专利名称：量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法
技术领域：
本发明涉及量子点的生物应用，更具体涉及一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物与酶的作用效应。
背景技术：
有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针， 对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法， 该制备方法工艺快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，在保持了过氧化氢酶(CAT)—定活性的同时，修饰了量子点表面，使其具有较高的荧光强度。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
其技术构思是一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点(自制， 请见A E步骤)、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-AL0RICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海延长生化公司)、L-甘氨酸(Glycine，凌飞科技)，其余为Tris缓冲溶液。所述的CdTe量子点中，氯化镉(CdCl2*2. 5H20,国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4,请见A步骤)、巯基乙酸(TGA, Japan)的摩尔比率分别为2. 5 1 :3，100°C条件下加热l(T20min。所述的Tris缓冲溶液pH值为6. 8-7. 6。—种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下
A、制备碲氢化钾(KH4Te)溶液通过硼氢化钾(KBH4，天津市天大化学试剂厂)还原碲粉(Te，国药集团化学试剂有限公司)制备，反应方程式如下
4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2
分别称取0. 337g的硼氢化钾(KBH4)和0. 319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾 (KBH4)中加入5mL高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉(Te)混合，塞上塞子，于3__5°C 下反应纩16h，得紫黑色液体，取上清部分Iml，用无氧高纯水定容至IOOml，即为0. 005mol/ L的碲氢化钾(KH4Te)溶液；
B、称取0.228g氯化镉(CdCl,2. 5H20)晶体，用高纯水溶解定容至IOOmL, U 0. Olmol/ L的氯化镉(CdCl2)溶液；
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA)，用高纯水稀释定容至IOOmL,得0. 01mol/L的巯基乙酸 (TGA)溶液。D、取无氧高纯水250mL，在中速搅拌和不断通入高纯氮气(N2)的条件下，依次分别加入50mL0. 01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0. 01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液，用 5mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值为10. 5^11. 5，后加入40mL碲氢化钾(KH4Te)溶液,反应4-6min。Ε、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100°C下微波加热10-20min，即制得浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点。氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾 (KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为2. 5 1 :3。F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点，加入0. 2mL0. 5g/L 的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37°C恒温振荡0. 5-lh，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应，后加入0. 5mL4X10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于25 35°C下振荡4(T60min后，加入0. 3mL、0. lmol/L的L-甘氨酸 (Glycine)终止交联。制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针，该探针在保持了一定酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到较大提高(309Γ509Ο。所述的CdTe量子点如何制备的过程请见步骤A E。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1.该探针主要原料大部分来源丰富，价格低廉；过氧化氢酶虽价格较贵，但添加量少， 对总体价格影响不大。2.该探针制备工艺快速简单，工艺参数易控制。3.该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高。
具体实施例方式下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点，仅在于说明本发明而决不限制本发明。实施例1
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点、过氧化氢酶(CAT， SIGMA-AL0RICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海延长生化公司)、L-甘氨酸(Glycine，凌飞科技)，其余为Tris缓冲溶液。所述的CdTe量子点中，氯化镉(CdCl2*2. 5H20,国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4,)、巯基乙酸(TGA，Japan)的摩尔比率分别为2. 5 1 :3，100°C条件下加热 10 20min。所述的Tris缓冲溶液pH值为6. 8-7. 6。一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下
A、制备碲氢化钾(KH4Te)溶液通过硼氢化钾(KBH4)还原碲粉(Te)制备，反应方程式如下
4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2 分别称取0. 337g的硼氢化钾(KBH4)和0. 319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾(KBH4)中加入5mL高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉(Te)混合，塞上塞子，于3°C、 或 1°C、或-1°C、或-2°C、或-3°C、或-4°C、或-5°C下反应 8 h、或 10 h、或 12 h、或 14 h、或 16h，得紫黑色液体，取上清部分1ml，用无氧高纯水定容至100ml，即为0. 005mol/L的碲氢化钾(KH4Te)溶液；B、称取0.228g氯化镉(CdCl,2. 5H20)晶体，用高纯水溶解定容至IOOmL,得0. Olmol/ L的氯化镉(CdCl2)溶液；
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA)，用高纯水稀释定容至IOOmL,得0. Olmol/L的巯基乙酸 (TGA)溶液。D、取无氧水250mL，在中速搅拌和不断通入高纯氮气( )的条件下，依次分别加入 50mL0. 01mol/L 的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0. 01mol/L 的巯基乙酸(TGA)，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液(NaOH)调节pH值为10. 5、或11、或11. 3、或11. 5，后加入40mL碲氢化钾(KH4Te) 溶液，反应5min。Ε、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100°C下微波加热10或12或14或16或18或20min，即制得浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点。 氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为2.5 1 :3。F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点，加入0. 2mL0. 5g/L的 N-羟基琥珀酰亚胺(MB)于37°C恒温振荡0. ，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(MB)的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应，后加入0. 5mL4X ΙΟ, mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于 25 °C、或 27 °C、或四 °C、或 31 °C、或 33 °C、或；35 °C 下振荡 40min、或 45min、 或 50min、或 56min、或 60min 后，加入 0. 3mL、0. lmol/L 的 L-甘氨酸(Glycine)终止交联。 所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高(309Γ509Ο。实施例2
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点(自制)、过氧化氢酶 (CAT, )、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS, )、L-甘氨酸(Glycine，)，其余为Tris缓冲溶液。所述的CcTTe量子点中，氯化镉(CdCl2*2. 5H20,)、碲氢化钾(OeH4，自制)、巯基乙酸(TGA，)的摩尔比率分别为2. 5 1 3,100°C条件下加热10 20min。所述的Tris缓冲溶液pH值为7. 2。取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为2. 5 1 3的混合溶液，调节溶液pH值为11.0，以每罐50ml分装于聚氟乙烯消解罐中，于100°C 下微波加热20min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe 量子点，加入0. 2mL0. 5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37°C下恒温振荡0. 5h，后加入 0. 5mL4X 10_10 mol/L的过氧化氢酶CAT溶液，于35°C恒温振荡60min后，再加入0. 3mL、 0. lmol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联，制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高(40%)。其它实施步骤与实施例1相同。实施例3
取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比分别为2. 5 1 3的混合溶液，调节溶液PH值为11. 4，以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100°C下微波加热15min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点， 加入0. 2mL0. 5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于30°C恒温振荡0. 5h，后加入0. 5mL4X10"10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于30°C下恒温振荡45min后，再加入0. 3mL、0. lmol/L的 L-甘氨酸(Glycine)终止交联，制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高(50%)。
其它实施步骤与实施例1相同。
权利要求
1. 一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下制备碲氢化钾溶液通过硼氢化钾还原碲粉制备，反应方程式如下 4KBH4 + 2Te + 7H20 — 2KH4Te + K2B4O7 +IlH2 分别称取0. 337g的硼氢化钾和0. 319g的碲粉于具塞试管中，向硼氢化钾中加入5mL 高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉混合，塞上塞子，于3-5°C下反应纩16h，得紫黑色液体，取上清1ml，用无氧高纯水定容至100ml，为0. 005mol/L的碲氢化钾溶液；B、称取0.228g氯化镉晶体，用高纯水溶解定容至IOOmL,得0. 01mol/L的氯化镉溶液；C、称取0.092g巯基乙酸，用高纯水稀释定容至IOOmL,得0. 01mol/L的巯基乙酸溶液；D、取无氧高纯水250mL，在搅拌和不断通入高纯氮气的条件下，依次分别加入 50mL0. 01mol/L的氯化镉溶液、60mL0. 01mol/L的巯基乙酸溶液，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节PH值为10. 5 11. 5，后加入40mL碲氢化钾溶液，反应4-6min ；Ejf(D)步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100°C下微波加热 10-20min,即制得浓度为1 mmol/L CdTe量子点，氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率分别为 2. 5 1 3 ；F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L CdTe量子点，加入0. 2mL0. 5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺于37°C恒温振荡0. 5-lh，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基进行酯化反应，后加入0. 5mL4X 10, mol/L的过氧化氢酶溶液，于25 35°C下振荡 4(T60min后，加入0. 3mL、0. lmol/L的L-甘氨酸终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。
全文摘要
本发明公开了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤A、制备碲氢化钾溶液通过硼氢化钾还原碲粉制备；B、称取氯化镉晶体，用高纯水溶解定容，得氯化镉溶液；C、称取巯基乙酸，用高纯水稀释定容，得巯基乙酸溶液；D、取无氧高纯水，在搅拌和不断通入高纯氮气，分别加入氯化镉溶液、巯基乙酸溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值，加入碲氢化钾溶液；E、将混合液分装于聚四氟乙烯消解罐中，氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率；F、取CdTe量子点，加入N-羟基琥珀酰亚胺于恒温振荡，得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。工艺简单，工艺参数易控制；具有很好的生物相容性；具有双重检测性能，同时可进行荧光检测与酶活性检测。
文档编号G01N21/64GK102169090SQ20111000668
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者何振宇, 史广宇, 周培疆, 陈驰 申请人:武汉大学