受试者中癌状态的免疫检测的制作方法-山东科威数控机床有限公司

专利名称：受试者中癌状态的免疫检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及受试者中癌的诊断并且更特别地涉及癌状态的免疫检测。现有技术下列是被认为与描述本发明领域技术状态有关的技术的列表。本文对这些参考文献的确认有时通过表明它们在来自下文列表的括号内的编号来进行。Claytor RB 等人，Journal of Vascular Surgery，第 37 卷，第 2 期，第 440-445 页。Furman MI,Liu L,Benoit SE,Becker RC,Barnard MR,Michelson AD. The cleaved peptide of the thrombin receptor is a strong platelet agonist(凝血酶受体的裂角军肽是强的血小板激动剂).Proc Natl Acad Sci USA. 1998 年 3 月 17 日；95 (6) :3082_7。Coughlin SR. How the protease thrombin talks to cells (蛋白醇凝血醇如何与细胞交流)· Proc Natl Acad Sci USA. 1999 年 9 月 28 日；96 (20) :11023_7。Lerner DJ, Chen M, Tram T, Coughlin SR. Agonist recognition by proteinase-activated receptor 2 and thrombin receptor (经由蛋白酶活化受体 2 禾口疑] ΒΙ受体的■云力齐UiR另ll )· Importance of extracellular loop interactions for receptor function (细胞外环相互作用对受体功能的重要性).J Biol Chem. 1996年6月 14 日；271 (24) 13943-7 οHammes SR, Shapiro MJ, Coughlin SR.Shutoff and agonist-triggered internalization of protease—activated receptor 1 can be separated by mutation of putative phosphorylation sites in the cytoplasmic tail ( S S Bl iS ^ S 体1的关闭和激动剂触发的内化可通过胞质尾区中推定的磷酸化位点的突变来分离)· Biochemistry. 1999 年 7 月 20 日；38 (29) :9308_16。GoIz S, Brueggemeier ULF和 Summer H.国际专利申请公开第 W02004/081044 号。Hoxie JA，Brass L.国际专利申请公开第 WO 2007/46879 号。
背景技术：
蛋白酶活化受体(PAR)是七跨膜G偶联受体(GPCR)，其仅通过蛋白水解性裂解来活化。已经鉴定了四种不同的PAR(PARl-4)，都响应于一组高选择性的丝氨酸蛋白酶。 PAR作为细胞外蛋白酶梯度的敏感的感应器以允许细胞响应于蛋白水解改变的环境。虽然PARI传统上在血栓形成、止血和血管生物学中起作用，但在肿瘤生物学中出现了令人惊讶地新的作用。这得到正常的和病理的上皮细胞中PARI表达模式的支持。此外，以 NIH3T3细胞中锚定依赖性生长和病灶形成活性的缺失为基础的cDNA表达库筛选导致作为新癌基因的PARI的分离。因此，PARI连接一系列是癌基因的GPCR，包括mas和g2a。 PARI的癌基因性，伴随肿瘤活检标本中和差异转移细胞系中人类Pari (hParl)基因的高表达水平的足够的证据，表明PARI表达和恶性肿瘤之间的正相关。已经表明PARI参与多种原发人类癌，包括乳腺癌(Even-Ram S，等人，(1998) Nat Med. 4(8) :909_14)、结肠癌(Vergnolle N，等人，(2004) J Clin Invest. 114(10) 1444-56 ；Darmoul D，等人，(2004) Mol Cancer Res. 2(9) :514_22)、前列腺癌(Chay CH，等人，Urology (2002) 60 (5) :760_5 ； Salah Z，等人，(2005) FASEB J19(l) :62_72)、卵巢癌(Grisaru-Granovsky S，等人，2005. Differential expression of protease activated receptor 1 (Pari)and pY397FAK in benign and malignant human ovarian tissue samples(良性禾口恶性人类卵巢组织样品中蛋白酶活化受体I(Parl)和pY397FAK的差异表达).Int J Cancerl 13(3) :372_8)和黑色素瘤(Nierodzik ML，等人，(1998) Blood. 92 (10) 3694-700 ；Shi X，等人，(2004)Mol Cancer Res. 2(7) 395-402)。PARI基因和蛋白过表达与体内肿瘤攻击性有关的事实反映了其在肿瘤传播中的潜在作用并确定其为令人感兴趣的抗癌治疗的靶。事实上，PARI至少在乳腺肿瘤的发展中起到关键作用，因为在体外，hParl反义序列(含有启动子部分和蛋白的起始位点的462碱基对反义序列的质粒)的引入降低了它们通过基质胶(Matrigel)涂布的滤器转移的能力 (Even-RamS，等人(1998) Nat Med. 4(8) :909_14)。最近，已经表明从PARI释放的41个残基的多肽(TR1-41)是强的血小板激动剂 (Claytor RB 等人，Journal of Vascular Surgery，第 37 卷，第 2 期，第 440-445 页)。与PARI有关的一些另外的出版物包括W02007/020645描述了用于经由RNA干扰调节蛋白酶活化受体1基因表达的核酸分子、载体、组合物和方法。特别地，该公开表征了调节蛋白酶活化受体1基因表达的小干扰RNA(siRNA)和短发卡RNA(shRNA)分子以及方法。W02004/081044描述了与心血管病症、皮肤病症、胃肠和肝疾病、神经病症、癌病症和泌尿病症有关的人类PARI ；鉴定用于治疗或预防这些病症和疾病的化合物的测定和与 PARI结合和/或活化或抑制PARI活性的化合物以及包括这些化合物的药物组合物。W02007/46879描述了用于通过能够测定凝血酶受体的裂解肽片段的存在的测定系统来检测凝血酶诱导的细胞活化的方法和试剂盒。发明概述根据一个方面，本发明提供测定受试者中癌状态的方法，所述方法包括测定针对蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合，其中所述抗体与所述标志物的结合指示癌状态。根据另一个方面，本发明提供了测定受试者中癌状态的严重度的方法，包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合的水平，并且将结合的水平与将抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平相比较。根据另一个方面，本发明提供了测定使用抗癌剂的受试者的治疗性治疗对受试者的效力的方法，包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与在两个或更多个连续的时间点从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合的水平，一个或多个时间点在治疗性治疗期间，其中水平上的差异指示治疗性治疗的效力。在一个实施方案中，PARI释放肽包括描绘为SEQ ID NO 1的序列或者由描绘为 SEQ ID NO :1的序列组成。根据一个实施方案，所述PARI释放肽的片段包括本文称为SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3、优选SEQ IDNO :3的序列或者由本文称为SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3、优选SEQ IDNO 3的序列组成。根据另一个方面，本发明还提供了测定针对蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽或其片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合试剂包(package)，包括(i)针对蛋白酶活化受体1 (PARI)释放肽或其片段而产生培养的并且能够结合所述液体样品中可能存在的所述标志物结合的至少一种抗体；(ii)关于所述至少一种抗体用于测定下列中的一个或多个的使用说明书-所述抗体与所述标志物的结合；-所述抗体与所述标志物结合的水平；-所述抗体与所述标志物结合的水平与使抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平之间的差异；-至少一种抗体与来自相同的受试者的两个或更多个连续液体样品中的所述标志物结合的水平上的差异。附图简述为了理解本发明并且了解在实践中它可被如何进行，现在参考附图描述仅作为非限制性实施例的实施方案，其中

图1A-1B显示通过蛋白质印迹分析获得的多克隆抗体与不同量(5、10、20、30ng) 的衍生自PARI释放肽的肽(即肽PARlrp2)的结合(图1A)；结果还表达为相对条带强度的函数(图1B)。图2是蛋白质印迹分析，其显示多克隆抗体与不同量(20、50和IOOng)的含有41 个氨基酸的PARI释放肽(胶上表现为35kDa大小)的结合和与混入健康受试者血清的、由此衍生的肽PARlrp2 (胶上表现为6kDa大小)的结合，由此证明针对PARlrp2而产生的多克隆抗体识别与其他血清组分复合的较大的PARI释放肽或其片段。图3A-3B是多克隆抗体与血清样品中的标志物的结合的蛋白质印迹分析；图3A说明来自健康受试者(H-n，n是代表不同受试者的任意整数)的血清样品和混有PARI衍生的合成肽PARlrp2(H-8+合成肽)的健康样品的对照样品，而图3B说明来自癌患者(C-n，n是代表不同癌患者的任意整数)的血清样品与健康受试者对照样品，混有PARI衍生的合成肽 PARlrp2(+H)的对照样品。图4A-4C是多克隆抗体与来自接受抗癌治疗之前(图4A)和之后(图4B)的IV 期癌患者(C-i或c-ii，i和ii代表两个不同的癌患者)的血清样品和混有PARI衍生的合成肽PARlrp2(+H)的健康受试者的血清的对照样品(图4C)中的标志物的结合的蛋白质印迹分析。图5A-5C是多克隆抗体与来自癌患者(Cx和Cy，代表两个不同的癌患者)(图5A) 或来自外伤当天(损伤当天(T))或外伤后3天(T+3D)或6天(T+6D)的外伤受试者(图 5B)的血清样品和混有PARI衍生的合成肽PARlrp2(+H)的健康受试者的对照血清样品(图 5C)中的标志物的结合的蛋白质印迹分析。图6是多克隆抗体与来自处于疾病的不同期的癌患者(C-10、C-IU C-12、C_13、 C-14和C-15)的血清样品和混有PARI衍生的合成肽PARlrp2 (H-10+肽)或没有肽(H-10) 的健康受试者(H-10)的对照血清样品中的标志物的结合的蛋白质印迹分析。
本发明的一些非限制性实施方案的详述本发明基于如下令人惊讶的发现针对衍生自蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽的短氨基酸肽(本文称为“PARlrp2”)而产生的多克隆抗体能够与从乳腺癌患者获得的血液样品的组分结合，同时就从没有患乳腺癌的个体(健康受试者)获得的血液样品而言没有检测到这种结合。因此，设想在体液样品例如血液样品中检测PARI释放肽反映(反照)出所测试的受试者的癌状态并且由此本文提出将其作为测定癌状态的诊断工具。因此，在这些发现的基础上，本文公开了在受试者中测定癌状态的方法，所述方法包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合，其中所述抗体与所述标志物的结合指示癌状态。本发明还基于如下发现抗体与血液组分的结合的水平能够被测定并且这使得可以测定癌疾病的严重度。因此本文还公开了测定受试者中癌状态的严重度的方法，包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合的水平，并且将结合的水平与使抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平相比较。此外，本发明基于如下发现用抗癌剂治疗患有癌的受试者影响抗体与血液组分结合的水平。因此，本文还公开了测定使用抗癌剂的受试者的治疗性治疗的效力的方法，包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与在两个或更多个连续的时间点从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合的水平，时间点中的一个或多个在治疗性治疗期间，其中水平上的差异指示治疗性治疗的效力。PARI释放肽可以是包含从PARI裂解的至少5个，优选地至少6个，并且更优选的至少7个氨基酸残基的序列的任何肽或多肽(因此用术语“PARI释放肽”指代所述肽)。应注意的是至少5个，优选地至少6个，并且更优选的至少7个氨基酸残基的序列可以是嵌合肽的一部分，即，序列两侧是不相关的序列。在本发明的一个实施方案中，PAR释放肽是衍生自PARI的N末端的41个氨基酸残基的肽并且优选地由下列序列组成NH2-Met-Gly-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Ala-Cys-Phe-Ser-Leu-Cys-Gly-Pro-Leu-Leu-Ser-Ala-Arg-Thr-Arg-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Ser-Lys-Ala-Thr-Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-COOH(SEQ ID NO 1)根据本公开内容，可以针对衍生自所述PARI释放肽的片段而产生抗体。片段可以包含5至41个，有时7-35个甚至有时15-25个氨基酸，当片段的序列和原始PARI释放肽的序列进行最佳比对时，具有与原始PARI释放肽至少70%、至少80%、至少90%、至少 95%以及甚至至少99%的同一性。通常，需要至少约5-10个的氨基酸序列以便引发抗体的产生。因此，在一个实施方案中，针对包含至少5-10个残基的肽产生抗体，当片段的序列和原始PARI释放肽的序列进行最佳比对时，所述肽具有与原始PARI释放肽至少70%、至少 80 %、至少90 %、至少95 %以及甚至至少99 %的同一性。术语“最佳比对”被用来表示给出最高百分比同一性得分的两个氨基酸序列的(例如PARI释放肽和其片段的)比对。在一个实施方案中，片段包括约15至25个氨基酸残基的序列，当两个片段和PARI 释放肽进行最佳比对时，所述序列与PARI释放肽的一部分是相同的。在本公开内容的上下文中，衍生自PARI释放肽的片段是当片段和PARI释放肽进行最佳比对时包含相应于PARI释放肽中的连续氨基酸残基的至少5个连续氨酸残基的任何氨基酸序列。在一个实施方案中，片段是当片段和PARI释放肽进行最佳比对时包含相应于PARI释放肽中的连续氨基酸残基的至少5、6、7、8、9或10个连续氨酸残基的任何氨基酸序列。片段中的至少5、6、7、8、9或10个连续氨酸残基可以与所述PARI释放肽中相应的连续氨基酸残基相同或者可以包含原始序列(即PARI释放肽的天然存在的序列)的一个或多个保守的修饰。术语“保守的修饰”被用来表示对“原始"PARI释放肽的修饰，如本领域的技术人员所理解的，所述修饰包括使用非天然存在的氨基酸保守替代(取代)一个或多个氨基酸，一个或多个氨基酸的插入或缺失以及氨基酸的化学修饰。修饰还可包括肽主链中键的改变。术语“天然存在的氨基酸”是指在肽中存在的部分并且由-NH-CHR-CO-表示，其中 R相应于20种天然存在的氨基酸的侧链。术语“非天然存在的氨基酸”(氨基酸类似物)是拟肽有机部分或者是具有下式的D或L残基-NH-CHR-CO-，其中R是脂肪族基团、取代的脂肪族基团、苯甲基基团、取代的苯甲基基团、芳族基团或取代的芳族基团并且其中R不相应于天然存在的氨基酸的侧链。这一术语还指天然存在的氨基酸的D氨基酸对应物。氨基酸类似物也是本领域中熟知的，大量的这种类似物是商业上可得的。在本发明的上下文中，术语“保守的替代”是指使用具有相似立体特性的天然或非天然存在的氨基替代PARI释放肽中存在的原始氨基酸残基。当有待替代的原始氨基酸残基的侧链是极性的或疏水性时，保守取代应当使用也是极性或疏水性的(还具有与所替代的氨基酸侧链相同的立体特性)天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸；当有待替代的原始氨基酸带电荷时，保守取代应当使用带电荷的天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，或者可用具有与所替代的氨基酸的侧链相同的立体特性的不带电荷(极性、疏水性)的氨基酸替代原始带电荷的氨基酸。例如，根据本发明，下列取代被认为是保守的瓜氨酸(cytroline)替代精氨酸、谷氨酰胺替代精氨酸、天冬酰胺替代天冬氨酸、谷氨酰胺替代谷氨酸。为了通过非天然存在的氨基酸产生保守取代，使用本领域熟知的氨基酸类似物 (合成氨基酸)也是可能的。天然氨基酸的拟肽物详细记载于熟练技术人员已知的文献中。下文所列的是天然存在的氨基酸的或者氨基酸类似物的组的一些非限制性实例。用组中一个成员替代组中另一个成员在本文中将被认为是保守取代I组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有下列侧链的修饰氨基酸乙基、正丁基、-CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CH0HCH3 和-CH2SCH3。优选地I组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。II组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有乙基侧链的修饰的氨基酸。优选地II组包括甘氨酸和丙氨酸。III组包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、环己基甲基和具有取代的苯甲基或苯基侧链的修饰的氨基酸残基。优选的取代包括下列中的一个或多个卤素、甲基、乙基、硝基、甲氧基、乙氧基和-CN。优选地，III组包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。IV组包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代的或未取代的脂肪族、芳族或苄型(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、苄基或取代的苄基)酯、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH烷基化(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)的谷氨酰胺或天冬酰胺以及具有侧链-(CH2)3COOH的修饰的氨基酸、其酯(取代或未取代的脂肪族、芳族或苄型酯)、其酰胺和其取代的或未取代的N烷基化的酰胺。优选地，IV组包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甲基天冬氨酸酯、乙基天冬氨酸酯、苄基天冬氨酸酯和甲基谷氨酸酯、乙基谷氨酸酯和苄基谷氨酸酯。V组包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、β -环精氨酸、μ “羟精氨酸、 N-脒基瓜氨酸和2-氨基-4-胍基丁酸、赖氨酸的类似物、精氨酸的类似物和鸟氨酸。优选地，V组包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸和瓜氨酸。氨基酸的类似物包括侧链中1到约3个另外的亚甲基单元。VI组包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有由-OH或-SH取代的C1-C5的直链或支链的烷基侧链的修饰的氨基酸。优选地，VI组包括丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸。如本文所用的，术语“缺失”包括与其所衍生自的原始分子相比除去一个或多个氨基酸残基(天然存在的、非天然存在的或拟肽有机部分)。如本文所用的，术语“插入”或“加入”包括与其所衍生自的原始分子相比加入一个或多个氨基酸残基(天然存在的、非天然存在的或拟肽的(有机部分))。如本文所用的，术语“化学修饰”包括位于氨基酸残基侧链的修饰以及肽键的修饰。因此，可将官能团加至侧链、从侧链除去或用另一个官能团替换。通常修饰是产生保守取代的保守修饰。这一类型的保守修饰的实例包括向缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的脂肪族侧链加入胺或羟基、羧酸，用胺替换天冬氨酸或谷氨酸侧链中的羧酸或者除去赖氨酸或鸟氨酸侧链中的胺基团。本领域已知的其他的化学修饰包括羧甲基化(arboxymethylation)、酰化、磷酸化、糖基化或者脂肪酰化以及其它的化学修饰。“化学修饰”还包括肽主链中键的变化，即已经通过还原(为-CH2-NH-)、N原子上的烷基化(甲基化)将一个氨基酸残基的N-和下一个氨基酸残基的C-之间的键变为非天然存在的键，或者键已经被脒键、脲键或者磺酰胺键、醚键(-CH2-O-)、硫醚键 (-CH2-S-)或-C-S-NH-替代；残基的侧链可被移至主链氮以获得N烷基化的Gly (—种类肽(P印tidoid))。修饰还包括例如通过形成S-S键的氨基酸分子的环化。S-S键可通过在氨基酸分子末端包含含硫的氨基酸残基例如半胱氨酸来形成。已经显示环肽比相应的线性分子更稳定并且具有更高的生物学活性[Jining L.等人，Eur. J. biochem 271 2873-2886(2004)]。根据本公开内容可使用各种片段产生针对其的抗体。在下列实施例中，挑选并制备了衍生自PARI释放肽的两个合成的肽(为了生产抗体加入N端Cys残基)。肽PARlrp 1，其具有序列NH2-C-S-A-R-T-R-A-R-R-P-E-S-K-A-COOH(SEQ ID NO. 2)肽PARlrp2，其具有序列NH2-R-R-L-L-L-V-A-A-C-F-S-L-C-G-P-L-L-S-A-R-COOH
(SEQ ID NO. 3)应注意在本公开内容的上下文中，肽PARlrp2是用于产生有待在本发明的方法中使用的抗体的PARI释放肽的优选片段。术语“标志物”在本文用来表示体液样品中的任何组分，包括任何聚合物、寡聚物或小分子量化合物。在一个优选的实施方案中，标志物是含氨基酸的分子，包括肽、多肽或蛋白。在另一个实施方案中，标志物包括PARI释放肽或其片段。标志物可以包括游离形式或与液体样品中存在的另一种或多种多肽、肽或蛋白复合形式的PARI释放肽或其片段。在一个实施方案中，如下文所进一步提及的，标志物是以与一种或多种血液蛋白复合的形式。根据一个实施方案，液体样品是来自身体的液体，选自全血、血浆、血清、羊水液、脑髓液、腹水(ascitic fluid)(腹水(ascite))或尿。优选地，体液样品包括血或血清。本文所公开的方法所使用的抗体能够结合一种或多种PARI释放肽。通过使用本文定义的PARI释放肽或衍生自PARI释放肽的片段生产抗体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种。为了生产多克隆抗体，可通过注射PARI释放肽来免疫多种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠等。根据宿主种类，还可使用不同的佐剂来增加免疫应答。这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物胶例如氢氧化铝和表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyol)、多聚阴离子、肽、油乳化液、钥孔虫戚血兰素和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)可能是有用的佐剂。也可使用的单克隆抗体。可使用通过培养中连续的细胞系提供抗体分子的生产的任何技术来制备单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein(Nature 256 =495-497, (1975))描述的杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人， Immunol. Today 4:72，(1983) ；Cote 等人，Proc. Natl. AcacL Sci 80:2026-2030，(1983)) 和 EBV-杂交瘤技术(Cole，等人，Mol. Cell Biol. 62 :109_120，(1984) ；Chartrain M, Chu L. Development and production of commercial therapeutic monoclonal antibodies in Mammalian cell expression systems :an overview of the current upstream technologies哺乳动物细胞表达系统中商业治疗性单克隆抗体的开发和生产现有上游技术的综述)· Curr Pharm Biotechnol. 2008 ；9 (6) 447-67 ；Price PW 等人，Engineered cell surface expression of membrane immunoglobulin as a means to identify monoclonal antibody-secreting hybridomas ( {^^^^.^-^ ^^ ^ΛΒ^^Μ^ΧΜ^ 膜免疫球蛋白的工程细胞表面表达).J Immunol Methods. 2009 ；Fransson J, Borrebaeck CA.Selection and characterization of antibodies from phage display libraries against internalizing membrane antigens (从噬菌体展示文库蹄选禾口表征抗内化膜抗原的的抗体).Methods Mol Biol. 2009 ;480 113-27)。根据本发明术语“癌(cancer) ”应当意指其中细胞以异常高且失控的速度增殖的任何病况，所述速度是比正常组织生长更快的。通常，癌可被大致上分为三个主要类型产生于上皮结构的恶性肿瘤(称为癌瘤(carcinomas))；起源于结缔组织例如肌肉、软骨、脂肪或骨的恶性肿瘤(称为肉瘤)；以及影响包括免疫系统组成部分在内的造血结构(参与血液细胞的形成的结构)的恶性肿瘤(称为白血病或淋巴瘤)。其他的赘生物包括但不限于神经纤维瘤。
本发明的方法特别与实体瘤相关。如本文所用的，术语“实体瘤”是指形成块的任何肿瘤。肿瘤块可显示部分或完全缺乏结构组织和与正常组织的功能协调并且可以是原发肿瘤块或继发肿瘤块(即经过血液和淋巴管从原始肿瘤位点细胞迁移的结果)。实体瘤的实例包括但不限于脑、前列腺、乳腺、结肠、肺、肾、膀胱、肝、骨、头、颈、胃、喉、食管、卵巢、宫颈、肝癌、肺癌、直肠、结直肠和胃肠道中的其他位点、子宫、卵巢、皮肤(例如转移性黑素瘤)、子宫内膜、胰腺和睾丸的肿瘤。应注意，已发现PARI在原发和继发乳腺癌活检中都表达(数据未显示)。因此，本发明可用于测定原发以及继发癌。在一个实施方案中，非限制性地，癌是继发癌，即转移的癌。根据一个优选的实施方案，癌是原发或继发的乳腺癌。本文公开的方法可用于在癌的任何期测定癌状态、癌严重度以及治疗效力以及用于测定复发的癌。总体上，癌的期可被称为罗马数字分期。这一系统使用数字I、II、III和IV描述癌的发展。相应地，癌的期通常包括I期定位于身体的一个部分的癌；II或III期局部发展的癌(分期将取决于癌的类型)；IV期已经转移或者扩散到其他器官或整个身体的癌。结合的水平可通过定量以及定性测量来测定。当提到定量测量时，其可以包括测定所结合的抗体或者未结合的抗体的浓度(例如通过使用能够与游离抗体结合的标记的剂来测定)。应注意，这一水平与疾病的程度或严重度相关。高水平(高于预定的阈值或与相应于高的癌的期的先验标准相关)指示严重的状态。就测定治疗的效力的方法而言，类似地，水平上的下降指示患有癌的受试者的病况的改善，例如作为抗癌治疗的结果。术语“预定的阈值”或“之前测定的标准”在本文用来表示指示健康状态或疾病的特定的期(疾病的严重度的程度)的参考值或值的范围。当提到健康状态的预定的阈值 (或之前测定的标准)时，阈值(标准)可与来自统计学上显著的组的健康受试者的PARI 释放肽的平均水平或以其他方式来源于统计学上显著的组的健康受试者中PARI释放肽的水平的值或值的范围相关。当提到疾病的特定期的预定的阈值或之前测定的标准时，可在统计学上显著的组的诊断为患有处于疾病的特定期的疾病的患者中PARI释放肽的水平的基础上测定阈值(标准)。选择用于限定组的受试者的数目的方式可以是统计分析领域中熟练的技术人员已知的。此外，当提到疾病的特定期的预定的阈值或之前测定的标准时，阈值(标准)可以是以在时间点采集自受检测的受试者的液体样品中的PARI释放肽的水平为基础测定的参考点，是当受试者被初次诊断为患有癌时或者在较晚的时间点。在该时间点的水平是利用本发明方法对受试者进行任何随后诊断的参考点。因此，根据这一实施方案，在治疗性治疗开始前的时间点(这是参考点)采集一个或多个第一样品并在治疗期间的时间点采集一个或多个第二样品，其中与对第一样品所测定的结合水平相比在至少一个第二样品中表现出的结合的水平的减少指示治疗是有效的。可选择地，在治疗期间的时间点采集一个或多个第一样品并在一个或多个第一样品的时间点之后的治疗期间的时间点采集一个或多个第二样品，使得与一个或多个第一样品相比在所述一个或多个第二样品中结合的水平的减少指示治疗是有效的。此外，可选择地，在治疗期间的时间点采集一个或多个第一样品并在治疗已经被中断之后的时间点采集一个或多个第二样品，其中与一个或多个第一样品相比在所述一个或多个第二样品中的结合的水平的增加指示治疗是有效的。本领域中已知许多不同的检测系统并且可用于本发明的环境中。这些包括竞争性或非竞争性的结合测定。这些系统包括但不限于如下技术例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀反应、凝胶扩散反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、荧光偏振、蛋白 A免疫测定和免疫电泳测定。所有这些不同的检测系统可被用于标志物的直接检测或通过竞争反应来使用。在一个实施方案中，检测是以“夹心”免疫测定为基础的，其中抗体，优选地单克隆抗体被结合于固体支持物。之后将液体样品与固体支持物接触并且液体样品中的任何标志物可被结合的抗体所捕获。之后可使与所述标志物结合的第二抗体与固体支持物接触。之后可通过检测所结合的第二抗体的量测定样品中标志物的量。可以用例如下述物质标记第二抗体荧光化合物，诸如但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；化学发光化合物，诸如但不限于鲁米诺、异鲁米诺、热稳定性吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸盐酯；生物发光蛋白，诸如但不限于荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白；以及放射性核素。本文还公开了测定针对蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽或其片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合的诊断试剂包，包括(i)针对蛋白酶活化受体1 (PARI)释放肽或其片段而产生的并且能够结合所述液体样品中可能存在的所述标志物的至少一种抗体；(ii)关于所述至少一种抗体用于测定下列中的一个或多个的使用说明书-所述抗体与所述标志物的结合；-所述抗体与所述标志物结合的水平；-所述抗体与所述标志物结合的水平与使抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平之间的差异；-至少一种抗体与来自相同的受试者的两个或更多个连续液体样品中的所述标志物结合的水平上的差异。试剂包可包括下列另外的组成部分的一种或多种-能够与液体样品中可能存在的所述标志物结合的一种或多种另外的抗体，所述一种或多种另外的抗体任选地与固体支持物结合，所述一种或多种另外的抗体可被标记，例如如上文所描述的。_关于所述一种或多种另外的抗体的使用说明书。一种或多种抗体可以能够与PARI释放肽或其片段结合。然而，在某些可选择的实施方案中，一种或多种抗体可以能够与液体样品中以与PARI、PARI释放肽或其片段复合的形式存在的、不同于PAR1、PAR1释放肽或其片段的一种或多种肽、多肽或蛋白结合。这将使得可以检测复合形式的PAR1、PAR1释放肽或其片段。形成本发明的上下文中的复合物的一部分的、不同于PARI、PARI释放肽或其片段的蛋白的实例包括但不限于羧肽酶N和补体成分 4(C4)。
仅为了说明的目的提供下列非限制性实施例。非限制性实施例細制备了代表PARI释放肽的两个(轻微重叠的)区的两种短的合成的肽 PARlrpKSEQ ID NO 2)和PARlrp2 (SEQ ID NO :3)。它们的序列显示以PARI释放肽的序列为基础，由41个氨基酸组成并且具有下列序列(SEQ IDNO=I)
NH2-Met-Gly-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Ala-Cys-Phe-Ser-Leu-Cys-Gly-Pro-
条一一一------一__一— —— — — 一 — 一一一一一_____---— —
PMJibZ (SEQ ID NO.-3)
Leu-Leu-^er-Ala-Arg-Thr-Arg-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Ser-Lys-Ala^Thr-Asn-
·PARlrpl (SEQ IDNO:2)Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-COOH按照下文描述针对这两个短的合成肽产生多克隆抗体。通常，抗体包括-针对PARlrp 1，NH2-C-S-A-R-T-R-A-R-R-P-E-S-K-A-COOH, SEQ IDNO :2 产生的 CUK-158多克隆抗体；-针对PARlrp2，NH2-R-R-L-L-L-V-A-A-C-F-S-L-C-G-P-L-L-S-A-R-CONH2, SEQ ID NO 3产生的多克隆抗体，其还被用于下文所示例的免疫检测测定。将针对抗PARlrp2产生的抗体固定在琼脂糖珠上。使抗体偶联的珠与从健康人或从诊断为患有乳腺癌的患者的血清样品接触(如下文所讨论的，在化学治疗性治疗之前或之后)。之后使含有珠的血清样品经受免疫检测测定。材料和方法肽合成和多克降抗体牛产通过C0VALAB S. A. R. L，FRANCE生产合成肽和多克隆抗体。抗体与NHS活化的琼脂糖偶联制备含有ImM HCl、0. IM Tris pH 8的偶联缓冲溶液，0. IM醋酸盐缓冲液0. 5M NaCl, pH 4. 5，偶联缓冲液0. 2M NaHC03、0. IM NaCl pH 8. 3 ；并且之后于 4°C贮存。将抗体转移到偶联缓冲液溶液中并且使用amicon ultra_4(具有30，000MWC0截留的Ultracel 30k)浓缩。确认使用甘氨酸中和所有Tris (Tris可阻碍与珠的结合)。对于1. 3mg的抗体(通常0. 5ml)，使用ImL的NHS活化的琼脂糖(Amersham，Daniel Biotec代理商)进行加入抗体之前清洗珠的步骤。即将使用前用10-15ml (中等体积)的冷的ImM HCl进一步清洗NHS活化的琼脂糖。向NHS活化的琼脂糖加入抗体(比例为每1. 3mg抗体Iml的NHS珠)。之后将体积加至3ml并将pH调节至6-8 (使用偶联缓冲液和ImM HCl)。于室温下将混合物转动3小时，然后用10-15中等体积的冷的偶联缓冲液清洗珠。在清洗之间将混合物以l，200rpm旋转沉降(spin down) Imin0通过加入10-15中等体积的冷的pH 8的0. IM Tris，之后于4°C转动过夜(封闭的最小时间_3h)，完成珠的封闭。
之后用交替高和低pH缓冲液的方法清洗珠。特别地，用IOml的0. IMTris pH 8. 0和之后用IOml of 0. IM醋酸盐缓冲液0. 5M NaCl,pH 4. 5清洗珠。重复清洗3次(于 1，200rpm旋转Imin)。之后将珠于4°C贮存在含有NaN3的IxPBS中。抗体牛物素化作为将抗体偶联至琼脂糖珠的替代，可将抗体生物素化。为了这一目的，抗 PARlrp2抗体(Img)转移至0. IM NaHC03pH 8缓冲溶液中，并且使用Centricon (具有 30，000MWC0的截留的ami con ultra-4 Ultracel30k)浓缩。使用甘氨酸中和Tris。之后将来自上部的相的一定体积(Centricon中的， 0. 5ml)转移至印pendorf管中并用0. IM NaHC03pH8稀释至2mg/ml (lmg例如应当于0. 5ml中)。之后将抗体转移至带有小的磁力搅拌器的玻璃管中。从于100 μ 1 DMF的4. 3mg生物素制备生物素贮液。向每Img抗体加入生物素(0. 22mg,Roche商品目录号11008960001)。之后将管用铝箔覆盖并于4°C搅拌3小时，之后于室温搅拌1小时。用每100 μ 1的抗体-生物素溶液1 μ 1的IM NH4Cl (比例1 μ 1 100 μ 1)终止反应并于室温搅拌10分钟并旋转沉降(在50ml塑料管中lmin，1，200rpm)。将所得的生物素化的抗体转移至centricon管中(具有30，000MWC0的截留的 ami con ultra-4 Ultracel 30k)并且用PBS清洗一次并且之后加入PBS (lxPBS溶液)。将所得的生物素化的在甘油中1 1稀释并且于-20°C贮存(2.8mg/ml最终 1. 4mg/ml于PBS和甘油中)。之后将生物素化的抗体分为几个管并且贮存。血液样品制备从患者采集新鲜的血液样品。将样品在管中于37°C孵育10分钟。之后使样品于 200C (室温，RT)经受3000rpm的旋转10分钟。从每个管，将1. 5ml带帽微型管中的Iml的血液样品放在冰上并且之后于-80°C即时冷冻。还应注意以Iml —份保存小份的血清。使用PARlrp2抗体偶联的琼脂糖珠从血清免疫沉淀PARI释放肽将冷冻的(_80°C冰箱)血清样品(Iml)与15 μ 1的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma) 混合。之后加入蛋白A珠(ΙΟΟμΙ)(可用蛋白G珠替代或混合蛋白A珠)并且将混合物于 4°C转动1小时。之后将血清样品/珠混合物旋转沉降并且转移至新的印pendorf管中，向其加入 500 μ 1的IxPBS和80 μ 1的偶联至琼脂糖珠的PARlrp2抗体(来自于PBS的1 2贮液， 40 μ 1包装的+40 μ 1 PBS)并且之后于4°C进一步转动2小时。加入珠一小时后，从患者采集另外的血清样品并且重复上文的程序。之后将样品旋转沉降。之后用800 μ 1 的 50mM Tris, 150mM NaCl (pH 7. 4)清洗抗体结合珠。之后通过向珠加入50 μ 1的0. IM甘氨酸pH 2并将其在冰上孵育10分钟并且之后旋转来完成免疫沉淀的蛋白的洗脱。将洗脱液转移至含有TrisdOy 1，pH 8，以获得中和pH)的新的印pendorf管中。最后，将20 μ 1未还原的样品缓冲液煮沸5分钟。所得的样品贮存于-20°C。使用抗PARlrp2的生物素化的抗体的蛋白质印迹分析首先通过加入样品于TTBS中的3% BSA并且于RT振荡1小时进行封闭。向样品加入于TTBS中的3%85六中的抗？六1 1印2(所述“第一抗体”)(1 4000)，2.5yg(微克)抗体。将混合物于RT振荡10分钟并且于4°C孵育过夜。过夜孵育后，将样品再次振荡15分钟。之后以TTBS 8x5分钟清洗样品。向样品加入于TTBS中的3% BSA中的第二抗体，链霉亲和素-HRP(Jackson，USA 2 μ g)并且于RT振荡30分钟。以TTBS 8x5分钟清洗样品。使用ECL(Pierce)试剂检测样品。10% -18%的凝胶的制备凝胶包括两种凝胶，以下列方式组成的下部(电泳)凝胶4ml 18%聚丙烯酰胺凝胶的下部电泳凝胶，之后是顶部的另外4ml的10%聚丙烯酰胺凝胶。通过加入过硫酸铵 (10% APS)和Temed使凝胶固化。将所述电泳凝胶固化后倒入上层的3. 5ml的上部凝胶。实施例1-多克降抗体与PARI释放肽的结合作为最初的可行性测试，使用蛋白质印迹分析检测针对PARlrp2产生的多克隆抗体与PARI释放肽的结合。图IA和IB显示不同量的合成肽PARlrp2 (6Ka大小)的结合，而图2显示多克隆抗体与短的合成肽(PARlrp2 ；6Ka)以及完整肽即PARI释放肽( 35kDa 大小)的结合。实施例2-使用多克降PARlrp2抗体的癌状杰的检测如上文描述的将PARlrp2抗体固定在琼脂糖珠上。将偶联抗体的珠与从健康人或从被诊断患有乳腺癌的患者获得的血清样品接触。之后用由0. IM Tris pH8. 0中和的甘氨酸缓冲液(pH2. 0)将每个测试的样品从珠洗脱。向洗脱的材料加入样品缓冲液，煮沸并在SDS-PAGE胶上分离。将胶(如上文所描述的)在滤膜上印迹并且与抗PARlrp2反应以便检测。印迹后用考马斯蓝将胶染色。检测了总共22名之前被诊断为患有乳腺癌的个体和24个被证实未患癌的(健康的)受试者的个体。使用本文所公开的检测方法，发现22名患者在他们的血清中携带被针对PARlrp2产生的多克隆抗体识别的癌标志物。健康受试者中没有人被发现携带这一标志物。此外，对某些随机挑选的但是有代表性的所测试的样品进行蛋白质印迹分析并且将结果示于图3A-3B。特别地，在来自健康受试者的样品中没有检测到标志物的存在(图 3A)。这通过将来自健康受试者的血清样品与合成的肽PARlrp2混合来证实。另一方面，清楚地测定了来自患癌患者的血清样品中的标志物的存在(图3B)。实施例3-治疗效力的评估本文公开的一个方面涉及针对衍生自PARI释放肽的肽产生的多克隆抗体用于监测对患癌受试者的抗癌治疗的效果的用途。已经表明在癌血清患者中检测的PARI释放肽可作为患者对所给予的抗癌治疗的响应的可靠的指示器。在下列实施例中，从两个IV期的癌患者采集血液(在两个时间点)，第一时间点在给予抗癌治疗之前以获得第一血清样品，而第二时间点在用环磷酰胺-甲氨喋呤-5FFU的混合物治疗8个月之后，其他的患者接受激素治疗。以获得第二血清样品。测定PARlrp2 多克隆抗体与第一以及第二血清样品中标志物的结合的水平。作为对照，在每个时间点使用来自健康受试者的两个血清样品，将第一对照仅与多克隆抗体接触(以证实来自健康受试者的血清中标志物不存在)，而将第二对照与多克隆抗体和肽PARlrp2的混合物接触(作为事实上在来自健康受试者的血清中没有标志物存在而只有通过肽的外部加入结合才会发生的证据)。结果示于图4A-4C中。特别地，图4A显示来自治疗前的癌患者的血清样品含有标志物(图4A)，而治疗之后标志物的水平显著下降(图4B)。对于来自健康受试者的血清样品(对照，图4C)来说，仅在引入合成肽时检测到结合。应当注意的是，结果与包括CT扫描和标志物CEA15-3水平在内的测定治疗效力的常规方法相关联。因此，本文公开的方法也可用于一定时间间隔的个体受试者随访，一种疾病发展报告方式。为了这一目的，一旦受试者被诊断患有癌，可测量标志物的水平并且这一水平可被用作受试者的癌状态的任何随访分析的参考点。为了证实使用根据本发明的方法不会由于例如存在炎症或外伤的结果而产生错误的结果，测定了外伤情况下受试者中PARI释放肽的水平。假设在外伤患者中，即使在受伤后肽的水平升高，一旦外伤改善它也将降低。对炎症做同样的假设。为了证明这一假设，在外伤当天采集来自外伤患者的第一血液样品(例如在手术或受伤之后)并且使用针对 PARlrp2产生的多克隆抗体测定血清中的PARI释放肽的水平。治疗外伤后几天，从相同的患者采集第二血液样品。图5A-5C显示来自癌患者(“C”，图5A)、来自1天的外伤患者 (“T”，图5B)、来自腹部外伤后3天的相同的外伤患者(“3D”，图5B)和之后在另外3天的时间段之后(损伤后总共6天，“6D”，图5B)的血液样品中的标志物的水平.使用带有或不带有合成肽的来自健康受试者的血液样品中标志物的水平(“H”、“+H”，图5C)作为对照。结果显示，尽管在损伤当天观察到高水平的PaRl释放肽(与癌患者中的水平相似)，但损伤后3天甚至损伤后6天，标志物的水平显著降低。不希望受到理论的束缚，预期患有炎症病况的患者将表现出相似的肽水平概况，即，在炎症状态期间，水平是高的，然而，一旦当炎症被治疗或缓解，肽的水平将显著降低。实施例4-测定疾病期本文公开的另一方面涉及测定诊断患有癌的受试者中癌的期。已发现，在所有癌的期中检测的标记物和标记物的水平可被用于概述癌的期。特别地，图6显示在所有的癌的期中检测标志物并且标志物处于不同水平。这可允许早期检测癌(甚至在I或II期) 以及概述每个期并且根据其攻击性或潜在的攻击性表征期。为了这一目的，应当注意的是每个期的结合的水平可根据所述期的攻击性而变化。因此，例如处于疾病的I和/或II期的高水平的标志物(即统计学上显著高于预定的阈值/参考点)可指示攻击性的癌。已经以示例说明的方式描述了本发明，而且应当理解的是已经使用的术语意图为具有描述性而不是限制性的词的性质。明显地，按照上文的教导，本发明的许多修饰和变化是可能的。因此，应当理解的是在所附的权利要求的范围内，本发明可以下文特别描述的方式之外的方式来实施。就此而论，应注意的是如在上文的描述和下列权利要求中所使用的，除非上下文清楚地另有指明，形式“一(a)’、“一(an)’和“该(the) ”包括单数以及复数的提及物。例如，术语“抗体”包括一种或多种抗体。此外，如本文所用的，术语“包括”意指方法或试剂包包括所引用的元素但不排除
其他元素。相似地，“主要由......组成”被用来限定包括所引用的元素但排除可能对本文
公开的方法的表现具有重要意义的其他元素的方法或试剂包。“由......组成”应当意指
16排除超出痕量元素的其他元素。由这些过渡术语中的任一个限定的实施方案在本发明的范围内。此外，所有数值，例如剂量的浓度或其范围，是近似值，其与所陈述的值⑴或㈠相差多达20%，有时多达10%。应当理解的是，即使没有一直明确陈述，但所有的数值前都有术语“约”。还应理解的是，即使没有一直明确陈述，但本文描述的元素仅仅示例性的并且这些元素的等同物是本领域已知的。
权利要求
1. 一种测定受试者中癌状态的方法，所述方法包括测定针对蛋白酶活化受体I(PARl) 释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合，其中所述抗体与所述标志物的结合指示癌状态。
2. 一种测定受试者中癌状态的严重度的方法，包括测定针对PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合水平，并且将所述结合水平与使抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平相比较。
3. 一种测定使用抗癌剂的受试者的治疗性治疗对受试者的效力的方法，包括测定针对 PARI释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与在两个或更多个连续的时间点从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合水平，一个或多个时间点在所述治疗性治疗期间，其中水平上的差异指示治疗性治疗的效力。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述PARI释放肽包含SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述PARI释放肽由SEQID N0:1所示的氨基酸序列组成。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中当将所述片段和所述PARI释放肽进行最佳比对时，PARI释放肽的所述片段包含相应于所述PARI释放肽中连续氨基酸残基的至少5个连续氨基酸残基。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述至少5个连续氨基酸残基与PARI释放肽的5个连续氨基酸残基相同。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述片段包含所述PARI释放肽中的一个或多个氨基酸残基的保守修饰，所述修饰选自氨基酸的插入、氨基酸的缺失、氨基酸的取代、氨基酸的化学修饰。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述修饰包括使用选自天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或拟肽残基的不同的氨基酸残基的插入或取代。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述片段包括SEQIDNO :2、SEQ ID NO: 3所示的序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述片段包括SEQID NO :3所示的序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述标志物是含有氨基酸的分子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述标志物包括蛋白、肽或多肽或其组合。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述标志物包括PARI释放肽或所述PARI释放肽与所述液体样品中存在的至少一种其他组分的复合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述其他组分是所述液体样品中存在的蛋白、多肽或肽。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述抗体是针对具有SEQID NO :3所示序列的肽而产生的多克隆抗体。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述液体样品选自由全血、血浆、血清、羊水、脑髓液、腹水和尿组成的组。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述样品包括血液或血液组分。
20.如权利要求2至19中任一项所述的方法，其中所述抗体与所述标志物结合的水平的测定包括所述水平的定量测量、所述水平的定性测量或其组合。
21.如权利要求2至20中任一项所述的方法，其中所述之前测定的标准是通过测量所述抗体与从统计学上显著组的具有已确定的癌严重度的癌患者获得的液体样品中的标志物结合的水平或通过测量所述抗体与在之前的参考时间点从受试者获得的液体样品中的标志物结合的水平来测定的。
22.如权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述结合的水平与所述之前测定的标准的水平的所述比较包括定量比较、定性比较或其组合。
23.如权利要求3至22中任一项所述的方法，其中在所述治疗性治疗开始前的时间点采集至少一个第一液体样品并在治疗期间的时间点采集至少一个连续的样品，其中与对所述第一液体样品所测定的结合水平相比在所述至少一个连续样品中表现出的结合水平的减少指示治疗是有效的。
24.如权利要求3至22中任一项所述的方法，其中在所述治疗性治疗期间的时间点采集至少一个第一液体样品并在第一样品的时间点之后的治疗性治疗期间的时间点采集至少一个连续的液体样品，使得与第一样品中的水平相比在所述连续样品中结合的水平的减少指示治疗是有效的。
25.如权利要求3至22中任一项所述的方法，其中在所述治疗性治疗期间的时间点采集至少一个第一液体样品并在治疗已经被中断之后的时间点采集至少一个连续的液体样品，其中与一个或多个第一样品相比在一个或多个第二样品中结合水平的增加指示治疗是有效的。
26.一种测定针对蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽或其片段产生的抗体与从受试者获得的液体样品中的标志物的结合的试剂包，包括(i)针对蛋白酶活化受体I(PARl)释放肽或其片段而产生的并且能够结合所述液体样品中可能存在的所述标志物的至少一种抗体；( )关于所述至少一种抗体用于测定下列中的一个或多个的使用说明书-所述抗体与所述标志物的结合；-所述抗体与所述标志物结合的水平；-所述抗体与所述标志物结合的水平与使抗体与PARI释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平之间的差异；-至少一种抗体与来自相同的受试者的两个或更多个连续液体样品中的所述标志物结合的水平上的差异。
27.如权利要求27所述的诊断试剂包，包括能够与所述标志物结合的一种或多种另外的抗体。
28.如权利要求26或27所述的诊断试剂包，其中一种或多种另外的抗体针对与PARI 释放肽或其片段复合的标志物的一种其他组分。
全文摘要
本发明基于如下发现如果受试者患有癌，那么针对抗PAR1释放肽的片段产生的抗体可被用于检测来自所述受试者的体液样品中与癌状态有关的标志物。因此本发明提供了进行下列中的一个或多个的方法和试剂包测定受试者的癌状态，所述方法包括测定针对蛋白酶活化受体1(PAR1)释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合，其中所述抗体与所述标志物的结合指示癌状态；测定受试者中癌状态的严重度，包括测定针对PAR1释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合水平，并且将所述结合水平与使抗体与PAR1释放肽结合的水平与癌状态的严重度相关联的之前测定的标准的水平相比较；以及测定使用抗癌剂的受试者的治疗性治疗对受试者的效力，包括测定针对PAR1释放肽或衍生自其的片段产生的抗体与在两个或更多个连续的时间点从所述受试者获得的液体样品中的标志物的结合水平，一个或多个时间点在治疗性治疗期间，其中水平上的差异指示治疗性治疗的效力。
文档编号G01N33/574GK101999077SQ200980107445
公开日2011年3月30日申请日期2009年2月5日优先权日2008年2月7日
发明者R·巴-萨维特申请人:哈达斯特医学服务与开发有限公司