专利名称：一种用于鉴别诊断非典型肺炎病原体的悬浮点阵系统的制作方法
技术领域：
本发明属于医学和生物学检测领域，具体而言，本发明涉及一套包括严重急性呼吸道综合征冠状病毒(Severe acute respritory syndrome-associatedcoronavirus，简称SARS-CoV或SARS冠状病毒)在内的非典型肺炎病原体快速检测荧光微球，可以用于检测和/或鉴别诊断发烧人群、非典型肺炎疑似病例以及非典型肺炎临床诊断病例的病原体，包括非严重急性呼吸道综合征冠状病毒感染的排查、严重急性呼吸道综合征冠状病毒感染的确诊以及急性呼吸道病原体合并感染的诊断。本发明还涉及该鉴别诊断系统的制作、测定和计算机软件分析处理系统。
背景技术：
严重急性呼吸道综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，简称SARS(萨斯)，即非典型肺炎)是一种新型冠状病毒所致的急性呼吸系统传染病，其发病机制尚未明确，病情进展迅速，具有较高的死亡率，已成为世界范围内对人类健康的一种威胁。目前在SARS疾病控制方面，主要是要控制该病的传播和治疗患者。早期隔离、早期治疗可以减少疾病的传播并降低病死率，因此准确的诊断和正确的治疗是关键；特别是在诊断方面，缺少针对SARS冠状病毒以及其它急性呼吸道感染的常见病原体检测方法。目前已有的针对SARS冠状病毒的检测方法主要有酶联免疫反应方法(ELISA)和基因诊断方法。ELISA方法是通过检测病人血清中的特异抗体含量来判断该病人是否受到SARS病毒感染。众所周知，血清中出现免疫球蛋白G(IgG)的时间约在感染后10天以上，免疫球蛋白M(IgM)也在感染后约一周才可能出现，因此，ELISA方法不能在感染早期作为有效的SARS病毒感染的检测方法；而且ELISA方法的敏感度和特异性均不够理想。目前已有的基因诊断方法大多采用单纯液相反应体系(如实时荧光PCR(聚合酶链反应))或单纯固相反应体系(如基因芯片)，均存在灵敏度不够高、检测样本所需量较大等缺点。本发明鉴别诊断系统采用特异性寡核苷酸探针偶联的荧光微球，杂交反应在固-液相之间进行，不但克服了已有基因诊断方法的上述缺点，而且利用荧光微球具有高载量和高通量的特点，可以在检测SARS病原体的同时，检测其它若干种严重急性呼吸道感染病原体，以便在发烧早期进行非SARS冠状病毒感染患者的排查、SARS冠状病毒感染的确诊以及急性呼吸道病原体合并感染的诊断，从而可以减少交叉感染以及制订适宜的治疗方案。
发明目的因此，本发明的目的是提供一套用于非典型肺炎病原体特异性检测荧光微球对发烧患者、非典型肺炎疑似病例和临床诊断病例进行病原体检测的试剂及其分析处理系统。

发明内容
本发明的上述目的是通过下列技术方案实施的一种用于检测人类常见急性呼吸道感染病原微生物的非典型肺炎病原体悬浮点阵鉴别诊断系统，其特征在于它由质量控制样品、生物素标记的特异性核酸扩增引物、非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联的荧光微球和辅助试剂组成的检测试剂盒及其计算机分析处理系统。
本发明鉴别诊断系统的制作方法包括阳性和阴性质控品的制备、生物素标记的特异性核酸扩增引物的制备、非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联荧光微球的制备及辅助试剂的配制；以及线性判别函数公式的建立、分析方程的编制和数据库的建立。
本发明鉴别诊断系统可以诊断和/或鉴别诊断的非典型肺炎病原体包括属于正粘液病毒属的5种甲流感病毒(包括H1N2、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1共5种亚型)、2种乙流感病毒(包括乙型流感病毒、乙流感病毒2两种亚型)；属于副粘液病毒属的腺病毒、肠道病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、2种呼吸道合胞体病毒(A型和B型)、人偏肺病毒(HMPV)和SARS冠状病毒；以及其它病原体有肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌，共18种。
本发明鉴别诊断系统中的阳性质控品的制备是通过人工合成具有以下特点的SARS冠状病毒和其它病原体检测靶位点，并在片段5’端加上了核糖核酸(RNA)合成酶T7，在3’端加SP6。合成这些基因片段的目的是用来做为体外转录的模板合成RNA，以此当作阳性质控品来检验整个检测体系的敏感性和特异性。这些构建的基因片段与从野生型的病原体基因组中扩增出的靶片段完全相同，因此可能会因为实验室内部污染而导致假阳性的发生。为了防止由于污染造成的假阳性，构建时在SARS模板与微球杂交的位置加入了一段20个碱基的“突变”片段，它与野生型的相应片段的CG含量和长度都相等。得到的这个突变型模板与野生型基因片段的大小、扩增引物等特征都相同，唯一不同的就是片段中间的检测探针杂交序列，这个序列不会与不同颜色的野生型微球杂交，所以不会因此而造成假阳性。
(一)、下面以合成突变型的SARS1靶序列为例，说明阳性质控品的设计方法A、流程见附图1B、野生型和“突变型”SARS1靶序列的区别a)野生型SARS1靶序列设计如下序列中划曲线的是聚合酶链反应(PCR)引物、划实线的是与微球颗粒上的检测杂交探针互补的寡苷核酸。
ttcgtgcgtggattggctttgatg agagatgctgtgggtactaacctacc b)“突变型”SARS1靶序列设计如下。它与野生型靶序列的唯一差别就是中间的二十个碱基与检测探针杂交的序列不同gaagctattcgtcacgttcgtgcgtggattggctttgatgTGCATGGTGCAACAATCGTGagagatgctgtgggtactaacctacctctccagctaggattttctacagC、“突变型”靶序列(即阳性质控品)的制备a)首先合成“野生型”靶序列；b)把合成好的“野生型”靶序列从凝胶中回收出来单独扩增形成野生型的阳性质控品基因片段；c)以构建好的“野生型”阳性质控品基因片段为模板，用特别设计的PCR引物(SARSm-1和SARS1-5)来合成“突变型”阳性质控品的3’末端；用特别设计的PCR引物(SARSm-2和SARS1-1)来合成“突变型”阳性质控品的5’末端。“突变型”阳性质控品的结构见附图2。
D、PCR扩增a)经过电泳并凝胶回收纯化后再把SARSm-1，SARS1-5的产物和SARSm-2，SARS1-1的产物放到一起相互延伸，并加SARS1-1和SARS1-5为PCR引物来合成最终的特殊基因片段，即脱氧核糖核酸(DNA)片断。利用该“特殊基因片断”作为体外转录的模板，分别用T7和SP6 RNA合成酶试剂盒(Ambion，USA)合成RNA模板；b)将这些体外转录出来的RNA模板经DNA酶(DNAse)作用去除模板DNA后稀释1000倍分装；冰冻保存，即为阳性质控品。使用时不与病人标本混合而独立在另一个试管里进行RNA提取和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，或仅做RT-PCR的模板。
(二)、以SARS冠状病毒为例，18种非典型肺炎病原体诊断和/或鉴别诊断阳性和阴性质控品的具体制备方法操作步骤如下A)、阳性质控品的制备(1)野生型模板的制备a)将(一)、C、c)所述PCR引物SARS1-5按顺序编号为引物1、2、3、4、5，在扩增仪上进行第一次引物延伸反应，引物为1、2和3、4，延伸反应的程序为94℃1分钟，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30个循环，然后在72℃ 3分钟进行最后的延伸反应；通过电泳凝胶纯化第一次引物延伸的反应产物；b)在扩增仪上进行第二次引物延伸反应，引物为1和5，以及引物1、2和引物产物3、4，延伸反应的程序为94℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30个循环；然后在72℃ 3分钟进行最后的延伸反应，通过电泳凝胶纯化第二次引物延伸的反应产物；c)将纯化好的产物用纯水进行1∶1000倍稀释，用于扩增野生型模板反应的模板，具体步骤包括在扩增仪上再次进行引物延伸反应，延伸反应的程序为95℃ 15分钟；94℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30个循环；然后在72℃ 3分钟进行最后的延伸反应，最后进行野生型模板扩增产物的纯化；d)扩增产物的纯化上述所有扩增产物的纯化试剂可选用不同厂家的纯化试剂盒。本发明中选用的扩增产物纯化试剂盒为Qiagen公司的Qiaex II Agarose GelExtraction kit(Cat#20021)。
(2)突变型模板的制备步骤同(1)。
B)、阴性质控品的制备(1)制备本发明鉴别诊断系统中的SARS阴性对照样品采用构建阳性质控品类似的方法，带有20个突变碱基的阴性质控品靶序列如下gaacaacagactactagagattaccaggCGTTGTAAGGTTAGTATAGAcgtaactacacctgtaagtacttatatgttaactaatagtgaattattatcattaatcaatgatatgcctataaca(2)使用把用SP6 RNA合成酶体外转录合成了的这段无关RNA模板放在核酸提取液的RNA-sol里(含苯酚和抑制RNAse的盐)做为阴性质控品。这样在从病人标本(标本来源包括血、尿、鼻咽拭子、粪便等)里提取RNA时，每个病人标本里都含有大约500-1000个拷贝的阴性对照模板RNA。阴性对照模板在RNA-Solv里面很稳定。
(三)特异性扩增引物的制备本发明鉴别诊断系统中的生物素标记的特异性扩增引物是以寡核苷酸为原料，通过核酸合成仪制备的，核酸合成仪可选用不同厂家、不同型号的产品，寡核苷酸的购买及核酸片段的合成也可以委托相关的基因公司来完成。本发明中的特异性扩增引物是委托MWG公司(美国)用DNA合成仪合成的。SARS-Cov和其余若干种急性呼吸道感染病原体的核酸特异性扩增引物的序列及其基本特性如下，本发明为SARS冠状病毒设计了三对引物，其余病毒各设计了一对引物。

注F、R分别表示一对引物中的5’末端引物和3’末端引物；A、C、G、T分别表示一种寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脱氧鸟苷，T表示脱氧胸苷。
(四)特异性探针偶联的荧光微球
本发明鉴别诊断系统中的非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联的荧光微球的制作材料可选用不同的高分子材料(如聚苯乙烯，聚氯乙烯，壳聚糖等)，本发明采用荧光素载量不同的聚苯乙烯微球作为探针载体，通过与18种非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针进行化学偶联而制作，其中与聚苯乙烯荧光微球进行共价偶联的寡核苷酸探针在合成过程中需要在5′端进行氨基化修饰。本发明鉴别诊断系统中所采用的聚苯乙烯荧光微球可选用国内外不同公司的产品，本发明中选用Luminex公司产品。一套非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联的荧光检测特异性寡核苷酸探针序列及其制作步骤如下A)非典型肺炎病原体特异性5’末端氨基化寡核苷酸探针序列如下

注“D”表示检测探针；Amine表示氨基；A、C、G、T分别表示一种寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脱氧鸟苷，T表示脱氧胸苷。
B)寡核苷酸探针与聚苯乙烯荧光微球的偶联
进行偶联的微球的浓度可以自由选择。本发明中经比较在三种不同条件下(2500beads/反应；5000beads/反应；10000beads/反应)对检测非典型肺炎病原体灵敏度影响的实验数据表明反应体系中偶联微球浓度在2500-5000/50μl时，荧光读数与偶联微球浓度呈线性相关；当反应体系中偶联微球浓度在5000-10000/50μl时，荧光读数与偶联微球浓度无关。因此选择探针杂交检测体系偶联微球浓度为5000beads/50μl；确定每交联1×106个乳胶颗粒所使用的交联探针量为0.75nmol(交联反应体积为50ul)。
C)以SARS冠状病毒病原体为例说明荧光检测微球制作工艺流程(1)用超声波仪打散聚苯乙烯荧光微球，并将容器震荡20秒，(2)从贮存管中将1×107荧光微球分到1.5毫升的微量离心管中；用10,000×g离心1分钟，去上清，注意不要触动沉淀；(3)加入1.5M 2-(N-吗啡基)乙磺酸(pH4.5)，震荡并用超声波分散，加入0.75nmol的氨基化的寡核苷酸(即0.75μl的1mM溶液)，瞬时震荡；(4)仅在使用前，加1.0毫升的无菌水到10mg的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氢氯化二酰亚胺中，加2.5ml的新鲜1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氢氯化二酰亚胺溶液到微球中，瞬时震荡。避光室温孵育30分钟；(5)用新鲜的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氢氯化二酰亚胺重复步骤上述步骤；(6)加1.0毫升的吐温-20(0.02％w/v)，震荡，用10,000×g离心微球1分钟，去上清，注意不要触动沉淀；(7)加1.0毫升的十二烷基硫酸钠(0.1％w/v)。震荡，用10,000×g离心微球1分钟，去上清，注意不要触动沉淀；(8)用100毫升的0.1M 2-(N-吗啡基)乙磺酸(pH4.5)悬浮微球，将制备的微球计数，在2-8℃避光保存备用。
(五)本发明鉴别诊断系统中的辅助试剂包括(1)荧光素标记的链霉亲和素；荧光素可选用各种不同种类的荧光素，如异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)、若丹明、藻红蛋白等，可从有关公司购买。本发明中使用的藻红蛋白标记的链霉亲和素购自Sigma公司。
(2)核酸提取试剂，可从相关公司购买，本发明中采用的核酸提取试剂为OmegaBiotek公司产品(3)一步法逆转录核酸扩增试剂、PCR产物纯化试剂和悬浮点阵杂交检测试剂，均可从相关公司购买。本发明中采用的一步法逆转录核酸扩增试剂、PCR产物纯化试剂和悬浮点阵杂交检测试剂均为Qiagen公司产品。
(六)本发明鉴别诊断系统中的计算机分析处理系统是根据悬浮点降检测病原体获得的数据，并将一定数量的三类临床病例(即发烧患者、非典型肺炎疑似病例以及临床诊断病例)进行分组，经过多元逐步回归进行逐步判别的方法建立的三个线性判别函数方程构建的1、在显著差异为0.05水平下的判别(1)分组类别 例数％ 概率确诊 29 0.1746990.333333疑似 96 0.5783130.333333发烧 41 0.2469880.333333(2)由此建立的三个线性函数方程的系数表如下确诊 疑似 发烧常数项CONSTANT -37.40594 -37.73991-42.94648病毒名称肺炎衣原体(CPN) 0.88590-0.24935 -0.52834肠道病毒(ENTV) 2.24790-0.12706 -0.71957甲流感病毒(H5N1) 8.460585.98128 -0.34751甲流感病毒(INFA) 2.293884.02736 12.05741乙流感病毒2型(INFB2) 3.618243.15499 17.76646副流感病毒1型(PIV1) 14.37190 17.06734 15.25512副流感病毒3型(PIV3) 18.09694 19.93511 12.47616呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 5.340516.91617 -1.70636冠状病毒(SARS1) -1.31425 -0.60170 -2.15653冠状病毒(SARS3) 8.782129.78919 16.22203(3)临床诊断分类与判别函数分类的比较判别函数分类临床诊断分类确诊 疑似 发烧 合计确诊22 7 0 29
％ 75.8624.140.00100.00疑似982 5 96％ 9.38 85.425.21100.00发烧0140 41％ 0.00 2.44 97.56 100.00合计31 90 45 166％ 18.6754.2227.11 100.00从上表可以看出确诊的正确判别率为75.86％，疑似的正确判别率为85.42％，发烧的正确率判别为97.56％。总的判断正确率为86.75％(错判率为13.25％)。
(4)三个线性函数方程式如下Y诊断＝-37.40594+0.88590cpn+2.2490entv+8.46058h5n1+2.29388infa+3.61824infb2+14.3719piv1+18.09694piv3+5.34051rsvb-1.31425sars1+8.78212sars3Y疑似＝-37.73991-0.88590cpn-0.12706entv+5.98128h5n1+4.02736infa+3.15499infb2+17.06734piv1+19.93511piv3+6.91617rsvb-0.60170sars1+9.78919sars3Y发烧＝-42.94648-0.52834cpn-0.71957entv-0.34751h5n1+12.05741infa+17.76646infb2+15.25512piv1+12.47646piv3-1.706361rsvb-2.15653sars1+16.22203sars3注cpn，肺炎衣原体；entv，肠道病毒；h5n1，甲流感病毒；infa，甲流感病毒；infb2，乙流感病毒2型；piv1，副流感病毒1型；piv3，副流感病毒3型；rsvb，呼吸道合胞病毒；sars1，冠状病毒；sars3，冠状病毒2、在显著性差异为0.01水平下的判别(1)分组与步骤1、(1)相同。
(2)建立的三个线性函数方程的系数表如下确诊 疑似 发烧常数项 CONSTANT -29.84871-27.95731-33.41170乙流感病毒2型(INFB2) 6.27513 6.05405 20.72240肺炎衣原体(CPN) 1.48372 0.37915 0.48398甲流感病毒(H5N1) 11.18852 8.75797 3.16586副流感病毒3型(PIV3) 19.62581 21.76331 15.29176呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 6.74481 8.94035 1.63531冠状病毒(SRS3) 6.85826 7.55123 14.09893
(3)临床诊断分类与判别函数分类的比较判别函数分类临床诊断分类 确诊 疑似 发烧合计确诊 20 8 1 29％ 68.97 27.59 3.45100.00疑似 10 815 96％ 10.42 84.38 5.21100.00发烧 0 4 37 41％ 0.00 9.76 90.24 100.00合计 30 9343 166％ 18.07 56.02 25.90 100.00从上表可以看出确诊的正确率为68.97％，疑似的正确率为84.38％，发烧的正确率为90.24％。总的判断正确率为83.13％(错判率为16.87％)。
(4)三个线性函数方程如下Y诊断＝-29.84871+1.48372cpn+11.18852h5n1+6.27513infb2+19.62581piv3+6.74481rsvb+6.85826sars3Y疑似＝-27.95731+0.37915cpn+8.75797h5n1+6.05405infb2+21.76331piv3+8.94035rsvb+7.55123sars3Y发烧＝-33.41170+0.48398cpn+3.16586h5n1+20.72240infb2+15.29176piv3+1.63531rsvb+14.09893sars3注所有英文缩写名词的含义同(六)、1、(4)的注解。
3、对计算机分析处理系统的评价本发明鉴定诊断系统的分析处理系统的建立采用多因素逐步回归方法。统计学上一般认为多因素分析的总判断正确率达到80％时，即认为判别效率良好。本发明建立的分析判断模型在显著性差异为0.05和0.01水平时，总判断正确率分别达到86.75％和83.13％，说明使用该分析方法进行检测数据分析的统计效果良好。
(七)本发明鉴别诊断系统的检测方法，其特征在于它依次按下述步骤进行1、一步法逆转录核酸扩增a)按照下表准备PCR反应体系

注5×，代表五倍浓缩液；1×，代表工作液；RNase-free，代表不含RNA酶。
b)按如下步骤编程进行PCR循环i. 反转录50℃ 30分钟ii. 起始PCR 95℃ 15分钟iii. 三步循环 94℃ 30秒i.55℃ 15秒ii. 72℃ 15秒iii. 共进行30个循环(据具体情况可提高到40个循环)iv. 终延伸72℃ 3分钟2、以SARS病原体为例说明非典型肺炎病原体的悬浮点阵系统检测操作步骤a)按照下表准备反应体系10.5ul 1×TE，PH8.05.0ul 纯化的RT-PCR样品1.5ul SARS系列偶联微球33.0ul 1.5×TAMC50ul总体积注TE，Tris-EDTA缓冲液；TAMC，四甲基氯化铵缓冲液。
b)操作步骤将样品放置98℃中5分钟变性，然后立即将变性的样品置于52℃中杂交15分钟；在样品孵育过程中，按1∶250稀释配制新鲜的链霉抗生物素-R-藻红素(SA-PE)，即加3ul SA-PE储存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC；孵育完成后，以最大转速离心2分钟沉淀荧光检测微球，去除上清夜，保存沉淀的微球；每管加入75μl 1∶250的SA-PE液体，旋涡震荡使微珠重新悬浮，52℃孵育5分钟；最后在检测仪上对荧光标记微球进行计数。
3、荧光标记微球计数荧光标记微球的计数由检测仪完成，检测仪可以采用不同厂家生产的各种荧光微球计数仪或流式细胞计数仪。本发明中采用的荧光微球计数仪是型号为Luminex100的悬浮点阵分析计数仪(Luminex公司产品)。
4、结果计算a)根据已经建立的三个线性判别函数方程编制计算机分析处理系统；b)每个个体进行判别时，把检测的各变量值代入判别函数，得出判别分数；c)从哪一个线性函数方程得出的判别分数高，即可以判定该个体属于哪一类临床分组。
与其它SARS冠状病毒检测指标和技术相比较，本发明鉴别诊断系统具有以下优点a)与已有的SARS冠状病毒检测指标相比较，本发明鉴别诊断系统的检测指标是SARS病毒特异性基因片断，克服了SARS病毒特异性抗体在感染后7-10天才可能从血液中检出、不适宜作为早期检测SARS病毒感染指标的缺点。SARS病毒特异性抗体(IgM或IgG)的已有检测方法为酶联免疫反应方法(ElISA)，本发明所采用的病毒基因悬浮点阵荧光微球方法克服了ElISA方法所具有的敏感度不够高、特异性不够强的缺点。
b)与已有的SARS病毒基因检测方法相比较，本发明鉴别诊断系统采用了3个SARS冠状病毒基因探针同时检测的设计，克服了已有的SARS病毒基因诊断方法一般只有一个基因探针的缺点，提高了检测的特异性，降低了假阴性。
c)本发明鉴别诊断系统的基因杂交反应是在固-液相之间进行的，由于聚苯乙烯微球表面的羧基基团十分丰富(球面效应)，使得其结合的检测探针十分充足，因此杂交所需时间短暂、快速。与已有的的基因检测方法(如基因芯片技术是单纯的固相反应，实时荧光PCR技术是单纯的液相反应)相比较，本发明鉴别诊断系统具有更高的敏感度和检测效率。
d)本发明鉴别诊断系统采用了荧光载量不同的聚苯乙烯微球，利用微球表面丰富的羧基团与18种病原体特异的氨基化寡核苷酸探针进行共价偶联，从而实现了包括SARS病毒在内的18种急性呼吸道感染病原体的基因检测可在同一试管中同时检测的目的，与已有的SARS病毒基因检测方法相比，具有非常明显的操作简便、快速有效、高通量的优点，克服了已有的SARS病毒基因检测方法只针对SARS一种病毒进行诊断、不能对其它若干种急性呼吸道病原体合并感染进行同时检测的缺点，本发明鉴别诊断的检测结果更有利于临床上尽早采取有效、合理的治疗方案，提高治愈率，降低病死率。
本发明还包括将鉴别诊断系统用于鉴别或者诊断严重急性呼吸道综合征的方法，包括如下步骤a.非典型肺炎病原体样本的核酸提取；b.一步法反转录核酸扩增；c.聚合酶链反应产物的纯化；d.荧光微球的检测；e.计算机分析处理系统判定检测结果。


附图1制备阳性质控品的流程图附图2“突变型”阳性质控品的结构下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。
实施例一非典型肺炎病原体鉴别诊断系统制作方法的应用实例一、非典型肺炎病原体鉴别诊断系统(50人份)，其组成包括


DEPC，焦碳酸二乙酯；HiBind，代表高键合；TE，Tris-EDTA缓冲液；TAMC，四甲基氯化铵缓冲液。
二、具体制作方法如下1、寡核苷酸引物合成1)制备采用HPLC纯化的人工合成的特异性正向与反向寡核苷酸引物，其中反向引物5’末端进行生物素化修饰，共包括14对引物，可特异扩增新型冠状病毒(SARS-Cov，RNA病毒)、肠道病毒(Enterovirus，RNA病毒)、5种甲流感病毒(INF A，RNA病毒)、2种乙流感病毒(INF B，RNA病毒)、副流感病毒1型(PIV-1，RNA病毒)、副流感病毒3型(PIV-3，RNA病毒)、2种呼吸道合胞病毒(RSV，RNA病毒)、腺病毒(Adenobirus，DNA病毒)、肺炎支原体(M.Pneumoniae)、肺炎衣原体(C.Pneumoniae)、人偏肺病毒(HMPV)和嗜肺军团杆菌(Legi)的相关区域。寡核苷酸引物是用DNA合成仪人工合成以及生物素修饰的，所有引物在合成后经HPLC纯化，冻干，-20℃保存。
2)质量检定标准纯度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，用每对引物分别反转录扩增相应病毒核酸，将扩增产物与和微球偶联的对应检测探针进行杂交，悬浮点阵检测结果为阳性；与其它探针偶联微球杂交结果为阴性。
2、5’末端氨基化寡核苷酸探针制备1)制备采用HPLC纯化的特异性人工合成的寡核苷酸探针，5’末端氨基修饰，18种探针分别特异性结合如前所述18种引物相对应的病毒核酸区域。所有探针在合成后经HPLC纯化，冻干，-20℃保存。
2)质量检定标准纯度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，将氨基化的检测探针与微球进行偶联，然后用与被检测探针互补的5’端生物素化修饰的反义探针进行杂交，悬浮点阵检测结果为阳性；与其它反义探针杂交结果为阴性。
3、荧光检测微球的制备本发明鉴别诊断系统中使用的荧光检测微球是由Luminex公司提供的。
1)制备一种具有高度的物理学和热力学稳定性的表面羧基化的聚苯乙烯微球颗粒被采用。上百种不同颜色的荧光标记染料分别为每一个微球标记上不同的荧光颜色，这些不同的荧光颜色作为微球的特定编码，为微球在Luminex100TM系统中设定了特定的光谱地址，可被LUMINEX 100TM系统检测到。
将5’末端氨基化修饰的寡核苷酸探针用无菌纯水稀释至DNA浓度为1nmol/μl。通过共价偶联的方式分别包被于相应荧光编码的表面羧基化微球，2-8℃避光保存。
2)质量检定标准每种微球分群的差错率应＜0.5％，每种微球分群的准确率应＞98％，每种空白微球1000个的荧光强度应＜104、阳性质控品的制备1)制备以SARS1为例1000-2000个拷贝SARS1 MT模板扩增纯化产物。
2)质量检定标准扩增阳性质控品，扩增产物与所有探针偶联微球杂交，悬浮点阵检测，对应探针检测结果为阳性，其它探针检测结果为阴性。
5、阴性质控品的制备1)制备1000-2000个拷贝RSVm模板扩增纯化产物。
2)质量检定标准扩增阴性质控品，扩增产物与所有探针偶联微球杂交，悬浮点阵检测，对应探针检测结果为阳性，其它探针检测结果为阴性。
6、核酸提取试剂的制备1)制备由Omega Biotek公司提供，包括RNA Solv、RNA洗液I、RNA洗液II(5×)、水(经DEPC处理)、HiBind RNA玻璃纤维离心柱和收集管、2ml收集管等组份。可以同时提取DNA病毒和RNA病毒的核酸。
2)质量检定标准用该试剂提取纯化250μl SRAS病毒培养上清的病毒核酸，A260nm＞0.02，A260nm/A280nm＞1.8。
7、一步法递转录核酸扩增(RT-PCR)试剂的制备1)制备由Qiagen公司提供，包括一步法RT-PCR酶混合液、5×RT-PCR缓冲液、dNTP、水(RNase free)等组份。用于病毒核酸的体外反转录与PCR扩增。
2)质量检定标准用5μl浓度为1ng/μl的SARS病毒核酸反转录扩增，取经过PCR产物纯化的5μl扩增产物与所有探针偶联微球混合物杂交，悬浮点阵检测结果相应探针为阳性，除RSVm外其它探针为阴性。
8、PCR产物纯化试剂的制备1)制备由Qiagen公司提供，包括HiBind DNA玻璃纤维离心柱和收集管等组份。
用于一步法RT-PCR反应后的产物纯化。
2)质量检定标准用5μl浓度为1ng/μl的SARS病毒核酸反转录扩增，扩增产物经过PCR产物纯化后核酸纯度A260/A280＞1.6。
9、悬浮点阵杂交检测试剂的制备由Qiagen公司提供，包括1.5×TMAC，1×TE，SA-PE等组分。用于纯化后的一步法RT-PCR产物的悬浮点阵检测。
三、本发明技术制备的非典型肺炎病原体鉴别诊断系统的质量检测1)检测极限以SARS1为例，将SARS1阳性质控品连续10-1梯度稀释3次，分别经核酸提取、反转录扩增、扩增产物纯化、杂交、悬浮点阵检测，检测结果为阳性的最低浓度不高于100拷贝。以SARS1模板DNA进行过柱纯化后，以UV分光光度计进行DNA含量的测定，同时以琼脂糖电泳检查对比浓度。得到约2ng/ul的模板浓度，然后以此模板浓度进行10倍梯度稀释，以此稀释产物1μl为模板，进行PCR扩增反应、PCR产物纯化、核酸杂交，用Luminex100TM悬浮点阵检测，结果见下表。PCR反应结束后，琼脂糖电泳检查反应结果。用1D图象分析软件进行紫外分析并照相，扩增产物灰度扫描得A值，SARS1扩增片段的A值与DNA MARKER相比较得出扩增片段的浓度为2ng/μl，，扩增片段长度为109bp，得到每μl的分子数(即为拷贝数)为1.9×108，则起始模板的检测极限浓度为1.9×108×2。
编号 模板量SARS1杂交结果1 1.9×108×2 1172 1.9×1081603 1.9×107338.54 1.9×106368.55 1.9×1054996 1.9×1044397 1.9×1033548 1.9×10286
9 1.9×1019110 background 482)准确性包括阳性质控品符合率，即以10份阳性质控品检测结果不得出现假阴性；阴性质控品符合率，即以10份正常人全血检测结果不得出现假阳性。在上述条件下用SARS1探针重复检测同一种阳性质控品、正常人全血标本各10次。结果如下

3)精密度将含102个SARS病毒拷贝参考品作为精密性参考品，连续十次分别经核酸提取、反转录扩增、扩增产物纯化、杂交、悬浮点阵检测本系统精密性。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV≤20％4)灵敏度和特异性通过检测临床确诊的SARS冠状病毒感染样本20份以及正常样本80份验证试剂盒的检测域值、灵敏度及特异性。按非典型肺炎病原体悬浮点阵鉴别诊断系统使用说明书操作。测试临床样本的结果经统计学分析结果表明灵敏度(真阳性率)＝100％特异性(真阴性率)＝96％假阳性率＝0假阴性率＝4％实施例二非典型肺炎病原体鉴别诊断系统检测方法的使用实例(一)非典型肺炎病原体样本核酸提取标准操作规程具体操作步骤如下1、取250μl的病人标本与1ml RNA-Solv(绿颜色液体)在2ml离心管中混合，如果标本少于250μl，相应减少RNA-Solv的用量即可，样本体积不应超过工作终体积的20％。以下是几种不同来源的标本的采集处理方法1)拭子拭子浸入1ml的RNA-Solv中3分钟，取出并弃掉拭子，接步骤3。
2)全血/血浆将250μl病人的全血/血浆与1ml RNA-Solv充分混合，接步骤3。
3)粪便在2ml离心管(RNase free)中用生理盐水(经DEPC处理)稀释标本，制成10％(wt/wt)悬液；4℃，3200×g离心15分钟，将上清转移，16000×g，4℃离心15分钟去除剩余残渣。取250μl上清，与1ml RNA-Solv(绿颜色液体)在2ml离心管中混合，接步骤3。
4)尿将20-30ml尿，离心，收集沉淀物置于2ml螺口离心管中，加入1ml RNA-Solv(绿颜色液体)充分混合，接步骤3。
2、往步骤1的离心管中加入250μl氯仿，充分漩涡混合至少30秒。
3、设立空白对照以去离子水作为空白同时进行核酸提取操作。
4、12,000×g离心10分钟，使水相与有机相充分分层。
5、小心的将450μl上层水相移入一个新的1.5ml离心管(RNase free)中，并保持剩余水相与有机相的分层。
6、向步骤4的离心管中加入等体积的70％的乙醇，使用漩涡混合器将其充分混匀。
7、取700μl步骤5的样品加入到HiBind RNA玻璃纤维离心柱的上部。10,000×g，离心15秒钟，丢弃收集液，保留收集管并重新组装。
8、如果步骤5的样品还有剩余，将剩余样品加到重新组装的HiBind RNA离心柱上部。10,000×g，离心15秒钟。
9、丢弃收集液和收集管。
10、将HiBind RNA离心柱与一个新的2ml收集管(试剂盒中已提供)组装，并在HiBind RNA离心柱的上部加入500μl的RNA洗液I。
11、10,000×g离心15秒钟，丢弃收集液，保留收集管并重新组装。
12、在HiBind RNA离心柱的上部加入500μl的RNA洗液II(1X)(注意RNA WashBuffer I在使用前需加入100％的乙醇)。。
13、10,000×g离心15秒钟，丢弃收集液，保留收集管并重新组装。
14、在HiBind RNA离心柱中加入500μl的RNA洗液II15、10,000×g离心15秒钟，丢弃收集液，保留收集管并重新组装。
16、使用离心机的最高转数离心1分钟，将HiBind RNA离心柱残液完全甩干。
17、将HiBind RNA玻璃纤维离心柱与一个新的1.5ml离心管(RNase free，试剂盒中未提供)组装。
18、RNA/DNA洗脱。将50μl经DEPC处理水(试剂盒中已提供)直接加到玻璃纤维离心柱基质上，并且不要碰到离心柱，使用离心机的最高转数离心1分钟。
19、纯化的RNA/DNA需立即用于RT-PCR，或者5μl/份分装于Rnase free的螺口离心管中，冻存于-80℃直到用于RT-PCR。
(二)一步法反转录核酸扩增RT-PCR标准操作规程具体操作步骤如下1、将RNA模板溶解，并将其与引物、dNTP、一步法PCR缓冲液(5×)、一步法RT-PCR混合酶、水(RNase-free)放置于冰上。
2、按照下表准备RT-PCR反应体系。以7人份为例，应至少配制10人份反应混合液(含1个阳性质控品和1个空白样品)。

3、用移液器轻轻的上、下抽吸RT-PCR反应混合液几次，使其充分混匀，按45μl/反应管分装，置于冰盘上。
4、在RT-PCR反应管上标记病人编号，每管中加入5μl RNA模板。
5、设立阳性质控样品和空白质控样品(1)用由核酸提取操作中以去离子水代替样本所得到的提取物为模板作为空白对照样本。
(2)将阳性质控品取出，室温溶解混匀，离心数秒，向含45μlRT-PCR反应试剂的PCR反应管中分别加入5ul阳性质控品作为阳性对照样本。
6、按如下步骤编程PCR循环A.反转录50℃ 30分钟B.终止反转录95℃ 15分钟C.三步循环94℃ 30秒55℃ 15秒72℃ 15秒共进行40个循环D.终延伸72℃ 3分钟
7、先将加好试剂的PCR管放置冰上，待RT-PCR启动并升温至50℃后再放入PCR仪进行扩增循环。
(三)PCR产物纯化标准操作规程具体操作步骤如下1、将HiBind DNA玻璃纤维离心柱(蓝色向上)插入收集管中，适当标记每个管；2、将PCR产物转移到组装好的HiBind DNA玻璃纤维离心柱和收集管中；3、加400ul的pH8.01×TE于含有PCR产物的已经组装好的HiBind DNA玻璃纤维离心柱和收集管中；4、10,000×g离心5分钟，弃去收集液；5、装回离心柱；6、用400ul的pH8.01×TE冲洗；7、10,000×g离心5分钟，离心后在收集管中剩有小体积(大约5ul)的收集液是合适的；8、将HiBind DNA玻璃纤维离心柱与新的收集管组装；9、检查样品体积，在收集管中剩余的样品体积不超过5ul；10、将45ul pH8.01×TE直接加到HiBind DNA玻璃纤维离心柱的表层，轻轻摇动30秒；11、将HiBind DNA玻璃纤维离心柱颠倒并插入到收集管中(白边向上)；12、10,000×g离心3分钟，在收集管中大约45-50ul的液体既是RT-PCR纯化产物。
(四)荧光微球测定标准操作规程具体操作步骤如下1.将所有试剂恢复至室温并震荡混匀；将微球混合物充分涡旋振荡至少15秒，并注意避光。(可置于黑暗处或用铝箔包裹覆盖)然后按如下说明配制好1×TE，1.5×TMAC和微球混合液加入至干净的离心管中，并旋涡震荡混匀，按45ul/test分装至小管中。反应体系如下10ul/test 1×TE，PH8.02ul/test SARS系列偶联微球33.0ul/test 1.5×TAMC5.0μl/test纯化的RT-PCR样品(在步骤2中加入)50ul 总体积
2.在上述含核酸杂交试剂的小管中加入5.0ul纯化的RT-PCR样品；微球背景空白用0.5ul 1×TE代替纯化的RT-PCR样品加入含核酸杂交试剂的小管；3.将样品放置98℃中变性5分钟，然后立即将变性的样品置于52℃中杂交15分钟。可在PCR仪中进行。请保持样品闭光，可加入油覆盖样品以避光；4.在杂交反应进行过程中，按1∶250稀释配制新鲜的藻红蛋白标记的链霉生物素，即加3ul SA-PE储存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC(预先用250ul去离子水稀释500ul 1.5×TMAC)；5.杂交完毕后，以最大转速离心2分钟沉淀微球，去除上清液，保存沉淀的微球。去除上清液时应留下一些液体，以免将微球吸出；6.每管加入75ul 1∶250的SA-PE液体，旋涡震荡使微球重新悬浮，52℃闭光保温5分钟(可在PCR仪中进行)。
(五)结果判定标准1、数据有效性分析(1)微球背景空白荧光强度不高于100；(2)空白样本中内源性阴性对照与其它寡核苷酸探针杂交荧光强度不高于200；与自身对应寡核苷酸探针特异性杂交荧光强度高于空白对照两倍以上；(3)阳性对照与自身对应寡核苷酸探针特异性杂交荧光强度高于空白对照五倍以上。
当实验数据同时满足上述3个条件，本次实验判为有效实验。
2、待测样本分析通过三个线性函数方程分析待测样本、对于每个个体进行判别时，把测试的各变量值代入判别函数，得出判别分数。从哪一个线性函数方程得出的判别分数高，就可以判定该个体属于哪一类临床分组，包括发烧、非典型肺炎疑似病例和非典型肺炎临床确诊病例。以上分析均使用专用计算机分析处理系统进行。
权利要求
1.一种用于检测人类急性呼吸道感染病原体的非典型肺炎病原体悬浮点阵鉴别诊断系统，该系统由检测试剂盒和计算机分析处理系统组成，其中检测试剂盒由质量控制样品、生物素标记的特异性核酸扩增引物、非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联的荧光微球和辅助试剂组成，计算机分析处理系统是带有建立在多元逐步回归基础上的线性判别函数方程软件的计算机处理系统。
2.根据权利要求1的鉴别诊断系统，其中所述质量控制样品包括呼吸道感染病原体阳性质控品和阴性质控品。
3.根据权利要求2的鉴别诊断系统，其中所述呼吸道感染病原体阳性质控品，是将寡核苷酸用核酸合成仪进行合成后、获得检测非典型肺炎病原体的靶序列、用基因工程重组的方法构建的“基因片断”。
4.根据权利要求3的鉴别诊断系统，其中所述生物素标记特异性核酸扩增引物是根据非典型肺炎病原体靶序列的特异性和同源性特点、用核酸合成仪将寡核苷酸按照上述特点进行合成而制备的。
5.根据权利要求4的鉴别诊断系统，其中所述非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针偶联的荧光微球，是用带有荧光素的聚苯乙烯微球、分别与18种非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针通过共价偶联的化学反应而制作的。
6.根据权利要求5的鉴别诊断系统，其中所述非典型肺炎病原体特异性寡核苷酸探针是通过核酸合成仪制备，探针在5′-末端被氨基化；所述聚苯乙烯微球是羧基化的聚苯乙烯荧光微球。
7.根据权利要求6之一的鉴别诊断系统，其中所述计算机分析处理系统是带有根据悬浮点阵病原体检测结果对感染患者进行判别分类后，根据发烧患者、非典型肺炎疑似病例和临床诊断病例病原体的分布建立三个线性判别函数方程，并由此编制的软件程序的计算机分析处理系统。
8.根据权利要求1-7之一的鉴别诊断系统，其中所述辅助试剂包括藻红蛋白标记的链霉亲和素、核酸提取试剂、一步法逆转录核酸扩增试剂、聚合酶链反应产物纯化试剂和悬浮点阵杂交检测试剂。
9.根据权利要求1-8之一的鉴别诊断系统用于鉴别或者诊断严重急性呼吸道综合征的用途。
10.一种使用权利要求1-8之一的鉴别诊断系统用于鉴别或者诊断严重急性呼吸道综合征的方法，包括如下步骤a.非典型肺炎病原体样本的核酸提取；b.一步法反转录核酸扩增；c.聚合酶链反应产物的纯化；d.荧光微球的检测；e.计算机分析处理系统判定检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒核糖核酸及其它人类常见非典型肺炎病原体的鉴别诊断系统，该系统包括病原体悬浮点阵检测试剂盒和计算机分析处理系统。本鉴别诊断系统利用18种常见急性呼吸道感染病原微生物特异性探针偶联的荧光微球组合，以寡核苷酸探针捕获的方法检测包括严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒在内的非典型肺炎病原体，该方法检测指标多、灵敏度高、特异性好、组配合理、操作简便，特别适宜进行群体发烧的病原学筛查和非典型肺炎病原体的鉴别诊断。
文档编号G01N33/52GK1600864SQ03126419
公开日2005年3月30日 申请日期2003年9月28日 优先权日2003年9月28日
发明者马旭, 韩健 申请人:马旭