专利名称：使用6,8－二氟－4－甲基－7－羟基香豆素磷酸酯高度敏感和连续地检测蛋白酪氨酸磷 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯，特别是在中性条件下检测蛋白酪氨酸磷酸酶的改进方法。
现有技术公开了使用底物对-硝基苯基磷酸酯(p-NPP)检测蛋白酪氨酸磷酸酶活性的方法。在标准生物化学手册中可找到这些检测方法，如“Current Protocols in Protein ScienceJohn E.Coligan(主编)，Ben M.Dunn(主编)，Hidde L.Ploegh(主编)，David W.Speicher(主编)，Paul T.Wingfield(主编)；SBN0-471-11184-8；活页，不断更新；John Wiley &Sons出版”。磷酸酶的作用是从p-NPP形成对-硝基苯酚。基于其在碱性范围中的强烈黄色可用光度法检测对-硝基苯酚。
然而，这个检测方法具有一些不利特征。该检测不适合于直接确定该酶的活性，因为它是根据时间-终止原理实施的。根据这个原理，在给定的一段时间过去后添加氢氧化钠溶液中断酶反应。pH增加导致所形成的对-硝基苯酚的颜色变为黄色，用光度法确定它的吸收并且是对-硝基苯酚存在量的度量。该检测原理对酶动力学研究相当详尽，例如用于确定抑制类型。由于需要大量实验点，所以不得不建立相互并列的相应数量的独立试验。
此外，底物对光、温度和pH敏感。在生理pH范围内，它有缓慢分解的趋势。当pNPP用作底物时，一些待研究的酪氨酸磷酸酶在酸性范围内具有最大活性。例如，PTP1B在pH5.6显示出更大的转换值。另一方面，在生理pH7.0下，当使用pNPP作为底物时，PTP1B仅以30％的最大转换值工作。这使得需要使用相对高数量的酶，导致费用相应增加。这个检测方法的另一个不利因素是检测中存在的其它成分，如缓冲液、盐或其它物质(检测物质)，在黄色范围内有时有吸收。这需要适当的背景对照。
孔雀石绿磷酸肽检测已被描述作为检测蛋白酪氨酸磷酸酶活性的另一种方法(Martin等(1985)Journal of Biological Chemistry，260，14932页和Harder等(1994)Biochemical Journal，298，395页)。在该方法中，使用孔雀石绿试剂通过光度法检测磷酸酶由其底物肽释放出的无机磷酸盐。除了由于例如杂质或pH敏感性而引起的光度测定法的不稳定性以及时间-终止方法的费时费力外，另一个缺点是不得不制备高浓度的每个磷酸酶的特定底物肽，这通常使该方法相当昂贵。
3，6-荧光素二磷酸酯已被描述作为检测蛋白酪氨酸磷酸酶的另一种底物(Journal of Biomolecular Screening 4，327-334，1999)。尽管这个底物相对于上面提及的两个底物，使得能够直接测定酶活性，但是该底物的光谱性质对于在生理pH范围下实施测量仍然不是特别好。
因此，本发明涉及检测生物学材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括a)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，b)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，c)在含水溶液中，使来自a)的生物学材料或从生物学材料获得的制品与来自b)的DiFMUP接触，d)通过荧光测定检测所形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素。
从生物学材料获得的制品优选包括选自LAR、CD 45、PTPα、PTP1B、TCPTP、YOP、CDC 25、PTEN和SHP1，2的蛋白酪氨酸磷酸酶。从生物学材料获得的制品可以以不同的纯度级别存在。从生物学材料获得的制品可以是完整细胞、分解的细胞、富含细胞成分和/或细胞器的样品，或纯化蛋白。
当接触生物学材料或从生物学材料获得的制品时，优选6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)的浓度从10至250μM。特别优选，DiFMUP的浓度是从50至100μM。
生物学材料或从生物学材料获得的制品与DiFMUP的含水溶液接触的pH优选在5.0和8.0之间，特别优选在6.0和7.5之间。在一个实施方案中，再次特别优选该pH是7.0。
本发明也涉及鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法，它包括a)提供一种化合物，b)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，c)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，d)在含水溶液中，使来自a)的化合物和来自b)的生物学材料或从生物学材料获得的制品和来自c)的DiFMUP彼此接触，e)通过荧光测定确定形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量，f)比较e)中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量和对照试验中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量。
对照试验的特征在于，当生物学材料或从生物学材料获得的制品接触DiFMUP时，无化合物参与以上提及的步骤a)或该化合物对于所选类型的蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的。对照试验中使用的并且其对蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的所述化合物尤其可以是钒酸盐、钒有机化合物、过钒酸盐、冈田酸、NaF、dephostasin、修饰的肽或其它化合物。
在鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的各种优选实施方案中，这种改变应该包括刺激、抑制或稳定蛋白酪氨酸磷酸酶的活性。
在鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的另一个优选实施方案中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶选自LAR、CD 45、PTPα、TC-PTP、CDC 25、PTEN、YOP、SHP1，2和PTP1B。
本发明还涉及可以改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性并且已经用上述鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法进行了鉴定的化合物。优选该化合物具有0.1至50kDa的分子量，更优选0.1至5kDa并更优选0.1至3kDa。该化合物可以是蛋白、氨基酸、多核苷酸、核苷酸、天然产物或芳香烃化合物。本发明还涉及一种药物，它包含至少一种如上所述的化合物，该化合物已用鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法所鉴定。该药物还包含配制药物的辅助物质和/或聚合物添加剂。
本发明还涉及已通过鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法进行了鉴定的可改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物在制备治疗糖尿病的药物的应用。
6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酶可从商业上获得。例如，欧洲BV分子探针公司(2333 Leiden，荷兰)出售这种化学品。US 5,830,912公开了其制备。
生物学材料是含有遗传信息的任何材料，它本身也可以是细菌或真菌如大肠杆菌或酿酒酵母。生物学材料也包括来自细胞培养的细胞。
在来自动物或人组织的细胞的情况下，生物学材料可通过活组织检查、手术取出或使用注射器或导管取出或类似的技术获得。这样取出的细胞可以深度冷冻、纯化或进行培养。使用常规的微生物技术使细菌和酵母细胞繁殖并纯化。
本领域技术人员可在“Current Protocols in Molecular Biology；主编F.M.Ansabel等，活页出版物，不断更新，2001版，John Wiley & Sons出版”中发现为此目的的适当指导。生物学材料也可以包括来自动物细胞培养的细胞。这种细胞的实例是小鼠细胞、大鼠细胞或仓鼠细胞。细胞培养的细胞可以是原代细胞类型或建立的细胞系。建立的细胞系的例子是小鼠3T3细胞、CHO细胞或Hela细胞。标准教科书，例如“Basic Cell Culture；主编J.M.Daris IRL Press，Oxford(1996)”中描述了细胞系的维持、生长和繁殖。
通过例如破裂生物学材料和随后的纯化步骤制备从生物学材料获得的制品。破裂生物学材料的方法尤其可以是反复冻融、超声处理、使用French压榨机或添加洗涤剂和酶等。随后的纯化步骤包括例如差速离心、用硫酸铵或有机溶剂沉淀、使用色谱技术等。色谱技术的实例是聚丙烯酰胺凝胶电泳、高压液相色谱、离子交换色谱、亲和色谱、气相色谱、质谱等。为此目的，本领域技术人员可利用教科书如“Current Protocols inProtein Science，主编J.E.Coligan等，活页出版物，不断更新，2001版，John Wiley & Sons出版”，特别是关于纯化蛋白的详细指导。
生物学材料或从生物学材料获得的制品可以在常规的实验室容器如Eppendorf管、离心管或玻璃烧瓶中与DiFMUP接触。其下的含水培养基含有例如缓冲物质、营养培养基组分、单电荷或双电荷离子如Na+、K+、Ca2+、Cl-、SO42-和PO32-，或其它离子，以及蛋白、甘油或另一种物质。对于接触，特定的恒定条件，如尤其是温度、pH、离子条件、蛋白浓度、体积或其它因素可能是有利的。这通过例如在保持恒定温度的温箱装置中，在缓冲液存在下或使用预先准确称重的离子或蛋白实施接触来完成。含水溶剂尤其也可以含有特定比例的有机溶剂，如二甲基亚砜、甲醇或乙醇。然而，这种溶剂的含量优选至多占混合物体积的10％。
PTP酶(磷酸酶)蛋白家族目前包括大约100个不同的成员。这些成员可以粗略细分为受体偶联蛋白和细胞质蛋白。磷酸酶在催化结构域共同具有氨基酸基序(H/V)CX5R(S/T)。受体偶联磷酸酶通常由细胞外结构域、单一跨膜区和一个或两个细胞质PTP酶结构域组成。认为LAR(白细胞共有相关抗原)蛋白和PTPα蛋白属于受体偶联PTP酶。作为例如“SH结构域”的结果，细胞内PTP酶通常含有催化结构域和C末端或N末端区域的各种延伸。这些延伸归因于寻靶或调节的功能。酶PTP1B被归为细胞质PTP酶。除了纯的酪氨酸磷酸酶，PTP酶家族还包括双重磷酸酶组。除了磷酸酪氨酸，这些酶也使用磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸作为底物。该组包括例如磷酸酶VHR和cdc25。
磷酸酶LAR、PTPα、SHP-2和PTP1B在胰导素介导的信号途径中具有重要功能。这些PTP酶与胰导素受体相关并催化脱磷酸化反应。这些PTP酶可能单独或组合在胰导素抗性的发病机理中起作用(Biochemistry38，3793-3803，1999；3799页)。
PTP1B是胰导素刺激的信号转导途径的负调节剂，即该蛋白再次切断由胰导素诱导的信号。据推测，该信号途径是由胰导素受体直接脱磷酸化打断的。在高比例的罹患乳癌的患者中PTP1B也过度表达。而且，该酶与“表皮生长因子”相互作用。已经证明该酶具有两个芳香基磷酸酯结合袋。一个正好位于活性中心，而另一个位于这之外与催化中心相邻的部位。(Biochemistry 38，3793-3803，1999)。
很多细胞内信号的传递和终止受所包含因子的酪氨酸磷酸化控制。互补的蛋白酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶(PTP酶)、尤其是蛋白酪氨酸磷酸酶活性的精确平衡建立了磷酸化状态。
作为酶，PTP酶负责使磷酸酪氨酸残基选择性去磷酸化。PTP酶在与蛋白酪氨酸激酶的相互作用、在各种不同的生物学过程、在调节信号中的功能是由于例如生长因子或激素。这些信号转导机制在调节细胞代谢、生长、分化或迁移率中起着重要作用。
信号转导途径的过失调节被认为是很多病理过程的原因之一。这些过程包括例如癌症、一些免疫学和神经病学疾病、并且也包括II型糖尿病和肥胖。
化合物通过例如化学合成来提供。本领域技术人员熟悉标准的合成方法。该化合物可以是化合物集合的一部分，从已经总结的合成程序(称作化学文库)储存和分类化合物而形成。在其它情况下，该化合物可由微生物形成，尤其是细菌，或由真菌或植物形成(天然产物)。
口服给药的合适药物化合物可以以单独的单位存在，如胶囊、扁囊、吮吸片剂或片剂，如散剂或颗粒剂，如含水或非水液体中的溶液或悬液，或如水包油或油包水乳剂。这些组合物可以按照任何合适的制药方法制备，包括将活性化合物和赋形剂(它可由一种或多种另外的组分组成)接触的步骤。通常，通过将活性化合物均匀地与液体和/或细分散的固体赋形剂混合来制备该组合物，如果需要的话，其后形成产物。
因此，片剂可例如通过压制或成型化合物的粉末或颗粒来制备，其中如果适当的话，连同一种或多种另外的组分一起。
压制的片剂可以通过压片自由流动形式的化合物如粉末或颗粒来制备，其中在合适的机器中适当地与粘合剂、助流剂、惰性稀释剂和/或一种(几种)表面活性/分散剂混合。通过形成粉状化合物可以制备成型的片剂，它在合适的机器中用惰性液体稀释剂弄湿。
适合经口(舌下)给药的药物组合物包括含有化合物和矫味剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶的含片，和在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含化合物的锭剂。
胃肠外给药的合适药物组合物优选包括化合物的无菌含水制剂，该制剂优选与意欲接受者的血液是等渗的。优选静脉内给予这些制剂，即使也可以作为注射剂经皮下、肌肉内或真皮内给药。优选可通过将化合物与水混合并使形成的溶液无菌和与血液等渗来制备这些制剂。根据本发明的可注射组合物通常包含0.1至5％重量的活性化合物。
直肠给药的合适药物组合物优选以单剂量栓剂的形式存在。
这些可以通过将化合物与一种或多种常规固体赋形剂，例如可可脂混合并成型所得混合物来制备。
皮肤上局部使用的合适药物组合物优选以软膏、乳膏、洗剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂或油剂形式存在。可以使用的赋形剂是凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇和两种或多种这些物质的组合。活性化合物通常以组合物重量的0.1至15％的浓度存在，例如0.5至2％。
也可以经皮给药。经皮使用的合适药物组合物可以以适合紧密、长期接触患者表皮的独立的硬膏的形式存在。这种硬膏适当地包含处于缓冲含水溶液中的活性化合物，其中适合的话，溶解和/或分散于粘合剂中或分散于聚合物中。合适的活性化合物浓度是大约1％至35％，优选大约3％至15％。
2型糖尿病(NIDDM-非胰导素依赖型糖尿病)的特征是禁食状态下葡萄糖值高(高血糖)(＞126mg/dl)，外周组织中如肌肉或脂肪的胰导素抗性，肝脏糖异生增加和胰腺β细胞分泌胰导素不足。这种疾病的真实原因仍未知。2型糖尿病经常和其它临床症象一起发生，如肥胖、高甘油三酯血症(血脂值升高)和高血压。
据推测，胰导素抗性是理解临床症象的关键。胰导素抗性表现为外周器官对确定浓度的胰导素的反应能力降低。这反映在细胞水平，即诱导胰导素的作用所需的胰导素的量增加。在肌肉、脂肪和肝脏细胞中，胰导素对葡萄糖代谢和脂肪代谢具有各种作用，如增加葡萄糖从血液吸收，增加葡萄糖的代谢速度或抑制脂肪酸分解。认为各种因素在细胞水平与胰导素抗性的发展具有基本联系。胰导素受体、信号级联的因子以及葡萄糖转运系统的成分在其中起着重要作用。
胰导素通过在第一步中结合胰导素受体而产生其生物学作用。该受体结合胰导素之后，其β亚单位遭受胰导素受体激酶的自磷酸化作用。在肌肉细胞中，该信号依靠IRS(胰导素受体底物)和PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)在细胞传递并导致被刺激的葡萄糖吸收。胰导素带来大量其它作用，这些作用通过仅部分了解的机制进行。在细胞内信号传递中，特定的激酶和磷酸酶以协调方式一起作用。胰导素从受体解离不足以切断胰导素诱导的信号。只要调节结构域保持磷酸化，胰导素受体的酪氨酸激酶活性就保持。细胞PTP酶负责切断该信号。对胰导素信号途径的负调节剂具有抑制作用的药理学活性化合物具有延迟胰导素受体脱磷酸化的潜力。这提供了能够使用降低对胰导素抗性的物质的可能性。
缩写LAR白细胞抗原相关蛋白酪氨酸磷酸酶CD45 白细胞磷酸酶CD45YOPyersinia蛋白酪氨酸磷酸酶PTPα 蛋白酪氨酸磷酸酶αPTP 1B 蛋白酪氨酸磷酸酶1BTC-PTP T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶CDC-25 细胞分裂控制磷酸酶25PTEN 染色体10内的磷酸酶(双重特异性)SHP1，2src-同源磷酸酶1，2实施例1.依赖于PTP1B酶浓度的DiFMUP的裂解反应在37℃下在黑色微量滴定板中进行。每种待分析酶浓度提供135μl反应缓冲液，所述反应缓冲液含有下列成分所需终浓度(

图130-600ng/ml)的蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B；50mM Hepes，pH6.9；150mMNaCl；1mM EDTA；2mM DTT。添加15μl 1mM DiFMUP溶液开始磷酸酶反应，并在荧光微量滴定板光度计中在激发波长358nm和发射波长455nm下测定荧光(单位RFU)的增加，连续测定15分钟。酶活性的度量是依赖于PTP1B终浓度的荧光增加，可图示描述(图1)。
2.PTP1B裂解DiFMUP的浓度依赖性反应在37℃下在黑色微量滴定板中进行。每种情况提供135μl反应缓冲液，所述缓冲液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT。添加15μlDiFMUP溶液开始磷酸酶反应，所述溶液含有10倍于检测混合物中所需的终浓度的底物(图20-200μM)，并在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光，以30秒的时间间隔测定15分钟。酶活性的度量是依赖于DiFMUP浓度的荧光(单位RFU)的增加，可图示描述(图2)。该图随后可用于通过Lineweaver-Burk分析来确定酶反应的动力学常数。因此，发现PTP1B具有19μM的Km值和388000 RFU sec-1mg-1的Vmax。该分析也可以以类似模式对其它酪氨酸磷酸酶实施。
3.依赖于磷酸酪氨酸磷酸酶PTPα、LAR、T细胞-PTP、SHP-2、CD45和YOP浓度的DiFMUP的裂解反应在37℃下在黑色微量滴定板中进行。每种待分析的酶和酶浓度提供135μl反应缓冲液，所述缓冲液含有下列成分所需终浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶(图3PTPα0.5-1.85μg/ml，LAR125-500ng/ml；T细胞-PTP66-330ng/ml；CD 4550-400ng/ml；YOP50-400ng/ml；SHP-20.3-2.4μg/ml)；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mMDTT。添加15μl 1mM DiFMUP溶液开始磷酸酶反应并在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光，以30秒的时间间隔测定15分钟。酶活性的度量是依赖于蛋白酪氨酸磷酸酶终浓度的荧光(单位RFU))的增加，可图示描述(图3)。
4.测定PTP1B的磷酸酶抑制剂的抑制作用使用DiFMUP检测确定活性化合物2，2-二氧代-2，3-二氢-2，6-苯并[1，2，3]氧杂噻唑-5-基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基甲基)胺的抑制作用的检测在37℃温度下在黑色微量滴定板中进行。提供120μl反应缓冲液，缓冲液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT。向其中添加15μl各种浓度的待检测的抑制剂溶液。添加15μl 1mM DiFMUP溶液开始磷酸酶反应并在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光(单位RFU)，以30秒的时间间隔测定15分钟。酶活性的度量是荧光的增加，可图示描述(图1)。获得的酶活性降低依赖于采用的抑制剂浓度。2，2-二氧代-2，3二氢-2，6-苯并[1，2，3]氧杂噻唑-5-基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基甲基)胺降低PTP1B活性的一半的抑制剂浓度(IC-50)可以确定为3.8μM。确定使用pNPP检测法和孔雀石绿磷酸肽检测法的IC-50值以进行比较。就此而言，pNPP检测法给出5.1μM的IC 50值而孔雀石绿磷酸肽检测方法给出3.9μM的IC 50值。图4包括相应的抑制曲线。
5.磷酸酶抑制剂对PTP1b产生的抑制类型的特征描述反应在37℃下在黑色微量滴定板中进行。提供120μl体积的反应缓冲液，缓冲液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mMHepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT和依赖于以前确定的IC50的抑制剂浓度。添加15μl DiFMUP溶液开始磷酸酶反应，所述溶液含有10倍于终体积中所需的终浓度的底物(图20-200μM)，并在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光，以30秒的时间间隔测定15分钟，直到反应达到饱和。随后，添加10倍过量于以上采用的终浓度的底物并继续监测反应，在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光，以30秒的时间间隔测定15分钟。当存在不可逆抑制剂时不能再次开始反应，但当抑制是可逆类型时则是可能的(图5)。
6.通过时间依赖性孵育描述磷酸酶抑制剂对PTP1b产生的抑制类型的特征反应在37℃下在黑色微量滴定板中进行。提供120μl反应缓冲液，缓冲液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT和依赖于以前确定的IC50的抑制剂浓度。
孵育混合物并在确定的时间点添加15μl DiFMUP溶液开始磷酸酶反应，所述溶液含有10倍于终体积中所需的终浓度的底物(图20-200μM)，并在荧光微量滴定板光度计中在358/455nm下测定荧光，以30秒的时间间隔测定15分钟。
在不可逆抑制剂的存在下，酶活性的降低依赖于预孵育的时间，而在可逆抑制类型的抑制剂的情况下不能观察到该现象。
附图概述图1依赖于PTP1B酶浓度的DiFMUP的裂解图2PTP1B对DiFMUP裂解的浓度依赖性图3依赖于磷酸酪氨酸磷酸酶PTPα、LAR、TCPTP、SHP2、CD45和YOP浓度的DiFMUP的裂解图4测定PTP1B的磷酸酶抑制剂产生的抑制作用图5磷酸酶抑制剂的抑制类型的鉴定图6通过时间依赖性孵育鉴定磷酸酶抑制剂的抑制类型
权利要求
1.一种检测生物学材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括a)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，b)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，c)在含水溶液中，使来自a)的生物学材料或从生物学材料获得的制品与来自b)的DiFMUP接触，d)通过荧光测定检测形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素。
2.如权利要求1的方法，其中，提供至少一种选自LAR、CD 45、YOP、PTPα、PTP1B、TC-PTP、CDC 25、PTEN和SHP 1，2的蛋白酪氨酸磷酸酶作为从生物学材料获得的制品。
3.如权利要求1或2的方法，其中，接触后DiFMUP的浓度是10-250μM。
4.如权利要求3的方法，其中，DiFMUP的浓度是从50至100μM。
5.如权利要求1至4的一项或多项所述的方法，其中，c)中含水溶液的pH在5.0和8.0之间。
6.如权利要求5的方法，其中，pH在6.0和7.5之间。
7.如权利要求5和8的方法，其中pH是7.0。
8.一种鉴定改变蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法，它包括a)提供一种化合物，b)提供生物学材料或从生物学材料获得的制品，c)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，d)在含水溶液中，使来自a)的化合物和来自b)的生物学材料或从生物学材料获得的制品和来自c)的DiFMUP彼此接触，e)通过荧光测定确定形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量，f)比较e)中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量和对照试验中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素的量。
9.如权利要求8的方法，其中所述的蛋白酪氨酸磷酸酶的活性被刺激、抑制或维持。
10.如权利要求8或9的方法，其中的蛋白酪氨酸磷酸酶选自LAR、CD 45、YOP、PTPα、PTP1B、TC-PTP、CDC 25、PTEN和SHP 1，2。
11.通过如权利要求8至10所述的方法进行了鉴定的化合物。
12.如权利要求11的化合物，其中化合物的分子量在0.1和50KDa之间。
13.如权利要求11或12的化合物，其中化合物的分子量在0.1和5KDa之间。
14.如权利要求11-13的化合物，其中化合物的分子量在0.1和3KDa之间。
15.如权利要求11至14的一项或多项所述的化合物，其中化合物是蛋白、氨基酸、多糖、糖、多核苷酸、核苷酸、天然产物或芳香烃化合物。
16.一种药物，包含权利要求11至15所述的至少一种化合物、配制药物的辅助物质和/或聚合物添加剂。
17.权利要求11至14的一项或多项所述的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及使用6，8－二氟－4－甲基－7－羟基香豆素磷酸酯(DiFMUP)检测生物学材料中的蛋白－酪氨酸－磷酸酶的方法。
文档编号G01N21/78GK1612939SQ02826666
公开日2005年5月4日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年1月4日
发明者S·韦尔特, N·特纳格尔斯, S·佩特里 申请人:安万特医药德国有限公司