专利名称：生物体的胞外离子移动状态的检测系统及方法
技术领域：
本发明涉及生物电子检测技术领域，特别涉及一种生物体的胞外离子移动状态的检测系统及方法。
背景技术：
生物体的离子的动态运输在其生长发育、新陈代谢、营养吸收、感知刺激等过程具有关键作用，其维持和调节体内各类离子平衡的能力，是生物生命活力的表现形式。任何一种离子过量都可导致胁迫的发生，适度的摄入才能维持正常的生长发育及生命活动。生物活体的器官、组织、细胞等与之外界环境交换的离子的移动速率和方向是信号转导过程的指示，也是生物体内各类基因发挥功能的表征。因此获取生物体的胞外离子移动状态的信息有助于揭示其生命活动机理，并可辅助转基因生物无损鉴定，特别是在农业上用于指导 作物品种的选育和栽培措施的制定。现有技术中，对离子的研究多采用化学检测方法，对植物材料存在严重破坏，并耗时耗力。而激光共聚焦和膜片钳等针对离子研究的设备，仅局限于细胞和组织对离子分布和运输开展小范围的研究，不能满足器官活体离子输运检测。

发明内容
(一)解决的技术问题本发明解决的技术问题是如何实现生物体胞外微小空间内溶液的离子移动状态非接触式检测的准确性、可靠性。(二)技术方案本发明提出了一种生物体的胞外离子移动状态的检测系统，所述系统包括离子选择性玻璃微电极、电极阻抗测试单元、阻抗变换单元、模拟信号锁存单元和电极支架及其移动单元；所述离子选择性玻璃微电极用于作为检测测试样品的胞外离子移动状态的检测电极；所述离子选择性玻璃微电极与用于测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗是否符合测试要求的所述电极阻抗测试单元相连接，所述电极阻抗测试单元与用于提高输入阻抗的所述阻抗变换单元相连接，所述阻抗变换单元与用于当所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处时，锁存Xl处的电压Vl的所述模拟信号锁存单元相连接；，所述电极支架及其移动单元与所述离子选择性玻璃微电极相连接，所述电极支架及其移动单元用于固定所述离子选择性玻璃微电极以及将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处。优选地，所述离子选择性玻璃微电极包括尖端直径为2-3 U m的玻璃管。优选地，所述离子选择性玻璃微电极经过硅烷化试剂处理，所述硅烷化试剂为二
甲基二氯硅烷。优选地，所述测试溶液中所含离子组成与测试样品所处微环境的离子组成相同。
优选地，所述阻抗变换单元的阻抗大于或等于IO13Q。优选地，所述系统还包括用于放大输入信号电压与所述阻抗变换单元相连接的放大单元、与所述放大单元和所述模拟信号锁存单元相连接的仪器仪表放大器、与所述放大单元和所述仪器仪表放大器相连接的滤波单元、与所述滤波单元相连接的采集与处理单元、与所述采集与处理单元相连接的温度检测单元和与所述电极阻抗测试单元和所述阻抗变换单元以及所述采集与处理单元相连接的系统校准单元。本发明还提出了一种生物体的胞外离子移动状态的检测方法，所述方法包括步骤SI、测量离子选择性玻璃微电极的阻抗，所述阻抗是否符合测试要求，若是，则继续步骤S2，若否，则更换所述离子选择性玻璃微电极； S2、将所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处，测量Xl处电压VI，并将所述电压锁存；S3、将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处，测量并获得X2处电压V2与Xl处电压Vl的差值AV;S4、根据八￥、￥1，计算出乂2处电压￥2，并利用公式￥ = 1^1§(计算出乂1处和父2处之间的浓度Cl和C2，并计算Xl处和X2处之间的浓度差A C，k为截距，s为斜率；
ACS5、根据AC和AX，利用公式/ = -D Y计算出所述测试溶液中待测离子的
AX
移动速率J，所述AX为Xl处和X2处之间的距离，D为所述待测离子的扩散常数。优选地，步骤SI中所述测试要求为所述离子选择性玻璃微电极电极阻抗大于等于50MQ且小于等于IO10Q o优选地，测量离子选择性玻璃微电极的阻抗的方法具体包括S11、电极阻抗测试单元选择标准电阻R，电极阻抗测试单元中的信号源产生方波，则产生的方波的电压为方波的电流与所述标准电阻R的乘积，产生的方波经过阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，测试采集与处理单元输出的方波的幅值电压V0，所述信号源为电流源；S12、电极阻抗测试单元选择所述离子选择性玻璃微电极，电极阻抗测试单元中的信号源产生方波，则产生的方波的电压为方波的电流与所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的乘积，产生的方波经过阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，若采集与处理单元的输出仍为方波，则测试采集与处理单元输出的方波的幅值电压为Vx，则所述离子选择性
Vx
玻璃微电极的阻抗为Z = — X i ;若采集与处理单元的输出不为方波，则跳转步骤
10
S13 ；S13、电极阻抗测试单元同时选择所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电极，电极阻抗测试单元中的信号源产生方波，产生的方波的电压为方波的电流与所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的并联阻抗的乘积，产生的方波经过阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，若采集与处理单元的输出仍为方波，则测试采集与处理单
元输出的方波的幅值电压V3，计算此时的并联阻kA>l =i ，则所述离子选择性
VO玻璃微电极阻抗Z
优选地，所述步骤S5中，若计算出所述待测离子的移动速率的数值为负数，则表示所述待测离子向细胞方向迁移；若为正数，则表示所述待测离子向细胞外扩散。有益效果本发明采用电极阻抗测试单元对离子选择性玻璃微电极的电极阻抗进行测试，以确定离子选择性玻璃微电极的电极阻抗符合测试要求，确保检测过程的准确性。


图I是本发明提出的生物体的胞外离子移动状态的检测系统结构图；图2是本发明提出的生物体的胞外离子移动状态的检测系统示意图；图3是本发明提出的生物体的胞外离子移动状态的检测方法流程图；图4是本发明提出的扩散离子移动速率变化的曲线图。
具体实施例方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例I :本实施例提供了一种生物体的胞外离子移动状态的检测系统，如图I和图2所示，所述系统包括离子选择性玻璃微电极、电极阻抗测试单元、阻抗变换单元、模拟信号锁存单元和电极支架及其移动单元；离子选择性玻璃微电极，是一类利用膜电势测定溶液中离子的活度或浓度的电化学传感器，当它和含待测离子的测试溶液接触时，在它的敏感膜和溶液的相界面上产生与该离子活度直接有关的膜电势，因此用于作为检测生物体的胞外离子移动状态的检测电极；所述离子选择性玻璃微电极包括内径为0. 8mm-Imm的毛细玻璃管经过拉制仪制作的尖端直径为2-3 u m的玻璃管，所述离子选择性玻璃微电极经过硅烷化试剂处理，所述的硅烷化试剂为二甲基二氯硅烷；电极丝采用银/氯化银丝，电极液对于待测离子为K+ =IOOmMKCl ;测试溶液中所含离子组成与生物体所处微环境的离子组成相同；离子敏感膜被灌注在离子选择性玻璃微电极尖端，其中，离子敏感膜采用Sigma公司的离子敏感膜试剂钾离子载体I-混合物B (Potassium K+ionophore I-cocktail B),该离子敏感膜试剂用来测试K+。电极阻抗测试单元，可采用恒温有源晶振0C14产生4. 096MHz信号，经过分频器4096倍分频得到，IKHz信号，经过分压输出50mV，用于测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗是否符合测试要求；阻抗变换单元，采用高阻抗放大器AD515，阻抗大于等于IO13Q,放大倍数10倍，用于提高输入阻抗；模拟信号锁存单元，采用LF398，用于当所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处时，锁存Xl处的电压Vl ；电极支架及其移动单元，用于固定所述离子选择性玻璃微电极以及将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处；电极支架采用聚四氟乙烯制作，支架移动单元采用MP-285型电动微操纵器，最大移动速度2. 9mm/sec,高分辩率为0. 04 u m/步，行程X、Y、Z和斜线移动最大距离为25mm。放大单元，采用TLC2272。仪器仪表放大器采用AD620，其两个输入引脚分别连接放大单元输出和LF398输出，AD620的放大倍数为50倍，放大单元和AD620输出接带有2个通道模拟数字转换器A/D的采集与处理单元中的一个A/D通道，A/D通道采用分辨率不低于16位的E A型A/D转换器，如系统选择AD7713则有24位分辨率；滤波单元的滤波器采用RC低通滤波设计，R=IOk QjC=IuF ;环境温度检测单元可采用AD590，测试溶液的温度检测也可采用AD590，AD590被封装在玻璃管中与溶液接触。所述的采集与处理单元，包括模拟数字模拟转换器A/D、16个数字I/O输出及PC计算机系统。系统校准单元采用ISL21090精密电压基准输出芯片2. 5V电压，用温漂25ppm/°C的10只IOK电阻进行分压，产生10个标准电压，可以通过K6开关闭合接通依次将10个电压通过阻抗变化单元、放大单元、仪器·仪表放大器、滤波单元送至采集与处理单元以便系统得到标准电压进行系统校准，此时开关 K0、K1、K2、K3、K4 和 K5 均断开。其中，连接关系表现为所述离子选择性玻璃微电极与用于测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗是否符合测试要求的电极阻抗测试单元相连接，所述电极阻抗测试单元与用于提高输入阻抗的阻抗变换单元相连接，所述阻抗变换单元与用于当所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处时，锁存Xl处的电压Vl的模拟信号锁存单元相连接，电极支架及其移动单元与所述离子选择性玻璃微电极相连接，用于固定所述离子选择性玻璃微电极以及将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处。该系统还包括用于放大输入信号电压与所述阻抗变换单元相连接的放大单元、与所述放大单元和所述模拟信号锁存单元相连接的仪器仪表放大器、与所述放大单元和所述仪器仪表放大器相连接的滤波单元、与所述滤波单元相连接的采集与处理单元，与所述采集与处理单元相连接的温度检测单元或与所述电极阻抗测试单元和所述阻抗变换单元以及所述采集与处理单元相连接的系统校准单元。实施例2 本实施例还提出了一种生物体的胞外离子移动状态的检测方法，如图3所示，所述方法包括SI、测量离子选择性玻璃微电极的阻抗，所述阻抗是否符合测试要求，若是，则继续步骤S2，若否，则更换所述离子选择性玻璃微电极；所述测试要求为所述阻抗大于等于50MQ且小于等于IO10Q ；S2、将所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处，测量Xl处电压VI，并将所述电压锁存；S3、将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处，测量并获得X2处电压V2与Xl处电压Vl的差值AV;S4、根据八￥、￥1，计算出乂2处电压￥2，并利用公式￥ = 1^1§(计算出乂1处和父2处之间的浓度Cl和C2，并计算Xl处和X2处之间的浓度差A C，k为截距，s为斜率；
ArS5、根据AC和AX，利用公式/ =—厶——计算出所述测试溶液中待测离子的
AX移动速率J，所述AX为Xl处和X2处之间的距离，D为所述待测离子的扩散常数，若计算出所述待测离子的移动速率的数值为负数，则表示所述待测离子向细胞方向迁移；若为正数，则表示所述待测离子向细胞外扩散。测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗的方法具体包括取一支制作好的离子选择性玻璃微电极，电极阻抗测试单元中的信号源产生IKHz方波，该信号源为电流源型，用开关Kl闭合选择标准电阻R=IOMQ,则信号源产生的方波的电压为方波的电流与标准电阻R的乘积，产生的方波信号经过闭合开关K1、K4、K5(此时KO、K2、K3和K6断开状态)、阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，测试采集与处理单元输出的方波信号，读取幅值电压V0，幅度为14mV ;再用K2闭合选择待测离子选择性玻璃微电极，产生的方波的电压为方波的电流与所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的乘积，产生的方波信号经过闭合开关K2、K3和K5、阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，测试米集与处理单兀输出的信号，若仍为方波信号，则测试该方波信号的幅值电压为Vx,幅
Vx
值为112mV，计算离子选择性玻璃微电极阻抗Z = — X i 为80MQ ;若此时得到的信
VO
号不为方波信号，则将Kl、K2、K0、K3和K4都接通(此时K6断开)，即电极阻抗测试单元同时选择所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电极，电极阻抗测试单元中的信号源产生方波，产生的方波的电压为方波的电流与所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的并联阻抗Rl的乘积，产生的方波信号经过阻抗变换单元、放大单元、滤波单元和采集与处理单元后，测试采集与处理单元输出的信号，若仍为方波信号，则测试此时信号的幅
值电压V3，计算此时的并联阻抗值i l = ^x i ，并利用公式Zz1^计算离子选
V OR - /\1
择性玻璃微电极阻抗。以某次制作的K+离子选择性玻璃微电极为例，可以计算出V3=13. 92mV,根据
V3RR\
Rl = — x i ，R1=9.942857MQ，利用公式Z = ■，计算玻璃微电极阻抗为KuK — RI
1.739GQ，该离子选择性玻璃微电极阻抗符合测试要求的大于等于50MQ且小于等于
IO10Q,因此利用该离子选择性玻璃微电极能够获得准确的测量结果。将配置好的含有K+离子的ImM标准液Cl和IOmM标准液C2，用离子选择性玻璃微电极电极、开关K3、K5闭合接通(此时，K0、Kl、K2、K4和K6断开状态)、阻抗变换单元、电极测量背景浓度的模拟信号锁存单元、放大单元、滤波单元、采集与处理单元，分别测量得到与两个浓度对应的两个电压值，Vl=-32. 55mV和V2=27. 39mV,根据Vl和V2，利用公式V =k+slgC,计算得到 k=_32. 55mV, s=59. 95mV/decade,其中，decade 为 10 倍浓度变化。将测试样品放置测试溶液中，测试溶液的成分包括0. 5mM CaCl2，2. 5mMHepes-NaOH(pH 6. 5), IOmM鹿糖，I. 2mM KC1。此时，需要测定K+离子流动的流速，在显微镜的帮助下，离子选择性玻璃微电极由电极支架及其移动单元定位于与测试溶液表面5 u m-15 u m之处，为位置XI，利用开关K3、K5闭合接通(此时，K0、KU K2、K4和K6断开状态)、阻抗变换单元、放大单元、电极测量背景浓度的模拟信号锁存单元对位置I的背景浓度的电极测量模拟信号的电压值Vl进行锁存，同时依据所得公式V = -32. 55+59. 951gC，若实际测得Vl=-27. 803mV可计算出Cl=L 2mM ;将离子选择性玻璃微电极移一定微小距离，该微小距离30iim,此时为位置X2,位置X2和位置Xl的距离为30 y m。同时放大单元输出V2与Vl的差A V=-O. 021789mV被仪器仪表放大器AD620放大、再滤波，经数据采集与处理单元，
公式 V =-32. 55+59. 951gC，可以计算出 A C=-O. OOlmM，利用/ = -I)—,其中，D 为
AX
K+离子扩散常数=1.92*10_5 〃 cm2 〃 s'计算得到离子的移动速度为J=-9.6pmol.Cm-2.sec-1, 表不离子的向细胞方向迁移。作为系统的测试，采用IOOmMKCl (溶液中含0. 1%LMP Agarose)作为离子源，则利用本系统进行检测的检测结果如图4所示，离子呈稳定扩散。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
权利要求
1.ー种生物体的胞外离子移动状态的检测系统，其特征在于，所述系统包括离子选择性玻璃微电极、电极阻抗测试単元、阻抗变换単元、模拟信号锁存单元和电极支架及其移动单元； 所述离子选择性玻璃微电极用于作为检测测试样品的胞外离子移动状态的检测电扱；所述离子选择性玻璃微电极与用于测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗是否符合测试要求的所述电极阻抗测试単元相连接，所述电极阻抗测试単元与用于提高输入阻抗的所述阻抗变换単元相连接，所述阻抗变换单元与用于当所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处时，锁存Xl处的电压Vl的所述模拟信号锁存单元相连接；，所述电极支架及其移动单元与所述离子选择性玻璃微电极相连接，所述电极支架及其移动单元用于固定所述离子选择性玻璃微电极以及将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处。
2.根据权利要求I所述的系统，其特征在于，所述离子选择性玻璃微电极包括尖端直径为2-3iim的玻璃管。
3.根据权利要求I或2中任一项所述的系统，其特征在于，所述离子选择性玻璃微电极经过硅烷化试剂处理，所述硅烷化试剂为ニ甲基ニ氯硅烷。
4.根据权利要求I所述的系统，其特征在于，所述测试溶液中所含离子组成与测试样品所处微环境的离子组成相同。
5.根据权利要求I所述的系统，其特征在于，所述阻抗变换单元的阻抗大于或等于IO13Q。
6.根据权利要求I所述的系统，其特征在于，所述系统还包括用于放大输入信号电压与所述阻抗变换单元相连接的放大单元、与所述放大単元和所述模拟信号锁存单元相连接的仪器仪表放大器、与所述放大単元和所述仪器仪表放大器相连接的滤波单元、与所述滤波単元相连接的采集与处理单元、与所述采集与处理单元相连接的温度检测单元和与所述电极阻抗测试単元和所述阻抗变换单元以及所述采集与处理单元相连接的系统校准単元。
7.—种生物体的胞外离子移动状态的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤 51、测量离子选择性玻璃微电极的阻抗，所述阻抗是否符合测试要求，若是，则继续步骤S2，若否，则更换所述离子选择性玻璃微电极； 52、将所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面Xl处，測量Xl处电压VI，并将所述电压锁存； 53、将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离所述测试样品表面X2处，測量并获得X2处电压V2与Xl处电压Vl的差值AV; 54、根据AV、V1，计算出X2处电压V2，并利用公式V = k+slgC计算出Xl处和X2处之间的浓度Cl和C2，并计算Xl处和X2处之间的浓度差A C，k为截距，s为斜率； 55、根据AC和AX，利用公式
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤SI中所述测试要求为所述离子选择性玻璃微电极电极阻抗大于等于50MQ且小于等于IOltlQ。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在干，测量离子选择性玻璃微电极的阻抗的方法具体包括 s11、电极阻抗测试単元选择标准电阻R，电极阻抗测试単元中的信号源产生方波，则产生的方波的电压为方波的电流与所述标准电阻R的乘积，产生的方波经过阻抗变换单元、放大单元和采集与处理单元后，测试采集与处理单元输出的方波的幅值电压V0，所述信号源为电流源； s12、电极阻抗测试単元选择所述离子选择性玻璃微电极，电极阻抗测试単元中的信号源产生方波，则产生的方波的电压为方波的电流与所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的乘积，产生的方波经过阻抗变换単元、放大单元和采集与处理单元后，若采集与处理单元的输出仍为方波，则测试采集与处理单元输出的方波的幅值电压为Vx，则所述离子选择性玻璃微电极的阻抗为 若采集与处理单元的输出不为方波，则跳转步骤S13; s13、电极阻抗测试単元同时选择所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电扱，电极阻抗测试单元中的信号源产生方波，产生的方波的电压为方波的电流与所述标准电阻R和所述离子选择性玻璃微电极的阻抗的并联阻抗的乘积，产生的方波经过阻抗变换単元、放大单元和采集与处理单元后，若采集与处理单元的输出仍为方波，则测试采集与处理单元输出的方波的幅值电压V3，计算此时的并联阻抗 ，则所述离子选择性玻璃微电极阻抗
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，若计算出所述待测离子的移动速率的数值为负数，则表示所述待测离子向细胞方向迁移；若为正数，则表示所述待测离子向细胞外扩散。
全文摘要
本发明提供了一种生物体的胞外离子移动状态的检测系统及方法，具体包括离子选择性玻璃微电极，用于作为检测生物体的胞外离子移动状态的检测电极；电极阻抗测试单元，用于测量离子选择性玻璃微电极电极阻抗是否符合测试要求；阻抗变换单元，用于提高输入阻抗；模拟信号锁存单元，用于当所述离子选择性玻璃微电极定位于距离测试样品表面X1处时，锁存X1处的电压V1；电极支架及其移动单元，用于固定所述离子选择性玻璃微电极以及将所述离子选择性玻璃微电极移动到距离测试样品表面X2处。本发明采用电极阻抗测试单元对离子选择性玻璃微电极的电极阻抗进行测试，以确定离子选择性玻璃微电极的电极阻抗符合测试要求，确保检测过程的准确性。
文档编号G01R27/02GK102954988SQ20121043904
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者王忠义, 赵东杰, 黄岚, 薛林 申请人:中国农业大学