专利名称：食品中苯并芘含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及食品中有毒物的检测，具体地说是一种食品中苯并芘含量的检测方 法。
背景技术：
目前已发现可以致癌的化合物约有450余种，其中200多种属于多环芳烃化合物 或其衍生物。苯并芘，又称苯并(a)芘，英文缩写BaP，是多环芳烃类化合物中致癌力很强的有 代表性的一种主要的污染物，是一种重要的化学致癌物，使用被其污染的食品，对人体健康 有很大的威胁。苯并芘可以通过各种途径进入食品1、食品加工过程的污染食品加工过程的污 染是构成食品污染的主要因素，食品在加工时，经烟熏、烧烤、油炸等高温处理后BaP的含 量可增加几百倍。2、食品贮存运输过程的污染随着贮存时间延长，附着于食品表层的BaP 可向食品的深部渗透，内层的含量可升高至总量的40-50%，从而产生更严重的污染。另外 还有饲料污染和环境污染等原因也造成食品中残留高浓度的苯并芘。目前测定苯并芘的方法有荧光分光光度法、气相色谱法和薄层层析法。荧光分光光度法是指采用荧光与薄层或荧光与纸层析结合使用的一种方法。样品 经预处理后，先用有机溶剂环己烷提取，或经皂化后提取，再将提取液经环己烷-二甲基甲 酰胺液-液分配及色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上分离BaP，因BaP在紫外光照射下呈蓝 色荧光斑点，在紫外灯下，将分离后的有BaP的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后再以荧光分光 光度计测荧光强度，与标准比较，进行定量。气相色谱法是指样品经皂化，提取，净化后用葡聚糖凝胶分离BaP，用气相色谱仪 分析BaP，比较被测物与内标物(苯并芘)的色谱峰面积，计算结果。气相色谱法测定需使 用高分辨率的玻璃毛细管柱和火焰离子检测器，灵敏度高，响应值好。薄层层析法是指将样品经与处理后经氢氧化钾皂化，环己烷萃取，将提取液经环 己烷-二甲基砜液-液分配及氧化铝或氧化铝-硅镁型吸附剂色谱柱净化，然后在氧化铝 薄层层析上进行层析分离，BaP在紫外光照时下呈紫色荧光斑点，与标准比较，定量的一种 方法。以上几种方法普遍存在试验仪器要求较高，检测过程较复杂、耗时、昂贵，样品前 处理复杂，不利于实现苯并芘的快速、简便的检测。

发明内容
本发明针对上述问题，提供一种食品中苯并芘含量的检测方法，该方法可快速、简 便、准确地定量检测苯并芘的含量。按照本发明的技术方案一种食品中苯并芘含量的检测方法，包括以下步骤(1)溶液的配制
a.包被液的配制将碳酸钠、碳酸氢钠配制成pH7. 0-8. 0的溶液，低温保存；b.洗涤液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾及吐温20配 制成pH7-8的溶液，低温保存；c.终止液的配制配制10-15%的浓硫酸；d.封闭液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、吐温20及 牛血清白蛋白配制成PH7-8的溶液，低温保存；e.底物溶液的配制将磷酸氢二钠、柠檬酸、H2O2及四甲基联苯胺配制成溶液；(2)抗体固定将苯并芘多克隆抗体用包被液稀释，以每孔100 μ 1加入酶标板中，同时设立正常 血清稀释液的阳性对照，低温过夜保存；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留3min，再倒尽， 如此重复洗涤多次；每孔中添加100 μ 1封闭液，37°C，保留Ih ；将孔中液体倒尽，加入洗涤 液，保留3min，再倒尽，如此重复洗涤多次；(3)免疫反应用封闭液稀释待测样品溶液后加入酶标板孔中，100μ 1/孔，37°C，保留l_2h，孔 中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如此重复洗涤多次；用封闭液稀释酶标苯并芘 溶液后加入孔中，100μ 1/孔，37°C，保留l_2h，孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒 尽，如此重复洗涤多次；加入底物溶液，100 μ 1/孔，避光，370C，10-15min ；加入终止液终止 反应，100 μ 1/孔；(4)检测信号的获得用酶标仪检测酶标板孔中的液体OD值，根据OD值判断样品中苯并芘的含量，根据 苯并芘含量的标准曲线可计算出样品中苯并芘的含量大小。所述重复洗涤的次数为三次；所述低温为4°C。本发明的技术效果在于本发明结合竞争酶联免疫吸附法的特点对食品中的苯并 芘含量进行检测，灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、无污染、特异性强，测试成本低。


图1是本发明的原理示意图。图2是本发明的流程图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。如图1、图2所示，本发明是一种食品中苯并芘含量的检测方法，包括以下步骤(1)溶液的配制a.包被液的配制将碳酸钠、碳酸氢钠配制成pH7. 0-8. 0的溶液，低温保存；b.洗涤液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾及吐温20配 制成pH7-8的溶液，低温保存；c.终止液的配制配制10-15%的浓硫酸；d.封闭液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、吐温20及 牛血清白蛋白配制成PH7-8的溶液，低温保存；
e.底物溶液的配制将磷酸氢二钠、柠檬酸、H2O2及四甲基联苯胺配制成溶液；(2)抗体固定将苯并芘多克隆抗体用包被液稀释，以每孔100 μ 1加入酶标板中，同时设立正常 血清稀释液的阳性对照，低温过夜保存；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留3min，再倒尽， 如此重复洗涤多次；每孔中添加100 μ 1封闭液，37°C，保留Ih ；将孔中液体倒尽，加入洗涤 液，保留3min，再倒尽，如此重复洗涤多次；(3)免疫反应用封闭液稀释待测样品溶液后加入酶标板孔中，100μ 1/孔，37°C，保留l_2h，孔 中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如此重复洗涤多次；用封闭液稀释酶标苯并芘 溶液后加入孔中，100μ 1/孔，37°C，保留l_2h，孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒 尽，如此重复洗涤多次；加入底物溶液，100 μ 1/孔，避光，370C，10-15min ；加入终止液终止 反应，100 μ 1/孔；(4)检测信号的获得用酶标仪检测酶标板孔中的液体OD (optical density，光密度)值，根据OD值判 断样品中苯并芘的含量。如果样品中没有苯并芘，则反应孔中颜色最深。如果待检溶液中 抗原越多，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结 合量减少，有色产物就越多，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。根据颜色的 深浅可初步判断苯并芘含量的大小。根据苯并芘含量的标准曲线可计算出样品中苯并芘的 含量大小。所述重复洗涤的次数为三次；所述低温为4°C。以下是本发明的具体实施例1、包被液的配制1. 465g碳酸氢钠和0. 795g碳酸钠用500ml去离子水配制成溶
液，4°C保存。洗涤液的配制用8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯 化钾，0. 5ml的0. 05%吐温20，高压蒸馏水1000ml，配制成溶液，pH7. 4，4°C保存。终止液的配制用21. 7ml浓硫酸，178. 3ml高压蒸馏水配制成溶液。封闭液的配制8g氯化钠，2. 9g十二水磷酸氢二钠，0. 2g磷酸二氢钾，0. 2g氯化 钾，0. 5ml的0. 05%吐温20，高压蒸馏水1000ml，IOg牛血清白蛋白，配制成溶液，pH7. 4。底物溶液的配制用25. 7ml,0. 2mol/l的磷酸氢二钠，24. 3ml,0. lmol/1的柠檬 酸，配制0. I1^H2O2溶液，0. 的四甲基联苯胺溶液。2、抗体固定将苯并芘多克隆抗体用包被液稀释一定浓度，以每孔100 μ 1加入酶标板中，同时 设立阳性对照(正常血清稀释液)，4°C过夜保存。将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留:3min， 再倒尽。如此重复洗涤3次。每孔中添加100μ 1封闭液，37°C，保留lh。将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留 3min,再倒尽。如此重复洗涤3次。3、免疫反应用封闭液稀释适当倍数的待测样品溶液加入酶标板孔中，100 μ 1/孔，37°C，保留 l-2h, 0孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留:3min，倒尽。如此重复洗涤3次。
用封闭液稀释适当倍数的酶标抗原(酶标苯并芘)溶液加入孔中，100 μ 1/孔， 370C，保留1-ai孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽。如此重复洗涤3次。加入底物溶液，100μ 1/ 孔，避光，37°C，10-15min。加入终止液终止反应，100 μ 1/孔。4检测信号的获得用酶标仪检测酶标板孔中的液体OD值，根据OD值判断样品中苯并芘的含量。如 果样品中没有苯并芘，则反应孔中颜色最深。如果待检溶液中抗原越多，竞争性地占去了酶 标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少，有色产物就越多，这 样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。根据颜色的深浅可初步判断苯并芘含量的 大小。根据苯并芘含量的标准曲线可计算出样品中苯并芘的含量大小。酶联免疫吸附法(ELISA)是日前分析化学领域中的前沿课题，特别是在食品和饲 料中有毒有害物质的检测中占有极大的优势。它是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化 作用原理有机地结合起来的一种检测技术。本发明结合竞争酶联免疫吸附法的特点对食品 中的苯并芘含量进行检测，灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、无污染、特异性强，测 试成本低O
权利要求
1.一种食品中苯并芘含量的检测方法，其特征是，包括以下步骤(1)溶液的配制a.包被液的配制将碳酸钠、碳酸氢钠配制成PH7.0-8. 0的溶液，低温保存；b.洗涤液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾及吐温20配制成 PH7-8的溶液，低温保存；c.终止液的配制配制10-15%的浓硫酸；d.封闭液的配制将氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、吐温20及牛血 清白蛋白配制成PH7-8的溶液，低温保存；e.底物溶液的配制将磷酸氢二钠、柠檬酸、H2O2及四甲基联苯胺配制成溶液；(2)抗体固定将苯并芘多克隆抗体用包被液稀释，以每孔100 μ 1加入酶标板中，同时设立正常血清 稀释液的阳性对照，低温过夜保存；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保留3min，再倒尽，如此 重复洗涤多次；每孔中添加100μ 1封闭液，37°C，保留Ih ；将孔中液体倒尽，加入洗涤液，保 留3min，再倒尽，如此重复洗涤多次；(3)免疫反应用封闭液稀释待测样品溶液后加入酶标板孔中，ΙΟΟμΙ/孔，37°C，保留l_2h，孔中液 体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如此重复洗涤多次；用封闭液稀释酶标苯并芘溶液 后加入孔中，100μ 1/孔，37°C，保留l_2h，孔中液体倒掉，加入洗涤液，保留3min，倒尽，如 此重复洗涤多次；加入底物溶液，100μ 1/孔，避光，37°C，10-15min ；加入终止液终止反应， 100 μ 1/孑L ；(4)检测信号的获得用酶标仪检测酶标板孔中的液体OD值，根据OD值判断样品中苯并芘的含量，根据苯并 芘含量的标准曲线可计算出样品中苯并芘的含量大小。
2.按照权利要求1所述的食品中苯并芘含量的检测方法，其特征是所述重复洗涤的 次数为三次。
3.按照权利要求1所述的食品中苯并芘含量的检测方法，其特征是所述低温为4°C。
全文摘要
本发明涉及一种食品中苯并芘含量的检测方法，包括包被液、洗涤液、终止液、封闭液以及底物溶液的配制，抗体固定，免疫反应，检测信号的获得等步骤。本发明结合竞争酶联免疫吸附法的特点对食品中的苯并芘含量进行检测，灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、无污染、特异性强，测试成本低。
文档编号G01N33/543GK102087280SQ20101055942
公开日2011年6月8日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者周智慧, 王欣, 赵晓联 申请人:无锡市金坤生物工程有限公司