专利名称：一种辅助鉴定马铃薯v病毒的试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂及其应用。
背景技术：
马铃薯V病毒(Potato virus V，PVV)，是一种重要的马铃薯病毒，主要在法国、爱 尔兰、秘鲁、英国等发生。PVV在我国无报道，是我国进境重要的检疫对象(《中华人民共和 国进境植物检疫有害生物名录》(2007年版))。马铃薯V病毒的自然寄主是马铃薯，是马 铃薯上一个非常重要的病毒，能被多种蚜虫非持久传播，对马铃薯的危害较大。该病毒还可 与其他病毒混合侵染，危害更大，能造成产量下降，影响马铃薯生产。PVV在马铃薯上系统 侵染，病毒能够传到薯块上，薯块带毒率较高，在引进的马铃薯种薯中携带该病毒的机率极 大，具有潜在的巨大风险。引进种薯如作为种质资源，该病毒可能随种薯繁殖而定殖。如作 为生产薯，病毒在生长期内由蚜虫在田间传播。虽然多数病毒经一个生长季节后，将随带病 薯块用做消费而自然消亡，但少量将随次生薯块留在田间，第二年春季萌发后作为初侵染 源，如果再有部分病薯被作为种薯，该病毒将完全能够存活下来。因此，发病的种薯无论是 种质资源，还是作为生产用种，该病毒都能完成周年循环，在引进地区定殖。马铃薯具有很高的食用和经济价值，近年来，已上升为我国第四大粮食作物，对于 维护我粮食安全具有重要意义。许多国家看好中国马铃薯市场，大量的马铃薯种薯输入或 将要输入我国。近年来，国外的马铃薯种薯不断进入中国，该病毒极有可能随进境种薯的引 进而进入中国。该病毒一旦传入，我国将面临种薯降级甚至无法再用做种薯，市场潜力大大 降低，严重影响中国马铃薯种薯在国际市场上的竞争力，经济影响大。为了维护我国马铃薯 这一巨大产业健康发展、防止马铃薯V病毒随马铃薯种薯等进境物传入中国并尽量减少国 际贸易摩擦，开发出快速、灵敏检测马铃薯V病毒的先进的技术，意义重大。关于马铃薯V病毒的检测技术的研究报道极少，目前，检测马铃薯V病毒的方法 主要有鉴别寄主、电镜观察(Hooker WJ. Compendium of Potatodisease [Μ]. St. Paul. MN The American Phytopathological Society，1981.)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等(王秀 芬，刘伟等，引进加拿大马铃薯种薯中病毒的检测[J].植物检疫，2002，16(1) 16-18.；刘 洪义，李明福等，黑龙江马铃薯病毒病的普查及鉴定[J].东北农业大学学报，2006，37 (3) 307-310.)。电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵 敏度低、易出现假阳性。未见采用实时荧光PCR检测PVV的研究报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂及其应用。本发明提供的辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序 列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。所述试剂可由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列 表的序列4所示。所述特异探针可为TaqMan探针。
所述试剂可用于制备辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂盒，包括所述试剂。所述试剂可用于辅助鉴定马铃薯V病毒。本发明还提供了一种辅助鉴定马铃薯V病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒 的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用 特异弓丨物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为67bp且PCR产物乙为85bp，待 测病毒为候选的马铃薯V病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列3所示DNA组成的引物对。本发明还提供了另一种辅助鉴定马铃薯V病毒的方法，包括如下步骤以待测病 毒的cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测 病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙； 根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的马铃薯V病毒；所述特异引物对 甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对 乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为 TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增曲线乙 均为阳性，待测病毒为候选的马铃薯V病毒。所述待测病毒具体可为李痘病毒、马铃薯A病毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或 香石竹环斑病毒。本发明还保护一种检测待测样本中是否含有马铃薯V病毒的方法，包括如下步 骤(1)提取待测样本的总RNA，反转录为cDNA ；(2)以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增 曲线甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增 曲线乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有马铃薯V病毒；所述特异 引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异 引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异 探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述扩增曲线甲和所述扩增 曲线乙均为阳性，待测样本含有马铃薯V病毒。所述TaqMan探针5’末端具体可连接有荧光报告染料FAM，3’末端具体可连接有 荧光淬灭染料TAMRA。不同的方法，灵敏度和准确性差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法灵敏度相差 100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相差也在100倍以上。即使同样采用 实时荧光PCR技术，由于引物的扩增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实 际检测鉴定工作中，为了提高结果的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试 验，不同方法检测灵敏度不一样，很难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增 加了难度，特别是在检测目标含量极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检 测灵敏度一样或非常接近，这个难题就迎刃而解。实时荧光PCR(Realtime-PCR)检测技术是国际最近十余年发展起来的高新检测
4技术，该技术将PCR扩增与荧光检测系统有机结合起来。与目前已报道的其它检测技术 相比，该技术具有巨大的优越性，主要体现在(a)能实时观察PCR过程中待检测样品模板 DNA(或cDNA)扩增情况，无需进行电泳、染色和紫外检测，大大简化了操作程序并缩短检测 时间；(b)采用荧光信号放大功能，大大提高了灵敏度；(c)特异性引物与特异荧光探针双 保险结构有效提高了检测的准确性；(d)全封闭的操作系统，减少了 PCR产物对实验室环境 的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。实时荧光PCR技术，是目前最 准确、最灵敏的技术，其优越性使之在植物检疫中具有广阔的应用范围和前景。马铃薯V病毒(Potato virus V，PVV)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据 PVV中CP基因(coat protein gene)的保守序列，设计了三条巢式PCR引物和一条TaqMan 探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测PVV的方法。与现有技术比较，本发明的优点如下⑴上述实时荧光PCR技术的优点在本发明 得以全部体现，如准确、灵敏、简便、快速和能有效减少污染等；(2)设计上非常巧妙地将巢 式PCR的原理运用到实时荧光PCR技术中，并与实时荧光PCR技术有机结合；(3)在实时荧 光PCR技术的基础上仅增加一条引物，就形成两套独立的实时荧光PCR反应系统；(4)两套 引物探针相互验证，进一步有效提高了结果的准确性；(5)两套引物探针的扩增效率一致， 因此对于同一个样品的两次验证实验，结果的能保证基本一致，从而降低了结果判断的难 度，在实际检测工作、科研和解决重大的国际贸易争端中具有极强的可操作性；(6)两套引 物探针的扩增效率极高，检出低限均可达5fg/y 1植物总RNA。


图1为特异性测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为Δ Rn，横轴为循环数；A 为 PVV, B 为 PVA, C 为 PPV，D 为 PVY，E 为 CRSV, F 为 CKl, G 为 CK2。图2为特异性测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为Δ Rn，横轴为循环数；A 为 PVV, B 为 PVA，C 为 PPV，D 为 PVYn，E 为 CRSV, F 为 CK1，G 为 CK2。图3为灵敏度测定中试剂甲的实时荧光PCR结果；纵轴为Δ Rn,横轴为循环数；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所对应的 RNA 浓度依次为 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 对应 DEPC 水。图4为灵敏度测定中试剂乙的实时荧光PCR结果；纵轴为Δ Rn，横轴为循环数；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所对应的 RNA 浓度依次为 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 对应 DEPC 水。图5为试剂甲和试剂乙的扩增效率对比图；纵轴为ARn,横轴为循环数；A为试剂 甲，B为试剂乙。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。实时荧光PCR基因扩增仪为ABI PRISM 7000(美国ABI公 司)；核酸蛋白分析仪为BioPhotometer (德国印pendorf公司)；植物总RNA提取试剂盒 (商品名Ε. Ζ. N.A ，美国Omega公司产品，货号R2867_01)购自北京双羸生物公司；反转录试剂盒购自大连宝生物公司(TaKaRa)(货号DRR037A)、实时荧光PCR试剂盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG，货号C11730-025)购自美国Invitrogen公司。以下实施例中的 定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实时荧光PCR的结果的判定标准为Ct值 < 40，为阳性；Ct值彡40，为阴性。马铃薯V 病毒(potato V virus, PVV) =ATCC 编号 PV-754 ；香石竹环斑病毒(Carnationringspot virus, CRSV) :ATCC 编号 PV-21 ；李痘病毒(Plumpox virus, PPV) =ATCC 编号 PVAS-709 ；马铃薯A 病毒(Potato Virus A, PVA) =ATCC 编号 PVAS-266 ；马铃薯Y 病毒(potato virus Y, PVY) =ATCC 编号 PV-50 ；ATCC 即美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection) , http:// www, atcc. orR/ο实施例1、试剂的制备一、引物和探针的设计根据美国NCBI核酸数据库中马铃薯V病毒基因组(NC_004010)中CP基因序列保 守区，分别设计一条上游引物(PVVF)、两条下游引物(PVVR1和PVVR2)和一条Taqmam探针 (PVVP)。二、试剂的组成1、试剂甲的组成试剂盒由PVVF、PVVRl和PVVP组成(引物和探针由上海生工合成)。PVVF(上游引物)5，-CCGCAGCTGGTGAGCAAT-3，(序列表的序列 1)；PVVRl (下游引物)5，-GTGCCAGTTGTTCCTGCATTT-3，(序列表的序列 2)；PWP (探针)5，(FAM)-CATCCCGTTCTTCGAGACCCTTACTT-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列为序列表的序列4，5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA)。PVVF和PVVRl的靶序列大小为67bp (见序列表的序列5)。2、试剂乙的组成试剂乙由PVVF、PVVR2和PVVP组成(引物和探针由上海生工合成)。PWF(上游引物)5，-CCGCAGCTGGTGAGCAAT-3，(序列表的序列 1)；PWR2(下游引物)5，-ATGCGCGGGATTGTGAAC-3，(序列表的序列 3)；PWP(探针)5，(FAM)-CATCCCGTTCTTCGAGACCCTTACTT-3，(TAMARA)；(核苷酸序 列为序列表的序列4，5’端标记报告荧光染料FAM，3’端标记淬灭荧光染料TAMRA)。PVVF和PVVR2的靶序列大小为85bp (见序列表的序列6)。实施例2、试剂的应用分别取感染五种病毒(PPV、PVA、PVV、PVY和CRSV)的马铃薯，取健康马铃薯叶片 作为对照，应用实施例1制备的试剂甲和试剂乙分别进行特异性测定、灵敏度测定，并进行 试剂甲和试剂乙的扩增效率对比。一、试剂的特异性测定1、总RNA提取及质量控制用植物总RNA提取试剂盒从感染每种病毒的叶片(5种)和健康叶片(CKl)中分 别提取总RNA。用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。2、反转录合成cDNA用反转录试剂盒分别将步骤1从6种叶片中提取的总RNA进行反转录，得到cDNA ； DEPC水作为总RNA的对照(CK2)。反应体系(25μ L) 5 μ L PrimerScript buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 总 RNA,力口 DEPC 水至 25 μ L。反应条件37°C、15min，85°C、5s。3、试剂的特异性用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂(试剂甲或试剂乙)将步骤2中的 cDNA进行实时荧光PCR。试齐[J甲的反应体系(25yL) =PCR buffer (2 Χ) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVRl (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，补充 DEPC/K 至 25 μ 1。每个cDNA设置2个重复。试齐[J乙的反应体系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVR2(15yM)ly 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2. 0 μ 1，补充 DEPC/K 至 25 μ 1。每个cDNA设置2个重复。试剂盒和试剂乙的反应体系均在ABI PRISM 7000的96孔板中进行；循环条件为 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 个循环。采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图1。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图2。 应用试剂甲只有在PW中出现扩增曲线(Ct值=24)，判为阳性；应用试剂乙只有在PVV中 出现扩增曲线(Ct值=25)。PVA、PPV、PVY、CRSV、CK1和CK2均未出现扩增信号，判为阴性。 结果表明，试剂甲(或试剂乙)的特异性很好，结果与预计相符。二、试剂的灵敏度测定1、总RNA提取和各个稀释液的制备用植物总RNA提取试剂盒从感染PVV的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析 仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度和纯度值。浓度值为50ng/l·! 1，纯度值为 0D260/280 = 2. 14，0D260/230 = 2. 38。用DEPC水将提取的总RNA进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液。各个稀释液中， RNA 浓度分别为 5ng/ μ 1、500pg/ μ 1、50pg/ μ 1、5pg/ μ 1、500fg/ μ 1、50pg/ μ 1、5fg/ μ 1、 0. 5fg/y 1、0· 05fg/y 1、0· 005fg/y 1。2、反转录合成cDNA用反转录试剂盒分别将各个稀释液进行反转录，得到cDNA ；DEPC水作为总RNA的 对照。反应体系(25μ L) 5 μ L PrimerScriρt Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 稀释液，加 DEPC 水至 25 μ L。反应条件37°C、15min，85°C、5s。3、试剂的灵敏度
用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂(试剂甲或试剂乙)将步骤2中的 cDNA进行实时荧光PCR。试齐[J甲的反应体系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVRl (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2.0 μ 1，补充 DEPC/K 至 25 μ 1。每个cDNA设置2个重复。试齐[J乙的反应体系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVVF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVVR2(15yM)ly 1，PVVP(IOyM)Iy 1，cDNA 2. 0 μ 1，补充 DEPC/K 至 25 μ I0每个cDNA至少2个重复。试剂甲和试剂乙的反应体系均在ABI PRISM 7000的96孔板中进行；循环条件为 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 个循环。采用试剂甲的实时荧光PCR结果见图3。采用试剂乙的实时荧光PCR结果见图4。 应用试剂甲可以判为阳性的最低稀释度为5fg/y 1植物总RNA(Ct值=39)；应用试剂乙可 以判为阳性的最低稀释度为5fg/yl植物总RNA(Ct值=38)。结果表明，应用试剂甲(或 试剂乙)检测的灵敏度可达10_7，即5fg/ μ 1植物总RNA0三、试剂甲和试剂乙的扩增效率对比1、总 RNA 提取用植物总RNA提取试剂盒从感染PPV的叶片中提取总RNA。用核酸蛋白分析仪 BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度和纯度值。2、反转录合成cDNA用反转录试剂盒将总RNA进行反转录，得到cDNA ；DEPC水作为总RNA的对照。反应体系同步骤一的2。3、试剂的灵敏度用实时荧光PCR试剂盒和实施例1制备的试剂(试剂甲或试剂乙)将步骤2中的 cDNA进行实时荧光PCR。方法同步骤一的3。实时荧光PCR结果见图5。采用试剂甲的Ct值=21 ；采用试剂乙的Ct值=21。 结果表明，试剂甲和试剂乙的扩增效率几乎完全一样。
权利要求
1.一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1 所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于所述试剂由所述特异引物和特异探针组成； 所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于所述特异探针为TaqMan探针。
4.权利要求1至3中任一所述的试剂在制备辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂盒中的应用。
5.一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂盒，包括权利要求1至3中任一所述的试剂。
6.权利要求1至3中任一所述的试剂在辅助鉴定马铃薯V病毒中的应用。
7.一种辅助鉴定马铃薯V病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的cDNA为模板，用 特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行 PCR,得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为67bp且PCR产物乙为85bp，待测病毒为候选的马 铃薯V病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组 成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组 成的引物对。
8.一种辅助鉴定马铃薯V病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的cDNA为模板，用 特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线甲；以待测病毒的cDNA为模板， 用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线乙；根据扩增曲线甲和 扩增曲线乙判断待测病毒是否为候选的马铃薯V病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列 1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列1 所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸 序列如序列表的序列4所示。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待测病毒为李痘病毒、马铃薯A病 毒、马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒或香石竹环斑病毒。
10.一种检测待测样本中是否含有马铃薯V病毒的方法，包括如下步骤(1)提取待测样本的总RNA，反转录为CDNA；(2)以所述cDNA为模板，用特异引物对甲和特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线 甲；以所述cDNA为模板，用特异引物对乙和所述特异探针进行实时荧光PCR，得到扩增曲线 乙；根据扩增曲线甲和扩增曲线乙判断待测样本中是否含有马铃薯V病毒；所述特异引物 对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述特异引物 对乙为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异探针 为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列4所示。
全文摘要
本发明的目的是提供一种辅助鉴定马铃薯V病毒的试剂及其应用。本发明提供的试剂包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的特异引物。所述试剂还可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特异探针。马铃薯V病毒是我国重要的检疫性有害生物。本发明中利用三条PCR引物和一条TaqMan探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测PVV的方法。该方法有机地结合了巢式PCR和实时荧光PCR技术；三条引物形成的两套PCR体系相互验证，有效提高了结果的准确性；荧光探针有效提高了检测的灵敏度。实验结果表明，本方法准确、灵敏、简便、快速，检出低限均可达5fg/μl植物总RNA。
文档编号G01N21/64GK102002538SQ20101056115
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者张永江, 李彬, 李明福, 杨益娥, 王真, 粟智平, 陈洪俊 申请人:中国检验检疫科学研究院, 烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心