专利名称：试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种诊断试剂盒。更具体地，本实用新型涉及包括至少两项检测试纸条的诊断试剂盒，所述至少两项试纸条分别包被有抗原，用于体外定性检测人血液中的AMA-M2抗 体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体，辅助诊断自身免疫性肝病。
背景技术：
背景肝炎是影响人类健康的最常见疾病之一，慢性肝炎对患者与社会影响更大。近几年国外相继报道自身免疫性肝病，特别是自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)和原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC),其发病率均有明显上升的趋势。AIH是由自身免疫反应引起的肝脏损伤，表现为慢性渐进性肝炎，直至肝硬化，血清学表现为高丙种球蛋白和特征性自身抗体等。由于AIH的检测指标经常和其他自身免疫性肝病的指标重叠，因此对病因不明的肝病患者筛查AIH的同时，有必要排除其他疾病的干扰。例如，已发现，AIH与PBC的重叠占8%，与原发性硬化性胆管炎重叠占6%，与慢性病毒型肝炎重叠占11%，与自身免疫性胆管炎重叠占10%，其他不明原因的慢型肝炎占13%。其中PBC的发病率较高，因此，有必要在筛查AIH的同时排除PBC的干扰。PBC是以破坏肝内小及中等大小胆管为主的器官特异性自身免疫性肝病，表现为肝门脉区炎症导致纤维化，肝硬化甚至功能性衰竭。PBC患者90%以上为女性，年龄一般为30至65岁之间，随年龄增长期发病率呈上升趋势。过去明确PBC诊断的方法是肝脏穿刺活检，但这种创伤性的检测手段限制了其应用。迄今为止，自身免疫性疾病的诊断手段主要是在结合临床的基础上，依赖实验室检测到一种或多种高效价的自身抗体。在国际权威机构制定的某些自身免疫性疾病诊断标准中就包括了自身抗体，如原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis, PBC),美国肝病学会(AASLD) 2000年发表的PBC诊断程序中，将抗线粒体抗体(AMA)列为诊断标准之一。线粒体膜上存在9种自身抗原(Ml 9)，针对其中M2亚型相应的AMA(AMA-M2)诊断PBC的敏感性和特异性最高。而对自身免疫性肝炎(AIH)的诊断，甚至可以根据患者血清中自身抗体的不同，将其分型。当然，以上各种自身抗体在疾病诊断过程均存在其局限性，不能一概而论。如有一些M2阴性的PBC患者就无法得到及时的诊断和治疗。近年已有不少报道在M2阴性的PBC患者的体内检测到一些特殊类型的自身抗体，对PBC的诊断具有高度特异性，最具临床价值的为SP100抗体和GP210抗体。SP100抗体可在约31 %的PBC患者体内被检测到，由于不能在其他各种类型的自身免疫性肝病中检测到该抗体，因此放视为PBC的标志物。GP210抗体虽然仅仅在约10%的PBC患者体内被检测到，但对M2阴性的PBC具有较高诊断价值，可在21%的M2阴性患者体内查到，因此联合SP100和GP210抗体指标，提高了单项M2检测对PBC的诊断率。SLA抗体对III性自身免疫性肝炎具有高度特异性，其阳性率占自身免疫性肝炎的11 % 32. 5%，至今尚未发现在其他疾病或正常人群中存在SLA抗体，因而诊断价值很高。LKM抗体(抗肝/肾微粒体抗体)能与肝细胞质、近端肾小管起反应，经鉴定LKM抗体有3种亚型，LKM-I是II型自身免疫性肝炎的血清学标
O目前还没有一种诊断装置，能够同时对AIH和PBC进行方便、快捷和准确的筛查。而对这两种疾病的筛查对临床诊断的准确性，以及后续治疗方案的选择都具有重要的意义。在临床诊断上，目前实验室常用的检测自身抗体的方法主要有酶联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、间接免疫突光法(indirectimmunof lurescence, IFF)、免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)、线性免疫分析法(Line immuno assay，LIA)等。免疫印迹法虽综合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，但操作相对复杂，且试剂具有较强的毒性和污染性。间接免疫荧光法可作半定量测定，但需有荧光显微镜观察结果，结果判定的客观性不足，标准化困难，技术程序比较复杂,也不适合高通量标本的检测。线性免疫分析法主要用于疾病大类的筛查,针对性相对较差，同时也不适合高通量样本的检测。ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，目前被广泛认可，但操作比较繁琐，需多次加样和洗涤，且易受温度和孵育条件的影响，在专业实验室里进行操作，给实验带来诸多不便。因此，本领域迫切需要提供一种在临床中能够快速准确地检测和筛查AIH和PBC的诊断装置，以满足临床诊断的需要，实现即时检测、床边检测的需求。
发明内容本实用新型提供了一种用于诊断自身免疫性肝病的诊断试剂盒，其包括至少两个试纸条，其中所述试纸条包括依次搭接的样品垫、结合垫、检测膜、和吸水垫，以及支撑底板。其中，所述结合垫上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白；所述检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹，所述检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹；所述试纸条的检测膜上的所述检测蛋白印迹与所述质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫。在某些实施方式中，所述样品垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，所述结合垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，和所述检测膜是由硝酸纤维素膜制成，以及所述支撑底板由PVC板或其它硬质地而不吸水的材料制成。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和/或所述质控蛋白印迹的形状分别为斑点状或条带状。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为斑点状。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为条带状。在某些实施方式中，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述诊、断试剂盒包括两个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括三个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括四个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括五个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述质控蛋白为可与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者可与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。在某些实施方式中，所述试纸条的结合垫上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹能够结合所述第二种 胶体金标记的蛋白。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒进一步包括至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述至少两个试纸条。在某些实施方式中，所述至少一个固定底座上固定有两个到五个所述试纸条，且所述试纸条相互独立。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单个试纸条的容纳部内。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，所述突起界定至少两个可容纳单个试纸条的容纳部。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括两个或两个以上所述固定底座，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。 在某些实施方式中，所述至少两个试纸条相互平行。在某些实施方式中，所述试纸条的检测膜上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自下组的组成部分固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。

图I为单个试纸条的剖面示例图，其中I指示样品垫，2指示结合垫，3指示检测膜，4指示吸水垫，5指示检测区，6指示质控区，7指示支撑底板。图2为单个试纸条的分解示例图，其中1-7所表示的结构同图I。图3为可以设置单个试纸条的设有突起的固定底座的不例图,其中(a)为俯视图，(b)为剖视图。其中8指示固定底座，9指示突起，20指示容纳部。图4为可与固定底座配合的上盖的示例俯视图，其中10指示上盖，11指示加样口，12指示观察窗口。图5为设有试纸条的固定底座和上盖配合时的结构示意图，其中(a)为俯视图，(b)为剖视图，其中1-12所表示的结构同图I、图2和图4。图6为可以设置两个试纸条的设有突起的固定底座及可与之配合的上盖的示例图，其中(a)为固定底座的示例俯视图，(b)为固定底座的示例剖视图，(C)为上盖的示例俯视图。其中V指示固定底座，8’指示突起，9’指示上盖，10’指示加样口，11’指示观察窗口，20指示容纳部。图7为可以设置三个试纸条的设有突起的固定底座及可与之配合的上盖的示例图，其中(a)为固定底座的示例俯视图，(b)为固定底座的示例剖视图，(C)为上盖的示例俯视图。其中7”指示固定底座，8”指示突起，9”指示上盖，10”指示加样口，11”指示观察窗口，20指示容纳部。 图8为用试纸条进行检测得到的检测结果示意图，其中13指示检测区内出现的深色带，14指示质控区内出现的深色带。
具体实施方式
本实用新型提供了用于诊断自身免疫性肝病的含有试纸条的诊断试剂盒，所述试纸条能够用于进行样品的层析，并且能够检测样品中存在的被检物质。在某些实施方式中，所述样品可以是人体液样品，例如血液，血浆等。在某些实施方式中，所述样品中存在的被检物质是一种或多种人抗体，例如，AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体。上述这些人抗体被证明与自身免疫性肝病有关，通过检测血液或血浆中是否存在一种或多种这些抗体，可以辅助诊断自身免疫性肝病。这些被检抗体能够特异性结合其对应的抗原，因此，将这些抗体的抗原包被在所述试纸条的检测区，可以检测与之对应的被检抗体。表I中列出了能够与AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体特异性结合的抗原的示例，以及相关联的疾病。表I
被检抗体与被检抗体特异性结合的关联的疾病
抗原
SLA抗体可溶性肝抗原(SLA)自身免疫性肝炎(AIH)
LKM-I抗体肝肾微粒体抗原(LKM-I) AIH
AMA-M2抗体AMA-M2抗原(即线粒体上原发性胆汁性肝硬化
的2-氧酸脱氢酶复合体 (PBC)
(2-OADC))，或连接有丙酮酸脱氢酶、2-氧酸脫氢酶和2-氧戊二酸脱氢酶的抗原蛋白三联体
SPlOO抗体磷酸化的细胞核蛋白PBC
(SP100) GP210抗体核膜糖蛋白(GP210)PBC[0034]本申请提供的诊断试剂盒包括至少两个试纸条100，其中每一个试纸条100都包括依次搭接的样品垫I、结合垫2、检测膜3、和吸水垫4，以及支撑底板7，其中，所述试纸条的结合垫上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白；所述试纸条的检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹，所述检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹；所述试纸条的检测膜上的所述检测蛋白印迹与所述质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫。在某些实施方式中，本申请提供的诊断试剂盒中的各个试纸条100相互独立，彼此互不干扰检测时样品的层析流动和结果显示。样品垫I是样品添加的区域。结合垫2上包被有金属胶体标记物，是样品与金属胶体标记物结合或混合的区域。检测膜3上设置有彼此分离的检测区5和质控区6，且所述检测区5比所述质控区6更靠近结合垫2，其中所述检测区5包被有检测蛋白印迹，用于结合待测抗体，所述质控区6包被有质控蛋白印迹用于结合质控对照物。吸水垫4用于吸收水份以使样品朝吸水垫4方向移动。支撑底板7用于支撑依次搭接的样品垫I、结合垫2、检测膜3、和吸水垫4。单个试纸条100的具体结构示意图见图I和图2。如图I所示，单个试纸条100中，样品垫I、结合垫2、检测膜3和吸水垫4按照该顺序从左到右依次首尾搭接。“搭接”是指，相邻的两个组件的首尾部分重叠，并且在重叠处形成可以允许液体样品移动的连接结构。例如，可以在相邻的两个组件的首尾部分通过按压操作形成较为紧密的重叠结构，使得样品能够从上游组件的尾部通过该重叠结构移动至下游组件上。上游组件可以重叠在下游组件的上方，也可以重叠在下方。在检测时，可以将液体状态的样品(如血液，血浆等)加样到样品垫I上，该液态状态的样品可以通过吸水作用，沿着样品垫I向与之搭接的结合垫2移动，接触到结合垫2后再沿着结合垫2向与之搭接的检测膜3移动，接触到检测膜3之后再沿着检测膜3向与之搭接的吸水垫4移动。这样的移动通常称为层析作用。样品加到样品垫I上后，其中的物质通过层析作用，依次移动到结合垫2和检测膜3上。当样品移动到结合垫2时，其中的待检测抗体，如人抗体，可与结合垫2上包被的金属胶体标记的蛋白相结合，然后含有从结合垫2上结合或混合的物质的样品继续移动到检测膜3上，并与检测膜3上包被的检测蛋白印迹相结合并且被截留，从而使得样品中的被检物质得以被检测。在某些实施方式中，试纸条100的结合垫2上包被有可与人抗体结合的金属胶体物标记的第一种蛋白。在某些实施方式中，所述第一种蛋白可以是抗人IgG抗体，例如，羊抗人IgG抗体，兔抗人IgG抗体，猪抗人IgG抗体，或鼠抗入IgG抗体等。在某些实施方式中，所述第一种蛋白可以是葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白。所述金属胶体标记的第一种蛋白可以通过在适当条件下混合金属胶体物和蛋白而制得。在某些实施方式中，可以用适当的缓冲液加入金属胶体物中，调节至适当的PH，再按一定比例加入蛋白，混匀制得金属胶体物标记的蛋白。适当的缓冲液包括，例如，碳酸钾缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等，适当的缓冲液浓度可以是O. I O. 5M。适当的pH可以是5-10，6-10，7-10，或8-9。金属胶体物可以通过本领域公知的方法制得，例如，用含有金属离子的溶液与还原剂反应制得。例如，将含有金属离子的溶液在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成一定大小的金属颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶体溶液。金属胶体物的例子有胶体金、胶体银
坐寸ο[0038]在某些实施方式中，所述试纸条的结合垫上包被有可与人抗体结合的胶体金标记的蛋白。在某些实施方式中，所述试纸条的结合垫上包被有胶体金标记的抗人IgG抗体，胶体金标记的葡萄球菌A蛋白，或胶体金标记的链球菌G蛋白。在某些实施方式中，结合垫2上还包被有金属胶体物标记的第二种蛋白。所述第二种蛋白不同于所述金属胶体物标记的第一种蛋白。在某些实施方式中，所述第二种蛋白可以特异性结合质控蛋白，但不结合样品中的人抗体。如下所述，该第二种蛋白为质控对照物，用于显示试纸功能是否正常。第二种蛋白可以根据实际情况选择，例如，可以是不结合人抗体的兔抗体、鼠抗体、羊抗体、猪抗体、或者其他适合的蛋白。所述第二种蛋白可以通过上述的方法形成金属胶体标记的第二种蛋白。在某些实施方式中，所述第二种蛋白与所述第一种蛋白以混合物的形式包被在结合垫2上。在某些实施方式中，试纸条100的检测膜3上设置有彼此分离的检测区5和质控区6，且所述检测区5相比于所述质控区6更靠近于结合垫2，其中所述检测区5包被有检测蛋白印迹，所述质控区6包被有质控蛋白印迹。所述检测区5与所述质控区6之间间隔足够的距离，使得层析的样品能够分别与检测区5的检测蛋白印迹和质控区6的质控蛋白印迹相接触，并且互相不会干扰。检测区5更靠近于结合垫2，使得层析的样品在层析过程中，先与检测蛋白印迹接触，然后再与质控蛋白印迹接触。在某些实施方式中，每个所述试纸条上的所述检测蛋白印迹为一种选自下列组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹。在某些实施方式中，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。这些检测蛋白印迹能够特异性结合其对应的抗体，如AMA-M2蛋白印迹能够特异性结合AMA-M2抗体，SP100蛋白印迹能够特异性结合SP100抗体，GP210蛋白印迹能够特异性结合GP210抗体，SLA蛋白印迹能够特异性结合SLA抗体，LKM-I蛋白印迹能够特异性结合LKM-I抗体。这些蛋白在本领域公知，可以通过常规的技术进行蛋白的生物表达和分离纯化，从而获得这些蛋白。所述蛋白印迹的例子见表I。AMA-M2抗原，即线粒体上的2_氧酸脱氢酶复合体(2-0ADC)，其包括多种组分，例如丙酮酸脱氢酶、2-氧酸脱氢酶、2-氧戊二酸脱氢酶、X蛋白等。在某些实施方式中，AMA-M2抗体的靶抗原是一种连接了丙酮酸脱氢酶，2-氧酸脱氢酶和2-氧戊二酸脱氢酶的抗原蛋白三联体(见，例如，姜小华，仲人前等，M2自身抗原及其三联体的克隆表达和初步鉴定，中华消化杂志，2001 (21) :530-533)。AMA-M2在PBC中敏感性可达90%以上。 SP100蛋白是I个磷酸化的细胞核蛋白，电泳时对应的分子质量为100，000，是一转录活化因子。GP210的主要成分为核膜糖蛋白，是核孔复合物中一种相对分子质量为210，000完整的跨膜蛋白(见，例如Nakamura M等，Increased exp ression of nuclear envelopegp210antigen in small bile ducts in primary biliary cirrhosis[J]. JAutoimmun,2006,26(2) :138-145)。SLA是肝细胞质中的一种可溶性蛋白抗原，在胰腺等组织也有表达。SLA蛋白的分子量为 50KD(见，Wies I 等，Identigication of target antigen for SLA/LPautoantibodies in autoimmune hepatitis. The Lancet，2000 ;355 :1510-1515)。LKM-I (liver/kidney microsomal，LKM)为肝 / 肾微粒体，引起自身免疫性疾病的靶抗原成分为人细胞色素II D6，分子量为50KD(见，Duclos-Vallee J C等，Conformational epitopes on CYP2D6are recognized by liver/kidney microsomalantibodies. G astroenterology, 1995 ；108 :470-476)。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括两个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。例如，所述两个试纸条上的检测蛋白印迹可以分别是SLA蛋白印迹或LKM-I蛋白印迹，或者所述两个试纸条上的检测蛋白印迹也可以分别选自AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹和GP210蛋白印迹。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括三个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。例如，所述三 个试纸条上的检测蛋白印迹可以分别是AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹或GP210蛋白印迹。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括四个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。例如，所述四个试纸条上的检测蛋白印迹可以分别是AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹或SLA蛋白印迹。例如，所述四个试纸条上的检测蛋白印迹也可以分别是AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹或LKM-I蛋白印迹。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括五个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。检测蛋白印迹可以用适当的方法包被在检测膜3的检测区5。在某些实施方式中，可以将检测蛋白溶于适当的缓冲液中，再通过固定、包被、吸附、喷涂、打印等方式包被在检测区。适当的缓冲液包括，硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Tris-磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液等，其pH值可以为6. 5-7. 5，或
7.0-7. 4。可以将含有检测蛋白的缓冲液与检测区接触一段时间，然后除去接触后的缓冲液。再例如，可以将含有检测蛋白的缓冲液喷洒在或涂布在检测区，再通过干燥等方式除去溶剂成分。再例如，可以将检测蛋白印在或压制在检测区。在某些实施方式中，所述质控蛋白印迹为可与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者可与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。在某些实施方式中，所述试纸条的结合垫上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。所述质控蛋白可以是抗体。当所述第二种蛋白为抗体时，所述质控蛋白印迹还可以是葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白。使用与检测蛋白印迹相似的包被方法，可以将质控蛋白印迹包被在检测膜3的质控区6上。所述质控蛋白印迹可用于监测层析作用是否正常发生。如果质控蛋白印迹能够检测到金属标记物标记的蛋白，则表明样品已经从样品垫I经过结合垫2，并带走了结合垫2上包被的金属胶体物标记的蛋白，然后继续移动到检测膜3。这说明该检测结果有效。如果质控蛋白印迹没有检测到任何信号，则提示试纸条可能没有正常工作，检测结果无效。检测区5上包被的检测蛋白印迹和质控区6上包被的质控蛋白印迹可以是任何适当的形状。在某些实施方式中，检测蛋白印迹和/或质控蛋白印迹的形状为斑点状或条带状。在某些实施方式中，检测蛋白印迹和质控蛋白印迹都为斑点状或都为条带状。这里所说的斑点状可以是圆形、椭圆等规则形状或不规则形状。在某些实施方式中，所述样品垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，所述结合垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，和所述检测膜是由硝酸纤维素膜制成，以及所述支撑底板由PVC板或其它硬质地而不吸水的材料制成。在某些实施方式中，试纸条100的吸水垫4可以是由吸收纸制成的片状物。玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布、吸收纸和硝酸纤维素膜都是已知的材料，本领域人员可以通过商业途径很容易地获得。这些材料的型号和规格可以根据实际需要进行选择。例如，适用的玻璃纤维的型号有Ahlstrom8964,Ahlstrom8975,GF-06和GF-08。适用的硝酸纤维素膜的型号可以包括 Milliporel35, Sartorius CN140,和 Vivid 170 等。在某些实施方式中，每个试纸条还包括一个支撑底板7。在某些实施方式中，支撑底板7可以是平板，如图2所示。试纸条100的其他部分可以通过粘贴的方式固定在平板状的支撑底板7上，例如使用胶条粘贴在支撑底板上。所述胶条可以是本领域公知的透明胶带或半透明胶带。再例如，也可以在支撑底板上涂覆有粘性的材料，再将试纸条100的其他部分粘贴在支撑底板上。在某些实施方式中，试剂盒进一步包括至少一个固定底座,所述至少一个固定底座上固定有至少一个所述试纸条。底座可以由塑料等合适的材料制成。在某些实施方式中，如图3(a)和3(b)所示，底座8的板面边缘可以设置有连续突起9，突起9在底座8上界定可容纳单个试纸条的容纳部20。尽管图示的由连续突起9界定的容纳部20为例如矩形的闭合图形，但本领域技术人员可以理解，还可以在底座8上形成不连续的点状、条状等合适形状的突起，并且.由突起所界定的容纳部也可以是诸如“ = ”、“C”形的非闭合图形。例如，可以在底座8的两个相对边缘分别设置两列点状突起，这两列点状突起在底座上界定可容纳单个试纸条的槽状容纳部。进一步，容纳部的形状和/或尺寸可以与试纸条相当。在某些实施方式中，试剂盒还可包括可与固定底座8配合的、与固定底座8数目相同的上盖10。如图4所示，每个上盖10均设有彼此分离的加样口 11和观察窗口 12。上盖10可以通过粘贴或扣合方式与设置有试纸条的固定底座8相配合。在上盖10与固定底座8配合时,上盖10的加样口 11位于试纸条的样品垫I上方,观察窗口 12位于试纸条上的检测膜3上方，优选露出检测膜3的检测区5和质控区6。图5 (a)和5 (b)示意性地显示了彼此配合的上盖10和设置有单个试纸条的固定底座8的结构。在某些实施方式中，试剂盒进一步包括至少一个固定底座,所述至少一个固定底座上固定有所述至少两个试纸条。例如，所述试剂盒包括一个固定底座8 ’，其上设置有至少两个试纸条100。在某些实施方式中，所述至少一个固定底座上固定有两个或五个所述试纸条，且所述试纸条相互独立。在某些实施方式中，所述试纸条可以是相互分离的。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单个试纸条的容纳部内。例如，固定底座8’的板面上可设置连续突起9’，突起9’界定至少两个可分别容纳单个试纸条100的容纳部20，使得所述至少两个试纸条100彼此分隔开。再例如，固定底座8’的板面上可设置连续突起9’，突起9’界定两个到五个可分别容纳单个试纸条100的容纳部20，使得所述两个到五个试纸条100彼此分隔开。可以用粘贴的方式将试纸条100固定在各自的容纳部内。图6(a)和图6(b)分别示出了带有两个容纳部的设有连续突起9’的固定底座8，的俯视图和剖视图，图7(a)和图7(b)分别示出了带有三个容纳部的设有连续突起9’的固定底座8’的俯视图和剖视图。同样地，本领域技术人员根据两个和三个容纳部的示例图可以很容易地知道带有四个、五个或更多容纳部的固定底座的结构。当然，固定底座8’上的突起9’也可以如上面介绍的那样，构造成多个点状、条状的突起，并且突起9’所界定的各个容纳部的形状也可以是非封闭图形(例如槽状)。优选各个容纳部的形状和/或尺寸与试纸条100相当。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，所述突起界定至少两个可容纳单个试纸条的容纳部[0061]在某些实施方式中，试剂盒还包括至少一个可与所述固定底座配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。例如，试剂盒还可包括一个可与固定底座8’配合的上盖10’，所述上盖10’设有彼此分离的至少两个加样口 11’，所述上盖10’可以粘贴或扣合的方式与固定底座8’配合。在上盖10’与设有至少两个试纸条100的固定底座8，盖合时，各个加样口 11’分别位于对应试纸条100的样品垫I上方。在某些实施方式中，所述上盖10’还可包括至少两个彼此分离的观察窗口 12’。在上盖10’与设有至少两个试纸条100的固定底座8，盖合时，各个观察窗口 12’分别位于对应试纸条的检测膜3上方，优选露出该检测膜3的检测区5和质控区6。图6 (c)示出了带有两个加样口和两个观察窗口的上盖的俯视图，图7 (c)示出了带有三个加样口和三个观察窗口的上盖的俯视图，同样地，本领域技术人员根据图6(c)和图7(c)可以很容易地知道带有四个、五个或更多加样口和观察窗口的上盖结构。本领域技术人员可以理解，所述至少两个彼此分离的观察窗口 12’和12”也可以用一个连贯的观察窗口来替代，在上盖10’与设有至少两或三个试纸条100的固定底座8，和8”盖合时，该观察窗口位于所有试纸条的检测膜3上方，优选露出所有检测膜3的检测区5和质控区6。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括两个或两个以上所述固定底座，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。在某些实施方式中，所述两个或两个以上的所述固定底座相互独立。例如，所述诊断试剂盒可以包括两个相互独立的固定底座，其中每一个都固定有至少一个试纸条。再例如，所述诊断试剂盒可以包括两个相互独立的固定底座，其中一个固定有至少两个试纸条，另一个固定有至少一个试纸条。再例如，所述诊断试剂盒可以包括三个相互独立的固定底座，其中两个底座分别固定有两个试纸条，另一个固定有一个试纸条。例如，所述诊断试剂盒可以包括五个相互独立的固定底座，其中每个底座分别固定有一个试纸条。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括有可与所述固定底座配套使用的上盖，上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒中的所述至少两个试纸条相互平行。在某些实施方式中，设置在固定底座8，上的至少两个试纸条100的检测区5和/或质控区6基本上排列在同一直线上，即至少两个试纸条100的检测区5基本上排列在一条直线上，和/或质控区6基本上排列在同一条直线上。在某些实施方式中，至少两个试纸条100在固定底座8’上平行排列。在某些实施方式中，诊断试剂盒，进一步包括一种或多种选自下组的组成部分固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。所述滴管可用于吸取液体样品，并可用于将液体样品滴加到样品垫I。所述干燥剂可以保持试剂盒的湿度在适当的范围 。所述说明书上写有使用方法、保存方法、生产批号等信息。在某些实施方式中，所述试剂盒还可以包括至少一个避光、密封的塑料袋，其中装有所述试剂盒。在某些实施方式中，所述试剂盒能够用于检测AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体。例如，所述试剂盒可用于检测样品中是否存在一种或多种上述抗体。如果样品中存在一种或多种上述抗体，其可以在样品层析过程中被检测膜上的对应的检测蛋白捕获，从而在检测区被检测到。例如，加入样品后，反应3 5分钟可以看到检测区5和质控区6的相应位置上都出现深色条带13，14，如图8 (a)和8 (b)所示，这表示检测结果为阳性，说明样品中含有能够与检测蛋白特异性结合的抗体。再如，加样后，只在质控区6出现一条深色条带14，检测区5不出现深色条带13 (如图8 (c)所示)，这表示检测结果为阴性，说明样品中不含能够与检测蛋白特异性结合的抗体。再如，加样后，质控区6不出现深色条带14，此时无论检测区6是否有条带出现(如图8(d)、8(e)所示)，都说明试纸失效，检测结果无效。在某些实施方式中，本申请提供的诊断试剂盒可用于帮助诊断疾病。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒可用于帮助诊断自身免疫性肝病，例如，自身免疫性肝炎(AIH)和/或原发性胆汁性肝硬化(PBC)。LKM-I抗体和SLA抗体分别是II型和III型AIH的标志性抗体，其检测特异性高。具有确诊意义。通过检测样品中是否存在LKM-1-1抗体和/或SLA抗体，可以辅助诊断样品来源者是否患有AIH。PBC诊断的三种血清学指标是AMA-M2抗体，SP100抗体和GP210抗体。其中AMA-M2抗体是主要的血清型指标，在大多数PBC患者中能够检出。SP100抗体可在31 %的PBC病人中检出，但在其他自身免疫性肝病中检测不到。此外，SP100抗体还在48% AMA-M2抗体阴性的PBC病人中发现。抗核膜糖蛋白GP210抗体可在10%的PBC病人中检出，是PBC的高度特异性抗体，其特异性高达96%以上，极少出现于自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、干燥综合征和多发性肌炎病人中。检测GP210抗体对于AMA-M2抗体阴性或者缺乏一般临床特征的PBC患者以及其实验室、病理结果、异常的PBC患者的确诊具有重要的意义。因此，M2，SP100和GP210三种抗体同时测定，对提高PBC的诊断有极大意义。本申请提供的试剂盒可以对AIH和/或PBC的多项血清学指标同时进行联检，有助于同时筛查AIH和/或PBC，并且辅助AIH或PBC的确诊，以避免误诊和漏诊。在某些实施方式中，如果检测到样品中存在LKM-I抗体和SLA抗体中的一种或两种，则提示样品来源者可能患有AIH。在某些实施方式中，如果检测到样品中存在AMA-M2抗体、SP100抗体和GP210抗体中的一种或多种，则提示样品来源者可能患有PBC。在某些实施方式中，如果检测到样品中不存在LKM-I抗体、SLA抗体、AMA-M2抗体、SPlOO抗体和GP210抗体中的任一种，则提示样品来源者可能既不患有AIH，也不患有PBC。本中请提供的诊断试剂盒使用胶体金免疫层析法。该方法是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留，进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的(Sikowicz Get al. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination ofchoricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990 (36) 1579-1586.)。使用时只需将样品加样到样品垫上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现情况来判断阴阳性结果。与其他检测方法相比，检测时间短，只需要5 10分钟，操作人员无需培训，不受场地人员之限，操作简便、快速，无需低温保存，储运方便等优势。此外该试纸具有高特异性、高灵敏度、高准确度，能满足临床快速筛选PBC和AIH， 为病人及早诊断治疗提供条件，同时，也能满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。因此，本申请提供的诊断试剂盒与现有产品相比具有明显的优势。示范例I :试剂盒的结构本示范例中提供了一个诊断试剂盒，其包括两个如图I所示的试纸条，其中每一个试纸条100都包括依次搭接的样品垫I、结合垫2、检测膜3和吸水垫4，以及支撑底板7。每个试纸条100的结合垫2上都包被有胶体金标记的抗人抗体，以及胶体金标记的兔IgG。每个试纸条100的检测膜3上都设有彼此分离的检测区5和质控区6，且所述检测区5比所述质控区6更靠近于结合垫2。检测区5包被有检测蛋白印迹，质控区6包被有质控蛋白印迹。两个试纸条100上的检测蛋白印迹互不相同，分别为可溶性肝抗原SLA和LKM-1。每个试纸条100的质控蛋白印迹相同，都为羊抗兔IgG。所述诊断试剂盒还包括一个如图6所示的固定底座8’和上盖10’。固定底座8，上的突起9’界定两个可容纳并分隔试纸条100的容纳部20，两个试纸条100平行排列地分别放置在容纳部20内，且检测膜3上的检测区5基本上在同一直线上，质控区6也基本上在同一直线上。上盖10’扣合在固定底座8，上后，上盖10’上的加样口 11’分别正对每个试纸条100的样品垫1，检测窗口 12’分别正对每个试纸条100的检测膜3。所述诊断试剂盒还可含有未图示的滴管、干燥剂、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。用试剂盒进行检测的方法用上述示范例中的试剂盒进行人体样品的检测。收集来源于临床的100份确诊为自身免疫性肝炎(AIH)患者的血清。对于每一个患者的样品，用滴管吸取适量血样，分别滴加到两个加样口。室温条件下静置5分钟后，观察并记录结果。对100份AIH确诊患者的血清的检测结果进行统计和分析，以验证本试剂盒对AIH诊断的灵敏度和特异性。统计AIH的两项联检指标SLA抗体和LKM-I抗体的检测结果，见表2。计算对于每个联检指标的诊断灵敏性诊断灵敏性(％)=阳性结果样品数/测试样品总数X 100%。结果显示，本试剂盒对SLA抗体和LKM-I抗体的诊断灵敏度分别为31%和39%。在被检的100份样品中，只要AIH的两项联检指标中任一检测为阳性，则该样品被判断为AIH患者样品。结果显示，100份样品中有62份都被检出AIH阳性结果，表明本试剂盒对AIH患者的诊断率可达62%。此外，用这些AIH患者的血清另行检测PBC联检指标(即AMA-M2抗体、SPlOO抗体和GP210抗体)，几乎都呈阴性结果，说明本试剂盒对AIH的诊断具有较高的特异性。表 权利要求1.一种用于诊断自身免疫性肝病的诊断试剂盒，包括至少两个试纸条，其中所述试纸条包括依次搭接的样品垫(I)、结合垫(2)、检测膜(3)、和吸水垫(4)，以及支撑底板(7)，其中 所述试纸条的结合垫(2)上包被有可与人抗体结合的金属胶体标记的蛋白； 所述试纸条的检测膜(3)的检测区(5)上包被有一种检测蛋白印迹； 所述试纸条的检测膜(3)的质控区(6)上还包被有一种质控蛋白印迹；以及 所述试纸条的检测膜(3)上的所述检测蛋白印迹与所述质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫(2)。
2.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述样品垫(I)是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述结合垫(2)是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成； 所述检测膜(3)是由硝酸纤维素膜制成；且所述支撑底板(7)由PVC板制成。
3.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征在于所述检测蛋白印迹和质控蛋白印迹的形状分别为斑点状或条带状。
4.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SPlOO蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，且不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
5.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是包括两个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
6.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是包括三个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
7.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是包括四个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
8.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是包括五个所述试纸条，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
9.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中质控蛋白印迹为与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。
10.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述试纸条的结合垫(2)上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。
11.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是进一步包括至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述至少两个试纸条。
12.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其中所述至少一个固定底座上固定有两个到五个所述试纸条，且所述试纸条相互独立。
13.如权利要求11或12所述的诊断试剂盒，其特征在于所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单个试纸条的容纳部内。
14.如权利要求11或12所述的诊断试剂盒，其特征在于所述固定底座的板面上设有突起，所述突起界定至少两个可容纳单个试纸条的容纳部。
15.如权利要求11或12所述的诊断试剂盒，其特征是包括两个或两个以上所述固定底座，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。
16.如权利要求11或12所述的诊断试剂盒，其特征在于还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。
17.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述至少两个试纸条相互平行。
18.如权利要求17所述的诊断试剂盒，其中所述试纸条的检测膜(3)上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜(3)上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。
19.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征是进一步包括一种或多种选自下组的组成部分用于固定所述试纸条的固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。
专利摘要本实用新型提供了一种试剂盒，包括至少两个相互独立的试纸条，其中每一个试纸条部包括依次搭接的样品垫、结合垫、检测膜、和吸水垫，所述检测膜上设置有相互分离的检测区和质控区，其中检测区包被有检测蛋白，质控区包被有质控蛋白。本实用新型提供的试剂盒能够用于检测样品中AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-1抗体的存在，并且可用于辅助诊断自身免疫性肝病。
文档编号G01N33/576GK202404101SQ20112034744
公开日2012年8月29日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者包骏, 张玥 申请人:上海科新生物技术股份有限公司