专利名称：G-quadruplex检测方法、形成G-quadruplex的DNA的检测方法以及端粒酶活性测定方法
技术领域：
本发明涉及DNA的高级结构的检测方法以及利用该方法的诊断方法。
背景技术：
端粒是位于真核生物的染色体的两末端部分的由DNA和各种各样的蛋白质形成 的结构。根据迄今为止的研究，已知该端粒结构保护染色体不受某种DNA分解酶和不适当 的DNA修复等。另外，由于该端粒部分在每次细胞分裂后变短，所以认为其在称之为细胞老 化和永生化的现象中发挥重要作用。另一方面，如果从结构方面看，已知端粒具有几个特征。即，在大部分染色体DNA 中，在互补的双链DNA链之间，腺嘌呤(以下称为A)碱基和胸腺嘧啶(以下称为T)碱基、 鸟嘌呤(以下称为G)碱基和胞嘧啶(以下称为C)碱基分别形成特异的氢键从而形成 Watson-Crick型碱基对，并且通过在该碱基对之间产生的π - ji叠加相互作用而构建双螺 旋结构(图1)。但是，在端粒DNA中，虽然其大部分也由互补的双链DNA形成，但是，其最末端部分 DNA的3'末端突出(overhang 悬端)而形成单链状态。该悬端部分的长度和端粒的全长 根据物种而不同，人类的悬端部分为50 100个碱基左右，全长在初期阶段约为10000个 碱基对左右。而且，端粒序列的另一个结构特征为，悬端一侧的链由富含G的重复序列构 成，因此，作为其互补链的另一侧的链是富含C的重复序列。具体而言，人类的悬端一侧的链为5' -TTAGGG-3'(序列序号1)的重复序列 (富G序列)，另一侧为5' -CCCTAA-3'(序列序号1的反义链)的重复序列(富C序 列)。近年来，端粒部位中的富G序列得到特别热衷的研究。这是由于日益明确该序列 能够形成称为G-quadruplex的四链DNA结构。G-quadruplex (鸟嘌呤四链结构)中，已知 有四条DNA链全部为5'到3'方向的走向相同的平行型，或者两条走向相同而其余的两条 走向相反的反平行型等多种样式，但是每种样式都具有如图2所示的特征。S卩，四个G碱基 通过Hoogsteen型氢键形成称为G四联体(G-Quartet)的结构，并且该G四联体面之间通 过JI-JI叠加相互作用而保持该结构。另外，在形成G-quadruplex的结构时，在G四联体面和G四联体面之间需要金属 离子的配位，已知K离子和Na离子等进行配位。目前，这样的G-quadruplex在端粒内在什 么样的条件下形成，以及行使什么样的机能的详细内容仍不清楚。但是，认为其可能是与上 述的染色体保护和细胞老化等相关联的重要结构。另外，还日益明确如上所述的富G序列不仅存在于端粒中。例如，作为原癌基因的 c-myc中也存在形成G-quadruplex的富G序列。另外，除此以外，在c_kit、bcl_2、VEGF、 H-ras、N-ras基因的启动子区域中也发现有形成G-quadruplex的富G序列。这些都是与 细胞的癌化等相关联的基因，由此暗示G-quadruplex行使对人体重要的机能。因此，目前预测还存在超过30万个能够形成G-quadruplex的富G序列(以下，将这样的序列称为 Quadruplex预测序列)，它们在实际中是否形成G-quadruplex，若能形成，则这样的结构行 使什么样的机能备受瞩目。在这样的技术背景中，最重要的技术之一是特异性检测G-quadruplex的方法。 即，需要一种研究试样中的DNA是否含有G-quadruplex、或者试样中的由Quadruplex预测 序列构成的DNA在实际中能否形成G-quadruplex的技术。例如，如果对前者使用现有技 术进行研究，则如下所示。即，准备含有目的DNA的试样溶液，测定该溶液的CD (Circular Dichroism 圆二色性)谱。接着，根据所得到的⑶谱分析是否存在G-quadruplex特有的 谱。但是，测定CD谱的装置非常昂贵并且大型。而且，分析时间也需要长达30分钟左右的 时间，并且一次能够分析的试样数量也通常为一种，因此在高通量性的方面很差。另外，使 用CD还存在无法根据四链的形状而从DNA的其它形状中识别的问题。作为解决该问题的方法，如图3所示，可以列举在上述溶液中混合探针材料、检测 该溶液中的信号的方法，该探针材料根据G-quadruplex的有无而发出能够以廉价的装置 分析的信号(吸光度、荧光强度等)。此时，重要的一点为该探针对G-quadruplex的特异 性。即，由于在基因组DNA中存在占大部分的双链DNA结构和以上述的端粒部位的悬端部 分为代表的单链DNA结构，因此，与这些结构比较时对G-quadruplex的特异性是很重要的。 因此，尽管希望单独研究G-quadruplex的有无，但探针对G-quadruplex的特异性低，结果 探针也与单链DNA或双链DNA相互作用而产生信号，则正确检测溶液中的G-quadruplex变 得困难。另外，当使用现有技术研究试样中的Quadruplex预测序列DNA在实际中能否形成 G-quadruplex时，如图4所示。即，首先在溶液中准备具有Quadruplex预测序列的DNA。 之后，将该溶液置于形成G-quadruplex的反应条件下，使G-quadruplex形成反应进行。接 着，可以通过进行CD谱测定对反应后的溶液中是否存在G-quadruplex进行分析。但是，此 时也产生如上所述的装置昂贵、大型的问题以及高通量方面的问题。因此，此时如果也有如 图3所示的G-quadruplex检测用探针则非常有用。具体而言，如图5所示，将该探针混合在上述G-quadruplex形成反应后的溶液中， 测定由此发出的信号即可。此时，G-quadruplex形成反应前的Quadruplex预测序列DNA， 如上所述，由于也存在单链或双链DNA的可能性，因此探针对G-quadruplex的特异性极为 重要。即，如果在上述G-quadruplex形成反应后，Quadruplex预测序列DNA没有全部形 成G-quadruplex时，或只有一部分形成时，上述探针也与Quadruplex预测序列DNA原本 的结构(单链或双链DNA)相互作用从而产生信号，则正确检测所形成的G-quadruplex变 得困难。反之，当探针对G-quadruplex的特异性极高时，在图5所示的方法中，就可以从 G-quadruplex形成反应前事先在溶液中混合探针，也能够防止操作的繁琐性。如上所述，形成G-quadruplex的富G序列发现存在于染色体中与癌化和老化等 相关的部位，因而预测将来能够通过研究患者的染色体中的G-quadruplex而进行疾病诊 断。因此，可以说开发一种能够特异性检测G-quadruplex的方法是非常重要的课题。另外， 作为上述探针的特性，如果其不仅能够特异性检测G-quadruplex和Quadruplex预测序列 DNA,而且能够根据它们的存在量而产生信号增大或者减小的变化，则不仅能够仅仅进行检 测，而且还能够定量进行分析，从而当然会更有用。
另外，已知有称为端粒酶的酶。该酶是由RNA和逆转录酶等形成的复合体，能够复 制由于细胞分裂而变短的端粒部位的富G侧的重复序列而延长(S卩，在人类的情况下，端粒 酶添加5' -TTAGGG-3'序列(序列序号1)，以下，将该添加反应称为端粒酶反应)。已知 该酶在人类通常的体细胞中没有发现，但是在生殖细胞和大部分癌细胞中大量表达，因此 能够将端粒酶活性作为指标而研究被检测者的细胞是否癌化。作为现有的方法，已知有称为TRAP分析的方法。使用图6对TRAP分析进行说明。 在TRAP分析中，首先配制含有作为端粒酶的模板的合成单链DNA的溶液。该单链DNA通常 为由5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘(序列序号2)的序列形成的DNA，称为TS引物(因 此，端粒酶在该TS引物的3'末端添加5' -TTAGGG-3'序列(序列序号1)。参照非专利 文献3)。但是，不需要将TS引物限定于该序列，只要是成为端粒酶的模板的单链DNA即可。接着，在该溶液中添加由疑似癌化的细胞试样或组织试样的提取物并混合，置于 进行端粒酶反应的条件下。此时，如果这些试样发生癌化，则具有端粒酶活性，因此能够以 TS引物为起点引起端粒酶反应。另一方面，如果没有发生癌化，则不能引起端粒酶反应。所 以，最后通过PCR将利用端粒酶反应延长的DNA进行扩增，通过电泳法检测该经过扩增的 DNA片段。由于利用端粒酶反应得到的DNA的长度各种各样，因此得到的电泳图如图7所示。 即，当使用的试样的端粒酶活性强时，所得到的DNA片段的长度呈现从短到长的广范围的 梯子(ladder)状的条带，并且条带的浓度较浓。另一方面，由活性弱的端粒酶无法得到长 的DNA片段，所以在短的范围里出现梯子状的条带，并且条带的浓度较淡。因此，为了判断 试样的癌化，可以对由TRAP分析的结果得到的电泳图中的DNA片段的长度范围和条带的浓 度进行分析，但是，由于难以将其进行定量分析，所以只能是定性地判断。关于这点，当图3和图5中说明的G-quadruplex特异性检测用探针不仅仅对 G-quadruplex具有特异性，而且还根据G-quadruplex的存在量而改变其信号量时，则在以 端粒酶的活性作为指标的癌诊断中也是有用的。其流程图如图8所示。在该方法中，也首先制备含有TS引物的溶液，接着，在该溶液中添加细胞试样或 组织试样的提取物并混合，这样，在该溶液中使端粒酶反应进行之后，通过PCR法使由端粒 酶反应而延长的DNA扩增，以上为止的操作与图6相同。但是，在图8所示的方法中，对该 PCR之后的溶液不进行电泳，而进行与图5的情况相同的G-quadruplex形成反应。使用 G-quadruplex检测用探针检测所形成的G-quadruplex。这里，由于所形成的G-quadruplex 的量反映端粒酶活性的强度，所以如果上述探针的信号量根据G-quadruplex的量而改变， 则能够通过该方法进行定量的端粒酶活性分析及癌化的判断。不言而喻，此时，探针对G-quadruplex的特异性极为重要。即，当细胞试样没有癌 化时，端粒酶反应不进行，其结果是作为单链DNA的TS引物原样残留在反应液中。而且，之 后的PCR反应也也不进行，因此，PCR反应用的引物也以单链DNA的状态残留。因此，当细 胞试样没有癌化时，最终的反应溶液中存在大量的单链DNA，若上述探针与这些单链DNA反 应而发出信号，则难以进行定量的端粒酶活性分析和癌诊断。以上，在如所说明的那样在溶液中存在单链、双链DNA的任一种的状况下，能够特 异性检测G-quadruplex的方法是非常有用的。而且，如果进一步具备定量性的话，则不仅 可以定量检测G-quadruplex，还能够解决现有的TRAP分析的问题。因此，力求开发一种使用探针的G-quadruplex检测方法，该探针与G-quadruplex特异性地相互作用，并且根据 G-quadruplex的量而使信号变化。例如，专利文献1中提出了一种G-quadruplex特异性的新型化合物。但是，尽管 相比于单链、双链DNA，该探针确实与对G-quadruplex的结合选择性高，但是能确认也与单 链、双链DNA结合。另外，非专利文献1中报告了由下述(化学式1)的结构形成的阳离子性卟啉对 G-quadruplex的特异性。该文献中利用SPR(surfaceplasmon resonance 表面等离子共 振)现象分析金基板上的上述卟啉与双链结构DNA或G-quadruplex的结合，其结果，尽管 G-quadruplex确实比双链DNA的信号变化大，但是在双链DNA的情况下也观察到信号的变 化，不能确认充分的特异性。(化学式1) 另外，非专利文献2中报告了由下述(化学式2)和(化学式3)的结构形成的阳 离子性卟啉等对G-quadruplex的特异性。该文献中，同样通过分析SI3R现象和紫外可见吸 收光谱，研究这些卟啉对G-quadruplex的特异性结合，但是，记载了在DNA浓度为5 μ M以 上的条件下，出现双链DNA与这些卟啉的非特异性结合。(化学式2) (化学式3) 如上所述，目前为止以检测G-quadruplex为目的而开发出来的探针都是阳离子性的物质。这是由于G-quadruplex是阴离子性的，从使其能与G-quadruplex结合的观点 考虑时，认为阳离子性非常有利(即，认为若为阴离子性则引起静电排斥，不利于结合)。由 于全部DNA链都是阴离子性的，而不仅仅限于G-quadruplex，所以将它们作为目标而开发 探针时，使其为阳离子性为最重要的设计指南，而不考虑阴离子性。专利文献1 国际公开第2004/072027号小册子非专利文献1 :J. Am. Chem. Soc.，129，1502-1503非专利文献2 =Chem. Commun. 4685-4687非专利文献3 =Nucleic Acids Res.，25，2595-259
发明内容
如上所述，当在溶液中存在单链、双链DNA的任一种的状况下，能够特异性检 测G-quadruplex的方法是非常有用的。而且，如果进一步具备定量性的话，则不仅可以 定量检测G-quadruplex，还能够解决现有的TRAP分析的问题。因此，力求开发一种使用 探针的G-quadruplex检测方法，该探针与G-quadruplex特异性地相互作用，并且根据 G-quadruplex的量而使信号变化，但是，目前为止提出的方法不能在任意情况下特异性地 检测G-quadruplex。因此，本发明的发明人进行了深入的研究，结果发现，阴离子性的平面 型酞菁虽然是阴离子性的，但是具有与G-quadruplex的极高的特异性而相互作用，并且吸 光度根据G-quadruplex的浓度而变化，从而完成了本发明。解决上述问题的本发明提供一种G-quadruplex检测方法，检测试样溶液中的 G-quadruplex，其中，该试样溶液含有形成单链结构、双链结构和G-quadruplex中的至少 任一种以上的结构的DNA，其特征在于，上述方法依次包括以下工序(a)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)将含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液与上述试样溶液混合的工序；(c)测定上述(b)工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；和(d)如果在上述640 740nm出现最大吸收峰，则判定上述试样溶液中含有形成 G-quadruplex结构的DNA的工序。另外，本发明还提供一种形成G-quadruplex的DNA的检测方法，通过研究试 样溶液中含有的形成单链结构和双链结构中的至少一种以上的结构的DNA是否形成 G-quadruplex，检测形成G-quadruplex的DNA，其特征在于，上述方法依次包括以下工序
CN 101889210 A
说明 书5/22页
αφ
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(a)将上述试样溶液置于G-quadruplex形成反应条件下的工序；(b)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(c)在上述(a)工序之前或之后，将含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液与上述 试样溶液混合的工序；(d)测定上述(a) (c)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的 工序；和(e)如果在上述640 740nm出现最大吸收峰，则判定上述试样溶液中含有形成 G-quadruplex结构的DNA的工序。另外，本发明提供一种端粒酶活性测定方法，测定试样溶液中的端粒酶活性，其特 征在于，上述方法依次包括以下工序(a)制备上述试样溶液的工序；(b)制备底物溶液的工序，该底物溶液含有作为端粒酶底物的DNA ；(c)混合上述试样溶液和上述底物溶液，制备端粒酶反应溶液的工序；(d)将上述端粒酶反应溶液置于由端粒酶进行的DNA添加反应的条件下；(e)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(f)将含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液与上述(d)工序后得到的溶液混合的
工序；(g)测定上述(a) (f)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的 工序；和(h)如果在上述640 740nm出现最大吸收峰，则判定上述试样溶液中含有形成 G-quadruplex结构的DNA的工序。本发明中，上述阴离子性平面型酞菁，优选选自作为配位金属与铜络合形成的物 质、与锌络合形成的物质、与钴络合形成的物质和具有镍的阴离子性平面型酞菁，或者与没 有配位金属的阴离子性平面型酞菁络合形成的物质、没有形成络合的物质中的任一种。另外，本发明中，优选上述阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、磺 基以及磺基的金属盐中的至少一种官能团。本发明的上述目的、其它目的、特征以及优点，参照附图，根据以下优选的实施方 式的详细说明即可明确。发明的效果根据本发明，可以提供特异性且定量检测G-quadruplex的方法、特异性且定量检 测能够形成G-quadruplex的DNA的方法、以及端粒酶活性测定方法。


图1是用于说明双链DNA的结构的图。图2是用于说明G-quadruplex的结构的图。图3是用于说明使用对形成G-quadruplex的DNA具有特异性的探针特异性检测 形成G-quadruplex的DNA的方法的图。图4是用于说明使用⑶分析装置检测Quadruplex预测序列的方法的图。图5是用于说明使用对形成G-quadrup 1 ex的DNA具有特异性的探针检测Quadruplex预测序列的方法的图。图6是用于说明现有的端粒酶活性测定方法的图。图7是表示由现有的端粒酶活性测定方法得到的电泳图像的一个例子的图。图8是用于说明使用对形成G-quadruplex的DNA具有特异性的探针检测端粒酶 活性的方法的图。图9是用于说明使用阴离子性酞菁特异性检测形成G-quadruplex的DNA的方法 的图。图10是用于说明使用阴离子性酞菁检测Quadruplex预测序列的方法的图。图11是用于说明使用阴离子性酞菁测定端粒酶活性的方法的图。图12是表示实施例2中的⑶检测结果的图。图13是表示实施例2中使用阴离子性酞菁铜时的结果的图。图14是表示实施例2中使用阴离子性酞菁镍时的结果的图。图15是表示实施例2中使用不具有配位金属的阴离子性酞菁时的结果的图。图16是表示实施例2中使用阴离子性酞菁铁时的结果的图。图17是表示实施例1中的⑶检测结果的图。图18是表示实施例1中使用阴离子性酞菁铜时的结果的图。图19是表示实施例1中使用阴离子性酞菁镍时的结果的图。图20是表示实施例1中使用不具有配位金属的阴离子性酞菁时的结果的图。图21是表示实施例1中使用阴离子性酞菁铁时的结果的图。图22是表示实施例3中使用阴离子性酞菁铜时的结果的图。图23是表示实施例3中使用阴离子性酞菁镍时的结果的图。图24是表示实施例3中使用不具有配位金属的阴离子性酞菁时的结果的图。图25是表示实施例4中使用阴离子性酞菁铜时的结果的图。图26是表示实施例4中使用阴离子性酞菁镍时的结果的图。图27是表示实施例4中使用不具有配位金属的阴离子性酞菁时的结果的图。图28是表示实施例4中使用阴离子性酞菁铁时的结果的图。图29是总结本实施例1 4的结果的图。图30是表示酞菁会聚状态时和分散状态时的典型吸光谱的图。图31是表示本发明的机制的图。图32是表示平面型酞菁和羽毛球型酞菁的图。图33是表示实施例1中使用阴离子性酞菁钴时的结果的图。图34是表示实施例2中使用阴离子性酞菁钴时的结果的图。图35是表示实施例3中使用阴离子性酞菁钴时的结果的图。图36是表示实施例4中使用阴离子性酞菁钴时的结果的图。符号说明1具有互补关系的二条DNA链2T-A 碱基对3C-G 碱基对4G-quadruplex
5G四联体面
6金属离子
7G四联体面的化学结构
8容器
9G-quadruplex 以外的 DNA 链
10与G-quadruplex结合的探针
11游离的探针
12Quadruplex预测序列
13TS引物
14延长的TS引物
15PCR用引物
16试样溶液
17含有阴离子性酞菁的溶液
18含有作为端粒酶底物的单链DNA的溶液，整理序号2040300046日本特愿
2008-137574 (Proof)申请日平成 20 年 5 月 27 日 27/E19会聚的阴离子性酞菁20单体状态的酞菁21嵌入G-quadruplex的阴离子性酞菁22平面型酞菁23羽毛球型酞菁
具体实施例方式以下，使用图9 图11说明本发明的实施方式。(实施方式1)使用图9说明本实施方式1中检测试样溶液中的G-quadruplex的方法，其中，该 试样溶液含有形成单链结构、双链结构和G-quadruplex中的至少一种以上的结构的DNA。本实施方式1中，首先混合试样溶液与含有阴离子性平面型酞菁的溶液。接着测 定该混合溶液在640 740nm的范围内的特定波长的吸光度。此时，如果上述试料溶液中存 在形成G-quadruplex的DNA，则在640 740nm的范围内出现依赖于该形成G-quadruplex 的DNA的吸收峰，而另一方面，即使存在单链结构、双链结构的DNA，在上述波长范围内也不 出现依赖于该单链结构、双链结构的DNA的峰。因此，通过分析该峰的有无，能够得知上述 试样溶液中是否存在形成G-quadruplex的DNA。在分析峰的有无时，例如，配制已知至少不含形成G-quadruplex的DNA的参照溶 液，与含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液混合，对其也测定混合时在上述特定波长的吸 光度，求出其与使用试样溶液时得到的吸光度值的差即可。另外，该上述吸收峰的吸光度值随着形成G-quadruplex的DNA浓度增高而增大。 因此，通过分析吸光度，能够分析形成G-quadruplex的DNA浓度。实施方式1中所使用的阴离子性平面型酞菁选自具有铜、锌、钴或镍作为配位金 属的阴离子性平面型酞菁、或者没有配位金属的阴离子性平面型酞菁。
另外，实施方式1中所使用的阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、 磺基以及磺基的金属盐中的至少一种官能团。另外，上述特定的波长只要在640 740nm的范围内，则可以是任意波长，但是呈 现峰的极大值的波长附近的波长能够进行高敏感度的测定，故而更加优选。(实施方式2)使用图10说明本实施方式2中研究试样溶液中含有的形成单链结构或双链结构 中的至少任一种以上的结构的DNA是否形成G-quadruplex的方法。本实施方式2中，首先混合上述试样溶液与含有阴离子性平面型酞菁的溶液，将 其置于形成G-quadruplex的条件下从而使G-quadruplex形成反应进行之后，测定该混合 溶液在640 740nm的范围内的特定波长的吸光度(图10 (A))，或者将上述试样溶液置于 形成G-quadruplex的条件下从而使G-quadruplex形成反应进行之后，与含有阴离子性平 面型酞菁的溶液混合，测定该混合溶液在640 740nm的范围内的特定波长的吸光度(图 10 (B))。此时，和上述实施方式1同样，如果该混合溶液中存在形成G-quadruplex的DNA， 则在640 740nm的范围内出现依赖于该形成G-quadruplex的DNA的吸收峰，并且该吸收 峰的吸光度值随着形成G-quadruplex的DNA浓度增高而增大。而另一方面，即使存在单链结构、双链结构的DNA，在上述波长范围内也不出现依 赖于该单链结构、双链结构的DNA的峰。因此，通过分析该峰的有无，能够得知上述试样溶 液中的DNA是否形成了 G-quadruplex。作为分析峰的有无的方法，例如，制备不含DNA、或 者即使含有DNA，也只含有不形成G-quadruplex的DNA的参照溶液，对该参照溶液也经过与 上述试样溶液的情况完全相同的工序测定吸光度值，分析与上述试样溶液的吸光度值的差 即可。另外，上述吸收峰的吸光度值随着形成G-quadruplex的DNA的浓度增高而增大。 因此，通过分析吸光度，能够对上述试样中形成G-quadruplex的DNA浓度进行定量分析。本实施方式2中所使用的阴离子性平面型酞菁，与实施方式1同样，是选自具有 铜、锌、钴或镍作为配位金属的阴离子性平面型酞菁、或者没有配位金属的阴离子性平面型酞菁。另外，本实施方式2中使用的阴离子性平面型酞菁，与实施方式1同样，具有选自 羧基、羧基的金属盐、磺基以及磺基的金属盐中的至少一种官能团。另外，上述特定的波长只要在640 740nm范围内，则可以是任意波长，但是呈现 峰的极大值的波长附近的波长能够进行高敏感度的测定，故而更加优选。(实施方式3)使用图11说明本实施方式3中定量分析试样中含有的端粒酶活性的方法。本实施方式3中，首先混合上述试样和含有作为端粒酶底物的单链DNA的溶液， 将该混合溶液置于进行端粒酶反应的条件下。此时，如果上述试样中含有具有活性的端粒 酶，则置于该条件下进行端粒酶反应，其结果，从上述底物单链DNA添加由5' -TTAGGG-3' 形成的DNA，而另一方面，如果上述试样溶液中不存在具有活性的端粒酶，则不进行这样的 DNA添加。接着，将上述端粒酶反应后的混合溶液置于形成G-quadruplex的条件下。此时， 如果假设上述试样中含有具有活性的端粒酶，由此进行端粒酶反应，则形成G-quadruplex，其量依赖于上述试样中的端粒酶活性(活性越大则形成的G-quadruplex量越多)。反之， 例如，如果上述试样中不含有具有活性的端粒酶，则其结果为上述端粒酶反应无法进行，从 而此时不形成G-quadruplex。最后，混合该G-quadruplex形成反应后的混合溶液和含有阴离子性平面型酞菁 的溶液，测定该混合溶液在640 740nm的范围内的特定波长的吸光度。此时，与上述实施 方式1和2同样，如果该混合溶液中存在形成G-quadruplex的DNA，则在640 740nm的 范围内出现依赖于该形成G-quadruplex的DNA的吸收峰，并且该吸收峰的吸光度值随着形 成G-quadruplex的DNA浓度增高而增大。而另一方面，即使该混合溶液中存在单链结构、 双链结构的DNA，在该波长范围内也不出现依赖于该单链结构、双链结构的DNA的峰。因此， 通过测定该峰的吸光度值，能够定量地分析上述试样中的端粒酶活性。这里，在图11中，将上述阴离子性平面型酞菁溶液向G-quadruplex形成反应后的 混合溶液中添加，但是添加上述阴离子性平面型酞菁的时机不受此限制。即，也可以在端粒 酶反应后并且直至吸光度测定前的任何时机向含有上述试料溶液的混合溶液中添加。本实施方式3中所使用的阴离子性平面型酞菁，与实施方式1和实施方式2同样， 是选自具有铜、锌、钴或镍作为配位金属的阴离子性平面型酞菁、或者没有配位金属的阴离 子性平面型酞菁。另外，实施方式3中所使用的阴离子性平面型酞菁，与实施方式1和实施方式2同 样，具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基以及磺基的金属盐中的至少一种官能团。另外，上述特定的波长只要在640 740nm范围内，则可以是任意波长，但是呈现 峰的极大值的波长附近的波长能够进行高敏感度的测定，故而更加优选。[实施例]以下记载的实施例中所用的DNA全部是北海道System Science株式会社的 合成品。另外，本实施例中所使用的酞菁中，Copper( II )phthalOCyanine-3，4'，4"， 4' “ -tetrasulfonic acid tetrasodium salt (酞菁铜(II )-3，4'，4〃，4'“-四磺 StH^ik ) > Nickel ( II ) phthalocyanine tetrasulfonicacid tetrasodium salt (酞菁 镍(II )四磺酸四钠盐)和 Iron(III)phthalocyanine-4，4'，4〃，4' “ -tetrasulfonic acid, compound with oxygenmonosodium salt hydrate (駄 善 铁(III ) -4,4 ‘， 4 “ ,4'“-四磺酸，与氧单钠盐水合物的混合物)，由Sigma Aldrich公司购入。 Phthalocyanine tetrasulfonicacid (四石黄 St Fft 胃)禾口 Zinc ( II )phthalocyanine tetrasulfonic acid(四磺酸酞菁锌(II ))由 FUNAK0SHI 购入。Cobalt ( II ) phthalocyaninetetracarboxylic acid(四羧酸酞菁钴(II ))为合成的。合成方法如下所 述。将偏苯三酸6. 4g、尿素20g、氯化钴六水合物4. 75g和钼酸铵四水合物0. 82g在 IOOrnl硝基苯中在170 180°C的油浴中加热4. 5小时，放冷后，以倾析法除去硝基苯层。将 残留物以甲醇和水洗净之后进行真空干燥，得到8. 66g固态物。将该固态物1. Og在50% 氢氧化钾水溶液30g中，在70 75°C下搅拌2小时后，添加90ml的水，搅拌，并将其过滤。 将此时得到的滤液以35 37%盐酸调为强酸性从而析出沉淀物，将其过滤取出。将该沉淀 物在100ml的IN的氢氧化钠水溶液中溶解，再次过滤。将此时得到的滤液再次以盐酸调为 强酸性，过滤取出析出的沉淀物。将其用大量水洗净之后进行真空干燥，由此以0. Ig的粉末得到四羧酸酞菁钴(II )。以下实施例中所使用的四羧酸酞菁钴(II )全部是通过该合 成得到的。(实施例1)本实施例中，尝试使用阴离子性平面型酞菁检测出在溶液中存在的形成反平行型 G-quadruplex的DNA。为此，首先以下述顺序制备含有形成反平行型G-quadruplex的DNA 的溶液。<含有形成反平行型G-quadruplex的DNA的溶液的制备>首先制备含有由5' -gggttagggttagggttaggg-3'的序列(序列号3)形成的单 链DNA的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量100 μ 1)。该序列与人类的端粒部分 的序列相同，因此下文将该DNA称为人类端粒DNA。这里，分别准备该溶液中所含的人类端 粒DNA的浓度为0. 5、2、5、10、25、50、100 μ M的溶液。作为阴性对照，还制备了不含DNA的 50mM HEPESUOOmM NaCl.pH 7 的溶液。接着，将这些溶液在90°C孵育5分钟之后，以2°C /分钟的降温速度冷却至0°C，最 后在0°C孵育2小时(以下，在没有特别指明时，出现“退火”或者“退火处理”的表现时，都 是指这一系列的温度控制)。接着，为了确认上述结果得到的各溶液中的人类端粒DNA形成反平行型 G-quadruplex，对各溶液进行CD分析。其结果，如图17所示，除了阴性对照溶液，每种情况 都在295nm附近确认正峰，在265nm附近确认负峰。这显示形成有反平行型G-quadruplex。另外，人类端粒DNA浓度为100 μ M的溶液中的上述正峰和负峰的绝对值最大，其 它的按照50、25、10、5、2、0. 5 μ M的顺序变小。这显示，若最初含有的人类端粒DNA浓度高， 则所得到的形成反平行型G-quadruplex DNA浓度也高。下面，分别对人类端粒DNA浓度为100、50、25、10、5、2、0. 5 μ M的溶液进行上述一 系列的退火处理，将结果得到的溶液分别称为Anti-G-quadruplex溶液A、B、C、D、Ε、F、G。 另一方面，对作为阴性对照制备的不含DNA的溶液进行上述一系列退火处理，将结果得到 的溶液称为NC溶液。接着，使用由以上工序得到的Anti-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F、G和NC溶 液，由阴离子性平面型酞菁进行反平行型G-quadruplex检测实验。实验方法如下所述。<利用阴离子性酞菁铜的检测>首先制备含有15μΜ的酞菁铜(II )-3，4' Λ" Λ' “ _四磺酸四钠盐(具有铜 作为配位金属、且具有磺酸基的钠盐作为官能团的阴离子性平面型酞菁)的50mM HEPES、 IOOmM NaCl、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-G-quadruplex 溶液C、D、E、F和NC溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图18(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外，可知该峰以Anti-G-quadruplex溶液C > D > E > F的顺序 增大。根据以上结果可知，通过使用酞菁铜(II )_3，4'，4〃，4' “ _四磺酸四钠盐，能够 检测出溶液中形成反平行型G-quadruplex的DNA。另外，图18(A)中得到的各图谱在691. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图18(B)所示。因此可知通过使用酞菁铜(II )_3，4'，4〃，4'“-四磺酸 四钠盐，能够定量检测出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。
另外，图18(B)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结 构变化为反平行型G-quadruplex之后，添加酞菁铜(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸四钠 盐而得到的结果，但是，在进行退火处理之前添加酞菁铜(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸 四钠盐时(即按照图10(A)所示的顺序时)，也与图18(B)的情况同样，所得到的在691. 5nm 的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。<利用阴离子性酞菁镍的检测>首先制备含有15 μ M的酞菁镍(II )四磺酸四钠盐(具有镍作为配位金属、且具 有磺酸基的钠盐作为官能团的阴离子性平面型酞菁)的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶 液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-G-quadruplex溶液D、E、F、G和NC 溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图19(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外，可知该峰以Anti-G-quadruplex溶液D > E > F > G的顺序 增大。根据以上结果可知，通过使用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐，能够检测出溶液中形成反 平行型 G-quadruplex 的 DNA。另外，图19(A)中得到的各图谱在691. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图19(B)所示。因此可知通过使用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐，能够定量检 测出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图19(B)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结 构变化为反平行型G-quadruplex之后，添加酞菁镍(II )四磺酸四钠盐而得到的结果，但 是，在进行退火处理之前添加酞菁镍(II )四磺酸四钠盐时(即按照图10(A)所示的顺序 时)，也与图19(B)的情况同样，所得到的在691. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度之间可获得很高的相关关系。<利用不具有配位金属的阴离子性酞菁的检测>首先制备含有15 μ M的四磺酸酞菁(不具有配位金属、且具有磺酸基作为官能团 的阴离子性平面型酞菁)的50mM HEPES、IOOmMNaCl、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-G-quadruplex溶液D、E、F、G和NC溶液 混合，对该混合液测定480 SOOnm的吸光度。测定结果如图20 (A)所示。由此发现除 了不含DNA的NC溶液外，大致在660 740nm的范围内出现两个峰，另外，可知该峰以 Anti-G-quadruplex溶液D > E > F > G的顺序增大。根据以上结果可知，通过使用四磺酸 酞菁，能够检测出溶液中形成反平行型G-quadruplex的DNA。另外，图20(A)中得到的各图谱在677. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图20(B)所示，在710. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度的关系 如图20(C)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用四磺酸酞菁，能 够定量检测出溶液中的形成反平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图20(B)和图20(C)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过 退火而使结构变化为反平行型G-quadruplex之后，添加四磺酸酞菁而得到的结果，但是， 在进行退火处理之前添加四磺酸酞菁时(即按照图10(A)所示的顺序时)，也与图20(B)和 图20(C)的情况同样，所得到的在677. 5nm和在710. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒 DNA浓度之间可获得很高的相关关系。
<利用阴离子性酞菁钴的检测>首先制备含有15 μ M的四羧酸酞菁钴(II )(具有钴作为配位金属、且具有羧酸基 作为官能团的阴离子性平面型酞菁)的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量20 μ 1)。 接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-G-quadruplex溶液B、C、D、G和NC溶液混合，对该混 合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图33(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外，可知该峰以Anti-G-quadruplex溶液B > C > D > G的顺序 增大。根据以上结果可知，通过使用四羧酸酞菁钴(II )，能够检测出溶液中形成反平行型 G-quadruplex 的 DNA0另外，图33(A)中得到的各图谱在684. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图33(B)所示。因此，通过使用四羧酸酞菁钴(II )，能够定量检测出溶液中 的形成反平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图33 (B)是如上所述将在试样溶 液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结构变化为反平行型G-quadruplex之后，添加四羧 酸酞菁钴(II )而得到的结果，但是，在进行退火处理之前添加四羧酸酞菁钴(II )时(即 按照图10㈧所示的顺序时)，也与图33(B)的情况同样，所得到的在684. 5nm的吸光度值 与该样品的人类端粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。但是，使用四羧酸酞菁钴(II )时在640 720nm的范围所见的峰上升，比使用酞 菁铜(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四钠盐、酞菁镍(II)四磺酸四钠盐和四磺酸酞菁时 的结果小。认为这是由于合成的四羧酸酞菁钴(II )没有充分精制的缘故。<利用阴离子性酞菁铁的检测>首先制备含有15 μ M的酞菁铁(III) _4，4'，4"，4' “ _四磺酸(与氧单钠盐水 合物的混合物)(具有铁作为配位金属、且具有磺酸基作为官能团的阴离子性平面型酞菁) 的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述 Anti-G-quadruplex溶液B和NC溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图21所示。由此，使用Anti-G-quadruplex溶液B时得结果也与使 用不含DNA的NC溶液时的结果大致相同。根据以上结果可知，使用酞菁铁(III)-4，4'， 4"，4' “ _四磺酸(与氧单钠盐水合物的混合物)不能够检测出溶液中的形成反平行型 G-quadruplex 的 DNA0除了以上的酞菁以外，还对四磺酸酞菁锌(II )(=具有锌作为配位金属、 且具有磺酸基作为官能团的阴离子性平面型酞菁)进行相同实验，结果，仅在与 Anti-G-quadruplex溶液混合时在640 740nm的范围内观察到峰。因此，根据实施例1的结果可知，除了使用阴离子性酞菁铁以外，使用任一种阴离 子性平面型酞菁都能够检测出反平行型G-quadruplex。另外，使用四磺酸酞菁锌(II )时， 在上述峰范围内的特定波长的吸光度值与样品中的人类端粒DNA浓度之间也能够确认很 高的相关关系。因此，根据实施例1的结果可知，除了使用阴离子性酞菁铁以外，使用任一种阴离 子性平面型酞菁都能够定量检测出在试样溶液中存在的形成反平行型G-quadruplex的单 链DNA的浓度。(实施例2)
本实施例中，尝试使用阴离子性平面型酞菁检测出在溶液中混合存在的形成反平 行型G-quadruplex和平行型G-quadruplex的DNA。为此，首先以下述顺序制备混合存在有 形成反平行型G-quadruplex的DNA和形成平行型G-quadruplex的DNA的溶液。<混合存在有形成反平行型G-quadruplex的DNA和形成平行型G-quadruplex的 DNA的溶液的制备>首先制备含有人类端粒DNA的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7的溶液(总量100 μ 1)。 这里，分别准备该溶液中所含的人类端粒DNA的浓度为1、2、10、25、50、100μΜ的溶液。作 为阴性对照，还制备了不含DNA的50mM HEPESUOOmM KCUpH 7的溶液。接着，将这些溶液 进行退火处理。接着，为了确认上述结果得到的各溶液中的人类端粒DNA是否形成平行型 G-quadruplex，对各溶液进行CD分析。其结果如图12所示。这里，如实施例1中的说明，已知反平行型G-quadruplex时，该⑶测定的结果为 在295nm附近显示正峰，在265nm附近显示负峰。另一方面，已知平行型G-quadruplex时， 在260nm附近显示正峰，在240nm附近显示负峰。根据这些认知，在图12所示的⑶结果中， 除了阴性对照的溶液以外，在240nm附近存在负峰，在295nm附近存在正峰，由此可以认为 平行型G-quadruplex和反平行型G-quadruplex混合存在。另外，无论是295nm附近的正峰还是240nm附近的负峰，其绝对值均随着人类端粒 DNA浓度的增高而增大。这显示，若最初含有的人类端粒DNA浓度高，则上述退火处理后得 到的溶液中的形成平行型G-quadruplex DNA和形成反平行型G-quadruplex DNA的浓度也均高。下面，分别对人类端粒DNA浓度为100、50、25、10、2、1μΜ的溶液进行上述一系列 的退火处理，将结果得到溶液分别称为Anti-Para-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F。另 一方面，对作为阴性对照制备的不含DNA的溶液进行上述一系列退火处理，将结果得到的 溶液称为NC-2溶液。接着，使用由以上工序得到的Anti-Para-G-quadruplex溶液A、B、C、D、E、F和NC-2 溶液，由阴离子性平面型酞菁进行平行型G-quadruplex检测实验。实验方法如下所述。<利用阴离子性酞菁铜的检测>首先制备含有15μΜ的酞菁铜(II )_3，4' Λ" Λ'“-四磺酸四钠盐的 50mM HEPESUOOmM KC1、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述 Anti-Para-G-quadrup 1 ex溶液B、C、D、F和NC-2溶液混合，对该混合液测定480 800nm 的吸光度。测定结果如图13(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外,可知该峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > F 的顺序增大。根据以上结果可知，通过使用酞菁铜(II )_3，4'，4〃，4'‘‘-四磺酸四钠盐，能 够检测出溶液中混合存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，图13(A)中得到的各图谱在689. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图13(B)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用 酞菁铜(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四钠盐，能够定量检测出形成反平行型和平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图13(B)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结 构变化为反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加酞菁铜(II )_3，4'，4"，4'“-四 磺酸四钠盐而得到的结果，但是，在进行退火处理之前添加酞菁铜(II )_3，4'，4"， 4'“-四磺酸四钠盐时(即按照图10㈧所示的顺序时)，也与图13⑶的情况同样，所得 到的在689. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。<利用阴离子性酞菁镍的检测>首先制备含有15 μ M的酞菁镍(II )四磺酸四钠盐的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7 的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-Para-G-quadruplex溶液A、 B、C、E和NC-2溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图14(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外,可知该峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液A > B > C > E 的顺序增大。根据以上结果可知，通过使用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐，能够检测出溶液中 混和存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，图14(A)中得到的各图谱在677. 5nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图14⑶所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用酞菁 镍(II )四磺酸四钠盐，能够定量检测出形成反平行型和平行型G-quadruplex的单链DNA 的浓度。另外，图14(B)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结 构变化为反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加酞菁镍(II )四磺酸四钠盐而得到的 结果，但是，在进行退火处理之前添加酞菁镍(II )四磺酸四钠盐时(即按照图10(A)所示 的顺序时)，也与图14⑶的情况同样，所得到的在677. 5nm的吸光度值与该样品的人类端 粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。<利用不具有配位金属的阴离子性酞菁的检测>首先制备含有15 μ M的四磺酸酞菁的50mM HEPESUOOmM KCl、pH7的溶液(总量 20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B、C、D、F和NC-2 溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图15(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC-2溶液外，在660 740nm 的范围内出现两个峰，另外，可知该峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > F的 顺序增大。根据以上结果可知，通过使用四磺酸酞菁，能够检测出溶液中混合存在的形成反 平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，图15(A)中得到的各图谱在708. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图15(B)所示，在675. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度的关系 如图15(C)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用四磺酸酞菁，能 够定量检测出形成反平行型和平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图15(B)和图15(C)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过 退火而使结构变化为反平行型G-quadruplex和平行型G-quadruplex之后，添加四磺酸酞 菁而得到的结果，但是，在进行退火处理之前添加四磺酸酞菁时，也与图15(B)和图15(C) 的情况同样，所得到的在708. Onm和在675. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。<利用阴离子性酞菁钴的检测>首先制备含有15 μ M的四羧酸酞菁钴(II )的50mM HEPES、IOOmMKCl、pH7的溶 液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B、C、D、 E和NC-2溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图34(A)所示。由此发现除了不含DNA的NC_2溶液外，大致在640 720nm的范围内出现峰。另外,可知该峰以Anti-Para-G-quadruplex溶液B > C > D > E 的顺序增大。根据以上结果可知，通过使用四羧酸酞菁钴(II )，能够检测出溶液中混合存在的 形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。另外，图34㈧中得到的各图谱在679. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA 浓度的关系如图34(B)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用四 羧酸酞菁钴(II )，能够定量检测出形成反平行型和平行型G-quadruplex的单链DNA的浓度。另外，图34(B)是如上所述将在试样溶液中含有的人类端粒DNA通过退火而使结 构变化为反平行型和平行型G-quadruplex之后，添加四羧酸酞菁钴(II )而得到的结果， 但是，在进行退火处理之前添加四羧酸酞菁钴(II )时，也与图34(B)的情况同样，所得到 的在679. Onm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度之间可获得很高的相关关系。但是，使用四羧酸酞菁钴(II )时在640 720nm的范围所见的峰上升，比使用酞 菁铜(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四钠盐、酞菁镍(II)四磺酸四钠盐和四磺酸酞菁时 小。认为这是由于合成的四羧酸酞菁钴(II )没有充分精制的缘故。<利用阴离子性酞菁铁的检测>首先制备含有15 μ M的酞菁铁(III) _4，4'，4"，4' “ _四磺酸(与氧单钠盐水 合物的混合物)的50mM HEPESUOOmM KC1、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶 液分别与上述Anti-Para-G-quadruplex溶液B和NC-2溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。测定结果如图16所示。由此可知，使用Anti-Para-G-quadruplex溶液B和使 用NC-2溶液这两种情况所得到的结果大致相同。因此，根据以上结果可知，使用酞菁铁 (ΙΙΙ)-4,4' Λ" ,4' “ _四磺酸(与氧单钠盐水合物的混合物)不能检测出溶液中混合 存在的形成反平行型、平行型G-quadruplex的DNA。除了以上的酞菁以外，也对四磺酸酞菁锌(II )(=具有磺酸基作为官能 团、且具有锌作为配位金属的阴离子性平面型酞菁)进行相同实验，结果，仅在与 Anti-Para-G-quadruplex溶液混合时在640 740nm的范围内观察到峰。因此，根据以上 结果可知，除了使用阴离子性酞菁铁以外，使用任一种阴离子性平面型酞菁都能够检测出 反平行型、平行型G-quadruplex。另外，使用四磺酸酞菁锌(II )时，在上述峰范围内的特定波长的吸光度值与样品 中的人类端粒DNA浓度之间也能够确认很高的相关关系。因此，使用四磺酸酞菁锌(II ) 时，也能够定量检测出在溶液中存在的形成反平行型和平行型G-quadruplex的单链DNA的 浓度。
(实施例3)根据上述实施例1和实施例2的结果可知，除了使用阴离子性酞菁铁以外，使用 任一种阴离子性平面型酞菁都能够检测出在溶液中存在的无论形成反平行型还是平行型 G-quadruplex0本实施例3中，为了确认这些阴离子性酞菁对G-quadruplex的特异性，使 用阴离子性酞菁进行了单链DNA和双链DNA的检测实验。为此，首先按照以下顺序制备含 有单链DNA的溶液、含有双链DNA的溶液。<含有单链DNA的溶液的制备>制备以50μΜ的浓度含有由5' -ttttttttttttttttttttt-3‘的序列(序列号 4)形成单链DNA的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量100 μ 1)，将这些溶液在90°C 孵育5分钟之后，以2V /分钟的降温速度冷却至0°C，最后在0°C孵育2小时。该结果得到 的溶液中的DNA在孵育后也为单链DNA (以下，将该溶液称为单链DNA溶液)。<含有双链DNA的溶液的制备>制备分别以50 μ M的浓度含有由5 ‘ -AGAAGAGAAAGA-3 ‘的序列(序列号5)形 成单链DNA和由5 ‘ -TCTTTCTCTTCT-3 ‘的序列(序列号5的反义链)形成单链DNA的 50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量100 μ 1)，将这些溶液在90°C孵育5分钟之后， 以2V /分钟的降温速度冷却至0°C，最后在0°C孵育2小时。由于上述两种DNA具有互补 的关系，该孵育的结果使溶液中的两种DNA形成了双链DNA(以下，将该溶液称为双链DNA 溶液)。使用以上工序得到的单链DNA溶液和双链DNA溶液，利用阴离子性酞菁进行单链 DNA和双链DNA的检测实验。实验方法如下所述。<利用阴离子性酞菁铜的检测>首先制备含有15μΜ的酞菁铜(II )_3，4' A" A'“-四磺酸四钠盐的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述单链DNA溶 液和双链DNA溶液混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。单链DNA溶液和双链DNA 溶液各自的测定结果如图22㈧和图22⑶所示。在各自的图中，将使用实施例1中的NC溶液作为阴性对照得到的结果也一并表 示。由此可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液尽管含有50 μ M的高浓度的DNA，也都得到与 NC溶液中基本相同的结果。因此，根据上述结果和实施例1及实施例2的结果可知，使用酞 菁铜(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四钠盐对形成G-quadruplex的DNA的检测具有极高 的特异性。<利用阴离子性酞菁镍的检测>首先制备含有15 μ M的酞菁镍(II )四磺酸四钠盐的50mM HEPESUOOmM NaCl, PH7的溶液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述单链DNA溶液和双链DNA溶液 混合，对该混合液测定480 800nm的吸光度。单链DNA溶液和双链DNA溶液各自的测定 结果如图23(A)和图23(B)所示。在各自的图中，将使用实施例1中的NC溶液作为阴性对 照得到的结果也一并表示。由此可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液尽管含有50 μ M的高浓度的DNA，也都得 到与NC溶液基本相同的结果。因此，根据上述结果和实施例1及实施例2的结果可知，使 用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐对形成G-quadruplex的DNA的检测具有极高的特异性。
<利用不具有配位金属的阴离子性酞菁的检测>首先制备含有15 μ M的四磺酸酞菁的50mM HEPESUOOmM NaCl、pH7的溶液(总量 20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述单链DNA溶液和双链DNA溶液混合，对该混合液测 定480 800nm的吸光度。单链DNA溶液和双链DNA溶液各自的测定结果如图24 (A)和图 24(B)所示。在各自的图中，将使用实施例1中的NC溶液作为阴性对照得到的结果也一并表 示。由此可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液尽管含有50 μ M的高浓度的DNA，也都得到与 NC溶液基本相同的结果。因此，根据上述结果和实施例1及实施例2的结果可知，使用四磺 酸酞菁对形成G-quadruplex的DNA的检测具有极高的特异性。<利用阴离子性酞菁钴的检测>首先制备含有15 μ M的四羧酸酞菁钴(II )的50mM HEPES、IOOmMNaCl、pH7的溶 液(总量20 μ 1)。接着，将该酞菁溶液分别与上述单链DNA溶液和双链DNA溶液混合，对 该混合液测定480 800nm的吸光度。单链DNA溶液和双链DNA溶液各自的测定结果如图 35(A)和图35⑶所示。在各自的图中，将使用实施例1中的NC溶液作为阴性对照得到的
结果也一并表示。由此可知，单链DNA溶液和双链DNA溶液尽管含有50 μ M的高浓度的DNA，也都得 到与NC溶液基本相同的结果。因此，根据上述结果和实施例1及实施例2的结果可知，使 用四羧酸酞菁钴(II )对形成G-quadruplex的DNA的检测具有极高的特异性。除了以上的酞菁以外，也对四磺酸酞菁锌(II )(=具有磺酸基作为官能团、且具 有锌作为配位金属的阴离子性平面型酞菁)进行相同实验，结果，单链DNA溶液和双链DNA 溶液尽管含有50 μ M的高浓度的DNA，也都得到与NC溶液基本相同的结果。(实施例4)上述实施例1和实施例2中显示了，使用由与人类的端粒部分的序列相同的序列 形成单链DNA制备平行型、反平行型G-quadruplex的DNA，能够利用除了配位金属是铁以 外的阴离子性酞菁将它们检测出来，或者基于该检测的结果能够定量检测出上述单链DNA。 本实施例4中，对上述实施例1和实施例2的结果是否限于由人类端粒部分的序列形成的 G-quadruplex、还是对由人类端粒部分的序列以外形成的G-quadruplex也能够得到同样 的结果进行研究。〈利用阴离子性酞菁铜对由5'-ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的检测 >首先制备由序列5' -ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的单链DNA(以下称为 64丁4640離)、2.5“] 的酞菁铜(11)-3，4'，4〃，4'“-四磺酸四钠盐和50mM HEPES、IOOmM KC1、pH7的溶液(总量100 μ 1)。G4T4G4DNA序列与人类端粒部分的序列不同，但是已知在K+的存在下通过退火处 理可形成平行型G-quadruplex。分别准备上述溶液中的G4T4G4DNA浓度为0、1、2、3、4、5、 10 μ M的溶液。接着，将这些溶液进行退火处理，对它们测定480 SOOnm的吸光度。测定结果如 图25 (A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA为ΟμΜ时以外，大致在640 720nm的范 围内出现峰。
根据以上结果可知，通过使用酞菁铜(II )_3，4'，4〃，4'“-四磺酸四钠盐，能 够检测出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，图25 (A)中得到的各图谱在687nm的吸光度值与该样品的G4T4G4DNA浓度 的关系如图25(B)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，根据该结果可知， 通过使用酞菁铜(11)-3，4'，4"，4'“-四磺酸四钠盐，能够定量检测出G4T4G4DNA的浓度。〈利用阴离子性酞菁镍对由5'-ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的检测 >采用与上述 < 利用阴离子性酞菁铜对由5' -ggggttttgggg-3'(序列号6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的检测 > 的实验相同的方法，使用酞菁镍(II )四磺 酸四钠盐代替酞菁铜(II )_3，4'，4〃，4'丨‘-四磺酸四钠盐进行实验。另外，G4T4G4DNA 浓度为0、1、2、3、4、5、10、25μΜ。结果如图26(A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA为 0μ M时以外，大致在640 720nm的范围内出现峰。根据以上结果可知，通过使用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐，能够检测出由 G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，图26 (A)中得到的各图谱在677. 5nm的吸光度值与该样品的G4T4G4DNA浓 度的关系如图26(B)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，根据该结果可 知，通过使用酞菁镍(II )四磺酸四钠盐，能够定量检测出G4T4G4DNA的浓度。〈利用不具有配位金属的阴离子性酞菁对由5'-ggggttttgggg-3'(序列号6) 形成的形成平行型G-quadruplex的DNA的检测>采用与上述 < 利用阴离子性酞菁铜对由5' -ggggttttgggg-3'(序列号6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的检测 > 的实验相同的方法，使用四磺酸酞菁代替酞 菁铜(11)-3，4'，4"，4'“-四磺酸四钠盐进行实验。另外，G4T4G4DNA浓度为0、1、2、 10、25μΜ。结果如图27(A)所示。由此可知，除了上述G4T4G4DNA为0 μ M时以外，大致在 660 740nm的范围内出现峰。根据以上结果可知，通过使用四磺酸酞菁，能够检测出由G4T4G4DNA形成的形成 平行型 G-quadruplex 的 DNA。另夕卜，图27 (A)中得到的各图谱在705. Onm的吸光度值与该样品的G4T4G4DNA浓 度的关系如图27(B)所示，在6740nm的吸光度值与该样品的人类端粒DNA浓度的关系如图 27(C)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，根据该结果可知，通过使用四 磺酸酞菁，能够定量检测出G4T4G4DNA的浓度。〈利用阴离子性酞菁钴对由5'-ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的检测 >采用与上述 < 阴离子性酞菁铜对由5' -ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的 形成平行型G-quadruplex的DNA的检测〉的实验相同的方法，使用四羧酸酞菁钴(II )代 替酞菁铜(II )_3，4'，4"，4'“-四磺酸四钠盐进行实验。但是，四羧酸酞菁钴(II )的 浓度为30μΜ。另外，G4T4G4DNA浓度为0、5、10、25、50μΜ。结果如图36(A)所示。由此可 知，除了上述G4T4G4DNA为0 μ M时以外，大致在640 720nm的范围内出现峰。根据以上结果可知，通过使用四羧酸酞菁钴(II )，能够检测出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。另夕卜，图36 (A)中得到的各图谱在680nm的吸光度值与该样品的G4T4G4DNA浓度 的关系如图36(B)所示。由此可知两者之间存在很高的相关关系。因此，通过使用四羧酸 酞菁钴(II )，能够定量检测出G4T4G4DNA的浓度。但是，使用四羧酸酞菁钴(II )时在640 720nm的范围所见的峰上升，比使用酞 菁铜(11)-3，4'，4"，4' “ _四磺酸四钠盐、酞菁镍(II)四磺酸四钠盐和四磺酸酞菁时 小。认为这是由于合成的四羧酸酞菁钴(II )没有充分精制的缘故。〈利用阴离子性酞菁铁对由5'-ggggttttgggg-3'(序列号6)形成的形成平行 型 G-quadruplex 的 DNA 的检测 >采用与上述 < 利用阴离子性酞菁铜对由5' -ggggttttgggg-3'(序列号6)形 成的形成平行型G-quadruplex的DNA的检测 > 的实验相同的方法，使用酞菁铁(III )_4， 4'，4〃，4'丨‘-四磺酸(与氧单钠盐水合物的混合物)代替酞菁铜(II )_3，4'，4〃， 4'‘‘-四磺酸四钠盐进行实验。另外，6奵4640嫩浓度为0、1、2、3、4、5、10、25口1。结果如图28所示。由此可知，所有浓度时的结果都与0μ M的结果一样。因此可 知通过酞菁铁(III)-4，4'，4〃，4'“-四磺酸(与氧单钠盐水合物的混合物)不能检测 出由G4T4G4DNA形成的形成平行型G-quadruplex的DNA。除了以上的酞菁以外，也对四磺酸酞菁锌(II )(=具有磺酸基作为官能团、且具 有锌作为配位金属的阴离子性平面型酞菁)进行相同实验，结果，除了上述G4T4G4DNA为 0 μ M时以外，大致在640 740nm的范围内观察到峰。因此，根据上述结果可知，除了使用 阴离子性酞菁铁以外，使用任一种阴离子性酞菁都能够检测出由G4T4G4DNA形成的形成平 行型 G-quadruplex 的 DNA。另外，使用四磺酸酞菁锌(II )时，也能够确认上述峰范围内的特定的波长的吸光 度值与G4T4G4NDA浓度之间存在很高的相关关系。因此，使用四磺酸酞菁锌(II )也能够 定量检测出G4T4G4DNA的浓度。将实施例1 实施例4的结果与表示各酞菁的结构的图一同总结于图29中。图 29中的〇表示在各实施例的DNA检测实验中，依赖于目的DNA的存在而在640 740nm的 波长范围内能够得到吸光度峰。另一方面，X表示不能得到这样的峰。另外“_”表示没 有进行实验。由此可知，除了阴离子性酞菁铁以外，无论阴离子性官能团的种类(磺酸基 或者羧基)如何还是配位金属的种类如何，使用任一种阴离子性酞菁都能特异性检测出 G-quadruplex。另外可知，对于G-quadruplex的种类而言，也不依赖于平行型或者反平行 型，并且对于序列而言也不限于人类端粒DNA序列，只要是用图2说明的G-quadruplex，都 能够检测出来。需要说明的是，关于酞菁和G-quadruplex，已知下述的两个重要事项。首先，第一 个重要事项是关于酞菁所表现出的吸光度。当酞菁类溶解于通常的溶液中时，由于其宽大 的η平面而产生相互间的叠加相互作用，从而引起分子间会聚。此时的典型的UV吸收谱 如图30(A)所示。另一方面，如果向该状态的酞菁溶液中添加表面活性剂，则在640 740 附近出现峰(图30(B))。已知这时表示通过表面活性剂的添加而使酞菁以会聚被解除的状 态(换而言之即为单体的状态)存在的峰。即，本实施例1 4的结果中，除了阴离子性酞 菁铁以外，其他的阴离子性酞菁在与G-quadruplex混合的状态中，至少一部分作为单体存
23在，它们表现为640 730nm附近的峰。第二个重要事项是关于G-quadruplex与其它有机分子的相互作用。如图2中的 说明，G-quadruplex具有称为G-qartet(G四联体)面的宽大的π平面叠加而成的结构。 这样的结构容易使其它具有η平面的分子嵌入该G-qartet面与G-qartet面之间。因此， 例如此前的阳离子性蒽醌类和阳离子性卟啉等的分子，显示通过其静电相互作用和叠加相 互作用的效果而嵌入G-quadruplex中。因此，加上对这些知识的考虑，本实施例1 本实施例4的结果表示，除了阴离子 性酞菁铁以外的其它阴离子性酞菁以图31所示的机制特异性检测G-quadruplex。S卩，不存 在G-quadruplex时，这些阴离子性酞菁会聚，其UV吸收谱如图30(A)所示。但是，如果其 中混合G-quadrup 1 ex，则这些阴离子性酞菁的至少一部分嵌入G-quadrup 1 ex中。嵌入的阴 离子性酞菁与单体状态相同，因此显示640 730nm的吸光度峰。这里，出乎意料的一点在于，尽管所使用的酞菁不同于上述的阳离子性蒽醌类和 阳离子性卟啉类，而为阴离子性的，但是也能得到该效果。另一方面，单链DNA和双链DNA 中不存在G-quadruplex这样的宽大的π平面，而且阴离子性之间的静电排斥也发挥作用， 其结果，即使混合也不引起反应。因此，本发明的发明人发现，与原来认为的阳离子性作为 DNA检测的探针有利的常识相反，通过使用阴离子性的酞菁，能够得到对G-quadruplex很 高的特异性，从而完成了本发明。另外，着眼于图29所示的酞菁的配位金属可知，只有在配位金属为铁时，无论是 人类端粒DNA还是G4T4G4DNA，都不能检测出G-quadruplex。该理由如下所述。即，作为酞 菁的代表性的结构，存在称为平面型的和称为羽毛球型的。平面型则如其名，分子整体形成 平面(图32(A))，与其相对，羽毛球型则形成为金属和其配体从酞菁平面仅向一个方向突 出的结构(图32(B))。作为本发明中使用的作为阴离子性酞菁铁的酞菁铁(III )_4，4'，4"，4'“-四 磺酸(与氧单钠盐水合物的混合物)，是配位金属铁具有氧的物质，其是羽毛球型的酞菁。 另一方面，本实施例中使用的其它酞菁全部是平面型。如上所述，羽毛球型酞菁形成从中 央部分突出的结构从而缺乏平面型。因此，平面型的酞菁如图31所示的机制，能够嵌入 G-quadruplex中，与此相对，本实施例中使用的阴离子性酞菁铁所代表的羽毛球型酞菁由 于不是平面型，所以不能嵌入G-quadruplex中，作为结果，不能观察到采用其它阴离子性 酞菁类时所观察到的640 730nm的吸光度峰。这种关于平面型酞菁和羽毛球型酞菁对 G-quadruplex的相互作用的知识，是本发明的发明人在世界上首次发现的。对以上进行总结，本发明的发明人与现有的常识相反地使用阴离子性的酞菁，并 且在世界上首先发现平面型酞菁和羽毛球型酞菁对G-quadruplex的相互作用的不同，由 此完成了本发明的使用阴离子性平面型酞菁的特异性极高的G-quadruplex检测方法。根据上述说明，本领域技术人员能够理解本发明的大量改良和其它实施方式。因 此，上述说明仅仅是作为示例进行解释的，是出于将实施本发明的最佳方式向本领域技术 人员进行说明的目的而提供的。能够不超出本发明的精神而将其结构和/或机能的详细内 容进行实质上的变更。产业上的可利用性。根据本发明，形成G-quadruplex的DNA的特异性检测方法作为生物技术领域中的分析方法是有用的。
权利要求
一种G-quadruplex检测方法，检测试样溶液中的G-quadruplex，其中，该试样溶液含有形成单链结构、双链结构和G-quadruplex中的至少任一种以上的结构的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述试样溶液混合的工序；(c)测定所述(b)工序之后的混合液在640～740nm的吸光度的工序；和(d)如果在所述640～740nm出现最大吸收峰，则判定所述试样溶液中含有形成G-quadruplex结构的DNA的工序。
2.如权利要求1所述的G-quadruplex检测方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁，是具有铜、锌、钴或者镍作为配位金属的阴离子性平面型酞 菁、或者不具有配位金属的阴离子性平面型酞菁。
3.如权利要求1所述的G-quadruplex检测方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基以及磺基的金属盐中的 至少一种官能团。
4.一种形成G-quadruplex的DNA的检测方法，通过研究试样溶液中含有的形成单 链结构和双链结构中的至少一种以上的结构的DNA是否形成G-quadrup 1 ex，检测形成 G-quadruplex的DNA，其特征在于，所述方法依次包括以下工序(a)将所述试样溶液置于G-quadruplex形成反应条件下的工序；(b)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(c)在所述(a)工序之前或之后，将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述试样 溶液混合的工序；(d)测定所述(a) (c)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；禾口(e)如果在所述640 740nm出现最大吸收峰，则判定所述试样溶液中含有形成 G-quadruplex结构的DNA的工序。
5.如权利要求4所述的形成G-quadruplex的DNA的检测方法，其特征在于 所述阴离子性平面型酞菁是配位有选自铜、锌、钴和镍中的至少一种金属的阴离子性平面型酞菁、或者没有配位金属的阴离子性平面型酞菁中的任一种。
6.如权利要求4所述的形成G-quadruplex的DNA的检测方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基以及磺基的金属盐中的 至少一种官能团。
7.—种端粒酶活性测定方法，测定试样溶液中的端粒酶活性，其特征在于，所述方法依 次包括以下工序(a)制备所述试样溶液的工序；(b)制备底物溶液的工序，该底物溶液含有作为端粒酶底物的DNA；(c)混合所述试样溶液和所述底物溶液，制备端粒酶反应溶液的工序；(d)将所述端粒酶反应溶液置于由端粒酶进行的DNA添加反应的条件下；(e)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(f)将含有所述阴离子性平面型酞菁的溶液与所述(d)工序后得到的溶液混合的工序； (g)测定所述(a) (f)的一系列工序之后的混合液在640 740nm的吸光度的工序；禾口(h)如果在所述640 740nm出现最大吸收峰，则判定所述试样溶液中含有形成 G-quadruplex结构的DNA的工序。
8.如权利要求7所述的端粒酶活性测定方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁是配位有选自铜、锌、钴和镍中的至少一种金属的阴离子性 平面型酞菁、或者没有配位金属的阴离子性平面型酞菁中的任一种。
9.如权利要求7所述的端粒酶活性测定方法，其特征在于所述阴离子性平面型酞菁具有选自羧基、羧基的金属盐、磺基及磺基的金属盐中的至 少一种官能团。
全文摘要
本发明提供一种特异性检测G-quadruplex的方法。本发明的G-quadruplex检测方法的特征在于，包括以下工序(a)准备含有阴离子性平面型酞菁的溶液的工序；(b)将含有上述阴离子性平面型酞菁的溶液与试样溶液混合的工序；和(c)测定上述(b)工序后的混合液在640～740nm的吸光度的工序。
文档编号G01N33/58GK101889210SQ20098010127
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月27日
发明者三好大辅, 夜久英信 申请人:松下电器产业株式会社