发明涉及一种荧光标记试剂，所说的荧光标记试剂为式(1)所示的化合物。与现有的荧光标记试剂相比，本发明所说的荧光标记试剂具有价格低廉、制备简单且具备良好荧光性能和光稳定性等优点。式(1)中R
文档编号G01N33/52GK1940563SQ200510030078
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者钱旭红, 朱维平, 徐玉芳, 张佩琢, 徐晓勇, 肖义, 陈卓, 段春晓 申请人:华东理工大学, 上海吉玛制药技术有限公司