专利名称：糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒。
背景技术：
糖尿病是一组高血糖疾病的总称，按病因和发病机理分为1型糖尿病型(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)及其它类型。T1DM又称免疫介导性糖尿病，是自身抗体破坏胰岛细胞使胰岛素合成和分泌减少而引起。T2DM是机体对胰岛素抵抗，胰岛素相对减低而引起，所以检测糖尿病自身抗体对糖尿病准确分型是临床糖尿病防治的主要依据，目前确认的糖尿病自身抗体有胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)和谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)，常用酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫法(RIA)测定，由于检测方法的限制，在不同的试验室检测结果差异较大。免疫印迹技术为国际上公认的确认试验，我国卫生部把此方法，推荐为艾滋病(HIV)等重大传染性疾病的确认方法。我们发明了糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒对ICA、IAA、和GADA联合检测，以便临床对糖尿病的诊断和分型。

发明内容
本发明的目的是提供一种糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，它能同时检测糖尿病患者血清中的胰岛素、谷氨酸脱羧酶和胰岛细胞等多种自身抗体，用于糖尿病分型，同时为临床糖尿病治疗、预测、预防提供参考依据。
为了达到上述目的，本发明由以下的技术方法来实现。
一种糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于试剂盒的组成成份包括置反应槽内的印迹膜条、酶联试剂、显色剂A、显色剂B、终止液、浓缩洗涤液、标准区带，将胰岛细胞提取的混蛋白抗体含有胰岛素、谷氨酸脱羧酶和胰岛细胞的多种蛋白成份；利用蛋白质印迹技术，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE，按分子量大小依次分开，再通过印迹技术转移至印迹膜上，其印迹膜条上即含有按分子量大小不同排列的各种胰岛细胞自身抗原成份，将其放入反应槽与待测血清反应，如待测血清含有自身抗体，将会分别与相应抗原结合，再加入酶联免疫显色试剂，就会在抗原、抗体结合位置出现显色区带，与标准带对照即可判断待测血清中含有何种抗体，其抗体的有无及抗体的种类和数量，对糖尿病分型诊断、预测、预防有重要的临床意义。
具体实施例方式
下面的实施例和制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1本试剂盒的组成成份包括置反应槽内的印迹膜条5板每板8条、酶联试剂0.5ml、显色剂A25ml、显色剂B25ml、终止液25ml、浓缩洗涤液25ml、标准区带。静脉取血2-5ml，置试管待凝固后离心分离血清，血清标本保存于2-8℃，在24小时内不能测试的标本应放-20℃保存，严重溶血，有絮状物或霉变的血清标本会影响测试。
测定步骤1、洗涤应用液的配制在2-8℃贮存的浓缩洗涤液会有结晶析出，将整瓶(25ml)浓缩洗涤用蒸馏水或去离子水稀释至500ml，放入试剂瓶中，标签上注明配制时间，保存于2-8℃，有效期6个月，如有絮状物或霉变应废弃。
2、在含有印迹膜条的反应槽中加入洗涤应用液1ml和待检血清10ul。
3、置摇床上室温下(20℃以上，37℃以下)摇动30分钟。
4、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1ml，洗涤1分钟弃去反应槽液体，反复洗涤4次，最后在吸水纸上拍干液体。
5、在反应槽中加入洗涤应用液0.5ml和酶联试剂10ul。
6、置摇床上室温下(20℃以上，37℃以下)摇动30分钟。
7、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1ml，洗涤1分钟弃去反应槽液体，反复洗涤4次，最后在吸水纸上拍干液体。
8、在反应槽中分别加入显色剂A 0.5ml，显色剂B 0.5ml。
9、在摇床上摇动2-10分钟，显色。
10、待质控带和阳性区带显色清晰后加终止液0.5ml，在摇床上摇动2分钟。
11、用自来水冲去槽中液体，取出印迹膜条，置吸水纸上，待干后与标准带对照判断结果。
结果判断将印迹膜上端起始线与标准带起始线对齐，观察阳性显色区带与对应的标准带位置即可判断显色带是何种自身抗体。根据自身抗体的有无或多少，对糖尿病诊断、分型、治疗、预测、防治提供参考依据。糖尿病自身抗体免疫印迹标准带使用前确认产品注册号、批号、有效期、检验合格证是否齐全、有效；印迹膜铝箔袋有无漏气现象；试剂瓶有无漏液现象。操作环境温度应不低于20℃，若环境温度过低，应置于37℃温箱中操作。待测标本宜用新鲜血清或全血，如当天不检测，应置4℃保存；超过24小时以上，需置-20℃以下保存。判断结果时，应首先观察质控带是否出现，如未出现，请及时与厂家联系。不同批号的标准带不能混用。本试剂盒仅用于体外诊断，置2-8℃冷藏，不宜冷冻。
权利要求
1.一种糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于试剂盒的组成成份包括置反应槽内的印迹膜条、酶联试剂、显色剂A、显色剂B、终止液、浓缩洗涤液、标准区带，将胰岛细胞提取的混合蛋白抗原(胰岛素、谷氨酸脱羧酶和胰岛细胞的多种蛋白成份)，利用蛋白印迹技术，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，按分子量大小依次分开，再转移至印迹膜上，其印迹膜条上即含有按分子量大小不同排列的各种胰岛细胞自身抗原成份，将其放入反应槽与待测血清反应，如待测血清含有自身抗体，将会分别与相应抗原结合，再加入酶联免疫显色试剂，就会在抗原、抗体结合位置出现显色区带，与标准带对照即可判断待测血清中含有何种抗体及抗体种类和数量。
2.根据权利要求1所述的糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于试剂盒和测定步骤①、洗涤应用液的配制在2-8℃贮存的浓缩洗涤液会有结晶析出，将整瓶(25ml)浓缩洗涤用蒸馏水或去离子水稀释至500ml，放入试剂瓶中，标签上注明配制时间，保存于2-8℃，有效期6个月，如有絮状物或霉变应废弃。②、在含有印迹膜条的反应槽中加入洗涤应用液1ml和待检血清10ul。③、置摇床上室温下(20℃以上，37℃以下)摇动30分钟。④、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1ml，洗涤1分钟弃去反应槽液体，反复洗涤4次，最后在吸水纸上拍干液体。⑤、在反应槽中加入洗涤应用液0.5ml和酶联试剂10ul。⑥、置摇床上室温下(20℃以上，37℃以下)摇动30分钟。⑦、弃去反应槽液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤应用液1ml，洗涤1分钟弃去反应槽液体，反复洗涤4次，最后在吸水纸上拍干液体。⑧、在反应槽中分别加入显色剂A 0.5ml，显色剂B 0.5ml。⑨、在摇床上摇动2-10分钟，显色。⑩、待质控带和阳性区带显色清晰后加终止液0.5ml，在摇床上摇动2分钟。(11)、用自来水冲去槽中液体，取出印迹膜条，置吸水纸上，待干后与标准带对照判断结果。
3.根据权利要求1所述的糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于将印迹膜上端起始线与标准带起始线对齐，观察阳性显色区带与对应的标准带位置即可判断显色带是何种自身抗体，根据自身抗体的有无或多少，对糖尿病诊断、分型、治疗、预测、防治提供参考依据，利用糖尿病自身抗体免疫印迹标准带对照。
全文摘要
本发明公开了一种糖尿病自身抗体免疫印迹试剂盒，将胰岛细胞提取的混合蛋白抗体含有胰岛素、谷氨酸脱羧酶和胰岛细胞的多种蛋白成份；利用蛋白印迹技术，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，按分子量大小依次分开，再转移至印迹膜上，其印迹膜条上即含有按分子量大小不同排列的各种胰岛细胞自身抗原成份，将其放入反应槽与待测血清反应，如待测血清含有自身抗体，将会与相应抗原结合，再加入酶联和显色试剂，就会出现显色区带，与标准带对照即可判断待测血清中是否含有胰岛素抗体、谷氨酸脱羧酶抗体和胰岛细胞抗体，对糖尿病分型诊断、预测、预防有重要的临床意义。
文档编号G01N21/78GK101042399SQ20071013567
公开日2007年9月26日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者马伟民, 张永顶 申请人:深圳市伯劳特生物制品有限公司