专利名称：蜂胶与杨树胶的鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种杨树胶中特有而蜂胶中没有的酚苷类物质-水杨苷测定方法，用 于鉴定是纯的蜂胶还是混有杨树胶的蜂胶。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂采集植物叶芽或树皮裂缝处分泌的树脂并混入上颚腺分泌物和蜂蜡 而成的芳香固体物，主要由蜂蜡，树脂和挥发性物质组成，其中蜂蜡是由蜜蜂分泌的，而具 有生物学作用的树脂和挥发性物质则来源于胶源植物。胶源植物主要有杨树，桦树，榆树， 松树，橡树，栗树和桉树等。基于蜂胶与胶源植物成分对比研究，现在普遍认为温带地区蜂 胶的主要来源是杨属和其杂交属。蜂胶因其具有广泛的生物学活性，如抗癌，抗氧化，抗炎，抗菌和抗真菌活性，受到 了人们广泛的关注，在医疗保健等领域得到了广泛的应用，然而，蜂胶的生产受到蜂种、采 胶方式以及胶源情况的影响，产量相对较低，一直处于供不应求状况。因杨树芽提取物与杨 树型蜂胶提取物在成分、颜色、气味上极其相似，近年来在蜂胶中掺入杨树胶(杨树芽提取 物)的现象屡屡发生。现行蜂胶质量控制主要针对类黄酮和多酚两大类成分，而这两类成 分杨树芽提取物与杨树型蜂胶同时存在，这使得区分蜂胶和杨树胶变得相当因难。因此，建 立一种有效区分蜂胶与杨树胶的分析方法是控制蜂胶质量的关键。杨属植物的特征性成分是酚苷，以水杨苷、柳皮苷，2’_苯甲酸水杨苷，特里杨苷含 量较为丰富。尽管蜂胶中化学成分的研究很多，迄今为止尚未有蜂胶中存在任何酚苷的报 道，而蜂胶中含有水杨酸及乙酰水杨酸等衍生物的报道较多。由于杨属植物中发现的酚苷 为β _葡萄糖苷形式，因此我们推测蜜蜂在采集蜂胶以及蜂巢内传递蜂胶的过程中已将酚 苷水解。水杨苷是酚苷的基本结构单元，是更高级的水杨酸盐类衍生物的主要降解产物之 一，在所有研究过的杨属植物的皮，叶，花，芽中均有分布。水杨苷在甲醇、酸性、碱性及中性 介质中均稳定存在，而且水杨苷标准品易得，价格便宜。因此，我们以水杨苷为参照，建立区 分蜂胶与杨树胶的高效液相色谱(HPLC)方法。

发明内容
本发明目的是提供一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，是用HPLC测定水杨苷来判断 蜂胶的真假，从而控制蜂胶质量。用HPLC测定水杨苷具有灵敏度高，重复性强等优点，用该 方法判断蜂胶真假具有准确度高，灵敏度强、时间短以及成本低的优点。本发明的目的是通过以下方案实现(1)用甲醇溶解水杨苷标准品，膜过滤，用HPLC进行分析，得到水杨苷标准品的色 谱图；(2)将纯蜂胶用甲醇溶解，过滤后制得纯蜂胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析， 得到纯蜂胶的色谱(3)将杨树胶用甲醇溶解，过滤后制得杨树胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析， 得到杨树胶的色谱图；(4)将掺入5%、10%、20%、30%、40%杨树胶的纯蜂胶_)分别用甲醇溶解，过 滤后制得纯蜂胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析，得到相应的色谱图；(5)将蜂胶色谱图、杨树胶色谱图以及掺入不同比例杨树胶的蜂胶色谱图与水杨 苷标准品色谱图比较确定蜂胶的真假。本发明所述的液相色谱仪的条件为流速为0. 5 1. OmL/min,检测波长为210 230nm, 260 275nm，进样量为 2 20 μ L，色谱柱为 S印ax HP-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m)或相 当的色谱柱，柱温为25 35°C。本发明所述的流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95。
本发明所述的杨树胶样本中含有水杨苷(S峰)以及未知峰A峰，而蜂胶样本中不 含有这两个峰。通过与水杨苷标准品对照，如果HPLC谱图中检测到水杨苷或A峰，则表明 为杨树胶，如果相应位置不出峰，则为蜂胶。本发明经采自不同地区的蜂胶样本以及市场购得的杨树胶样本进行反复验证，证 明该方法分离效果好、灵敏度高，可行性强，因此，该方法可以定性鉴别蜂胶与杨树胶。本发 明对蜂胶中掺入10%以上的杨树胶均可鉴别。目前，有关蜂胶与杨树胶的鉴别方法主要是应用HPLC进行指纹鉴别，但是受仪 器、实验条件等条件限制，在不同条件下指纹图谱的重现性很差，给鉴别带来难度，方法很 难普及。本发明首次提出明确的标准品(水杨苷)，即使在不同条件下操作，根据水杨苷的 出峰时间及紫外吸收，可以进行准确鉴别。


图1为实例1水杨苷标准品、蜂胶、掺入不同比例杨树胶的纯蜂胶及杨树胶的色谱图。图2为实例2水杨苷标准品、蜂胶和杨树胶样本的色谱图。图3为实例3水杨苷标准品、蜂胶和杨树胶样本的色谱图。图4为实例4水杨苷标准品、蜂胶和杨树胶样本的色谱图。
具体实施方案本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1准确称取1. Omg水杨苷，用甲醇定容到IOOml。过0. 45 μ m滤膜，用HPLC分析。采 用 S印ax HP-C 18(4. 6X 150mm, 5 μ m)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流 速调整至l.OmL/min，检测波长213nm，柱温30°C，进样量5yL。参见图Ia0取纯蜂胶lg，甲醇溶解，过滤得到纯蜂胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至l.OmL/min，检测波长213nm，柱温30°C，进样量5yL。参见图 lb。分别取掺入5%、10%、20%、30%、40%杨树胶的纯蜂胶18，甲醇溶解，过滤得到相应的溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0.5% H3PO4 = 5 95，流速调整至
1。OmL/min，检测波长213nm，柱温30°C，进样量5μ L。参见图lc、Id、le、If、Ig为掺入5%、 10%,20%,30%,40%杨树胶的纯蜂胶液相色谱图。取杨树胶lg，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至l.OmL/min，检测波长213nm，柱温30°C，进样量5yL。参见图 Ih0图Ia 水杨苷标准品；b 纯蜂胶；c 掺入5%杨树胶的蜂胶；d 掺入10%杨树胶 的蜂胶；e 掺入20%杨树胶的蜂胶；f 掺入30%杨树胶的蜂胶；g 掺入40%杨树胶的蜂 胶；h 杨树胶。代表峰S为水杨苷；A为未知峰。实施例2准确称取1. Omg水杨苷，用甲醇定容到IOOml。过0. 45 μ m滤膜，用HPLC分析。采 用 S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流 速调整至0. 8mL/min，检测波长220nm，柱温33°C，进样量2μ L。参见图2。分别取纯蜂胶lg，甲醇溶解，过滤得到纯蜂胶溶液，用甲醇定容至50ml，过 0.45 μ m滤膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m)的色谱柱，流动相为 乙腈0.5% H3PO4 = 5 95，流速调整至0. 8mL/min，检测波长220nm，柱温33°C，进样量 2μ L。参见图2。取杨树胶lg，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至0.8mL/min，检测波长220nm，柱温33°C，进样量2yL。参见图
2。图中a水杨苷标准品；b 纯蜂胶；c 杨树胶。代表峰S为水杨苷；A为未知峰。实施例3准确称取1. Omg水杨苷，用甲醇定容到IOOml。过0. 45 μ m滤膜，用HPLC分析。采 用 S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流 速调整至0. 5mL/min，检测波长269nm，柱温35°C，进样量10 μ L。参见图3。取纯蜂胶lg，甲醇溶解，过滤得到纯蜂胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至0. 5mL/min，检测波长269nm，柱温35°C，进样量10yL。参见图3。取杨树胶lg，甲醇溶解，过 滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至0. 5mL/min，检测波长269nm，柱温35°C，进样量10yL。参见图 3。图中a 水杨苷标准品；b 纯蜂胶；c 杨树胶。代表峰S为水杨苷；A为未知峰。实施例4准确称取1. Omg水杨苷，用甲醇定容到IOml。过0. 45 μ m滤膜，用HPLC分析。采 用 S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流 速调整至lmL/min，检测波长265nm，柱温25°C，进样量20yL。参见图4。
取纯蜂胶lg，甲醇溶解，过滤得到纯蜂胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至lmL/min，检测波长265nm，柱温25°C，进样量20yL。参见图4。取杨树胶lg，甲醇溶解，过滤得到杨树胶溶液，用甲醇定容至50ml，过0. 45 μ m滤 膜，用HPLC分析。采用S印ax HP-C18(4. 6X150mm,5ym)的色谱柱，流动相为乙腈0. 5% H3PO4 = 5 95，流速调整至lmL/min，检测波长265nm，柱温25°C，进样量20yL。参见图4。 图中a 水杨苷标准品；b 纯蜂胶；c 杨树胶。代表峰S为水杨苷；A为未知峰。
根据上述方法，分别测定了水杨苷标准品，蜂胶，掺入不同比例杨树胶的纯蜂胶及 杨树胶的液相色谱图谱，其中水杨苷和A峰均未在蜂胶样本中检出，而在杨树胶中峰面积 较大，含量较高。本发明可以在掺入10%杨树胶的纯蜂胶中检测到A峰的存在，在掺入20% (含20%)以上杨树胶的纯蜂胶样本中同时检测到水杨苷和A峰存在。因此，本方法适用 于蜂胶样本中掺有10%以上杨树胶的鉴别。
权利要求
一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，是用HPLC测定水杨苷，通过以下方案实现(1)用甲醇溶解水杨苷标准品，膜过滤，用HPLC进行分析，得到水杨苷标准品的色谱图；(2)将纯蜂胶用甲醇溶解，过滤后制得纯蜂胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析，得到纯蜂胶的色谱图；(3)将杨树胶用甲醇溶解，过滤后制得杨树胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析，得到杨树胶的色谱图；(4)将掺入5％、10％、20％、30％、40％杨树胶的纯蜂胶(W/W)分别用甲醇溶解，过滤后制得纯蜂胶溶液，滤膜过滤，用HPLC进行分析，得到相应的色谱图；(5)将蜂胶色谱图、杨树胶色谱图以及掺入不同比例杨树胶的蜂胶色谱图与水杨苷标准品色谱图比较确定蜂胶的真假。
2.根据权利要求1所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，期特征在于，液相色谱仪 条件为流速为0. 5 1. OmL/min,检测波长为210 230nm，260 275nm，进样量为2 20ii L，色谱柱为S印ax HP-C18，柱温为25 35°C，流动相为乙腈0. 5% H3P04 = 5 95。
全文摘要
本发明提供一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，是用HPLC测定水杨苷来判断蜂胶的真假，从而控制蜂胶质量。用HPLC测定水杨苷具有灵敏度高，重复性强等优点，用该方法判断蜂胶真假具有准确度高，灵敏度强、时间短以及成本低的优点。本发明首次提出明确的标准品(水杨苷)，即使在不同条件下操作，根据水杨苷的出峰时间及紫外吸收，都可以进行准确定性鉴别蜂胶与杨树胶，该方法分离效果好、灵敏度高，可行性强，对蜂胶中掺入10％以上的杨树胶均可鉴别。
文档编号G01N30/02GK101871919SQ20101018067
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者张翠平, 胡福良 申请人:浙江大学