专利名称：检测虾过敏原的免疫胶体金层析试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及到一种检测虾过敏原的免疫胶体金层析试纸条及试纸条的制备，属于 免疫学检测技术领域。
背景技术：
近年来，食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题，而虾是最常见的八大食品 过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随 着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。为了避免 接触微量的过敏原，过敏原的检测成为当务之急。现在，虽然有许多过敏原检测方法可供借 鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。体内实验方法可提供最为直接的证据，但由 于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与 此相比体外实验方法具有方便、安全的优点，但却存在着准确性差的缺点。目前体外微量的 检测方法有免疫法、PCR法、组胺释放实验法、过敏原指纹快速检测法等。虽然目前有关过 敏原检测的方法很多，但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析 仪器等，这些制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通 量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。

发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作 方法简单的免疫层析色谱检测方法，用于食品中虾原肌球蛋白的批量、快速检测。( 二 )技术方案一种检测虾过敏原-虾原肌球蛋白的免疫胶体金层析试纸条，由1、PVC背衬，2、硝 酸纤维素膜，3、样品垫，4、胶体金结合垫和5、吸水垫组成，PVC背衬一端依次粘贴样品垫、 胶体金结合垫，中间粘贴硝酸纤维素膜，另一端粘贴吸水垫，胶体金结合垫上包被了抗虾原 肌球蛋白的簇特异性抗体_胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有虾原肌球蛋白检测 线(6)和羊抗兔IgG控制线(7)。该检测层析试纸条及所用试剂的制备方法包括以下步骤(1)提取纯化的虾原肌球蛋白将虾肉勻浆，0. OlM PBS(pH7. 4)溶液浸取24h， 50%饱和硫酸胺溶液沉淀，4°C 8000g离心15min后收集沉淀溶于0.01MPBS(pH 7.4)溶 液中，然后在该PBS溶液中透析48h脱盐，最后凝胶柱过滤(柱子=Superdex 75 10/300 GL (GE公司生产)；缓冲液:pH 7. 4、0· OlM PBS ；流速0. 35mL/min)，获得纯化的虾原肌球蛋 白；(2)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体用上述提取纯化的虾原肌球蛋白为免疫 原，多次免疫新西兰纯种大白兔，并在三次加强免疫后测定其效价和抑制率，在适合的时候 心脏采血，分离血清。血清用ProteinG亲和柱进行纯化即可得到高纯度的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体；(3)制备胶体金用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗 粒；(4)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体-胶体金标记物将3mL胶体金调至PH 9，搅 拌下逐滴加入蛋白浓度为0. 075mg/mL的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体0. 2mL，放置30min后 加入牛血清白蛋白BSA使终质量浓度为1 %，放置至少30min后，IOOOOrpm离心50min，并用 重悬液0. 002mol/L、pH9. 0的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用0. 3mL重悬液重悬，得到 稳定的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体_胶体金标记物；(5)将抗虾原肌球蛋白多克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将虾 原肌球蛋白、羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜上作为检测线及控制线，在37°C烘箱干 燥；(6)试纸条的组装将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次 粘贴在PVC背衬上，即得到用于检测虾过敏原-虾原肌球蛋白的免疫胶体金层析试纸条。本发明的积极效果在于快速，仅需要5-10分钟；便携，适合现场检测；操作简便， 不需要专业技术人员。实现了准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测虾过敏原 的技术方法。


图1组装完成的免疫层析试纸条结构。1、PVC背衬，2、硝酸纤维素膜，3、样品垫， 4、胶体金结合垫，5、吸水垫，6、检测线，7、羊抗兔IgG控制线。
图2组装完成的免疫层析试纸条结构俯视图。
具体实施例方式实施例1PVC背衬一端依次粘贴样品垫、胶体金结合垫，中间粘贴硝酸纤维素膜，另一端粘 贴吸水垫，结合垫上包被了抗虾原肌球蛋白簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜 上包被了虾原肌球蛋白和羊抗兔IgG。按以下步骤制备(1)提取纯化虾原肌球蛋白将虾肉勻浆，用0. OlM PBS(pH7. 4)溶液浸取24h， 50%饱和硫酸胺溶液沉淀，4°C 8000g离心15min后收集沉淀溶于0. OlMPBS (pH 7. 4)溶液 中，然后在该PBS溶液中透析48h脱盐，最后凝胶过滤(柱子=Superdex 75 10/300 GLjl 冲液:pH 7. 4、0· OlM PBS ；流速0. 35ml/min)；(2)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体；用上述提取纯化的虾原肌球蛋白多次免疫 新西兰纯种大白兔，并在三次加强免疫后测定其效价和抑制率，在适合的时候心脏采血，分 离血清。血清用proteinG亲和柱进行纯化即可得到高纯度的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体；(3)制备胶体金用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒。柠檬酸三钠还原法制备胶体金由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯 化金时，必须一次配完。将Ig的氯化金一次溶解于双蒸水中配成的水溶液。放在4°c 冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为 0. lg/L的氯金酸溶液。取0. lg/L氯金酸溶液50mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至
4沸腾并持续2min，在lOOr/min磁力搅拌下，加入柠檬酸三钠水溶液2mL，保持温度和搅 拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4°C保存备用。获得 直径为20-40nm的胶体金溶液。(4)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体_胶体金标记物将胶体金调至PH 9左右， 搅拌下逐滴加入最佳标记量的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体，放置30min后加入适量BSA，放 置至少30min后，10000转50min离心并重悬两次，最后一次用1/10量的重悬液重悬，得到 稳定的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体_胶体金标记物；(5)将抗虾原肌球蛋白多克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将虾 原肌球蛋白和羊抗兔IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线和控制线，在 37 °C烘箱充分干燥；(6)试纸条的组装将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次 粘贴在PVC背衬上，用切条机切割成3mm宽的细条。即得到用于检测虾过敏原_虾原肌球 蛋白的免疫层析试纸条。4°C冷藏备用。样品前处理称取可能含虾过敏原的食品2. 0g(海鲜酱)用均质器均质，加入6mL 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，充分混合后放入60 V水浴环境中60min，取出后6000r离心 lOmin，取上清液，以上清液去离子水为1 9的体积比进行稀释，取20yL进行分析。检测时将吸水垫浸入样本溶液，IOs后取出平放在操作台上；5-15min内可以判定 结果，30min后结果无效。结果判断样品中有虾原肌球蛋白存在且达到0. 1 μ g/mL，则检测 线将不出现红色条带，而在控制线出现红色条带，此时结果为阳性；如果样本中没有虾过敏 原(原肌球蛋白)存在或数量在0. lyg/mL以下，则检测线出现红色条带，控制线也同时出 现红色条带，此时结果为阴性；无论检侧线是否出现红色条带，控制线如果没有红色条带出 现则表示该试纸条无效。
权利要求
一种检测虾过敏原-虾原肌球蛋白的免疫胶体金层析试纸条，其特征在于由样品垫(3)、胶体金结合垫(4)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(5)和PVC背衬(1)组成，PVC背衬一端依次粘贴样品垫、胶体金结合垫，中间粘贴硝酸纤维素膜，另一端粘贴吸水垫，胶体金结合垫上包被了抗虾原肌球蛋白的簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有虾原肌球蛋白检测线(6)和羊抗兔IgG控制线(7)。
2.权利要求1所述检测虾过敏原-虾原肌球蛋白的免疫胶体金层析试纸条的制备方 法，其特征在于制备步骤为(1)提取纯化虾原肌球蛋白将虾肉勻浆，用PH7. 4,0. OlM PBS缓冲溶液浸取24h，用 饱和硫酸胺溶液沉淀，4°C、8000g离心15min后收集沉淀溶于pH 7. 4,0. OlM PBS缓冲溶液 中，然后在该PBS缓冲溶液中透析48h脱盐，最后凝胶柱过滤，获得纯化的虾原肌球蛋白；(2)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体以纯化的虾原肌球蛋白为免疫原，免疫制备抗 虾原肌球蛋白多克隆抗体；(3)制备胶体金用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；(4)制备抗虾原肌球蛋白多克隆抗体-胶体金标记物将3mL胶体金调至pH9，搅拌下 逐滴加入蛋白浓度为0. 075mg/mL的抗虾原肌球蛋白多克隆抗体0. 2mL，放置30min后加入 牛血清白蛋白BSA使终质量浓度为1 %，放置至少30min后，IOOOOrpm离心50min，并用重悬 液0. 002mol/L、pH 9. 0的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用0. 3mL重悬液重悬，得到抗虾 原肌球蛋白多克隆抗体_胶体金标记物；(5)将抗虾原肌球蛋白多克隆抗体-胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将虾原肌 球蛋白、羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜上作为检测线及控制线，在37°C烘箱干燥；(6)试纸条的组装将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次粘贴 在PVC背衬上，即得到用于检测虾过敏原_虾原肌球蛋白的免疫胶体金层析试纸条。
全文摘要
检测虾过敏原的免疫胶体金层析试纸条及其制备方法，属于免疫学检测技术领域。本发明公开了以虾过敏原-原肌球蛋白的簇特异性抗体与显色物质胶体金的结合物作为检测试剂组装试剂条，进行食品中虾过敏原的检测，成本低廉，快速，便携。本发明应用的抗体是利用提取纯化的原肌球蛋白免疫健康的新西兰大白兔得到的多克隆抗体。由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好，可以用于不同样品的检测。
文档编号G01N33/558GK101881769SQ20101020169
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者严文静, 勇倩倩, 吴晓玲, 屈昌龙, 胥传来, 邓小芳, 陈莲君, 马文蔚 申请人:江南大学