专利名称：尿β－胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医疗器械领域，具体地是涉及ー种尿￠-胶原降解产物检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
I型胶原占骨有机基质90%以上，并主要在骨中合成。骨骼更新吋，I型胶原被降解，短肽片段进入尿液。这些片段可用尿￠-胶原降解产物检测试剂盒检测，并有文献报道此分析有助于患骨代谢疾病的病人抗骨吸收治疗后的研究。目前，市场上缺少特异性、灵敏度好，且操作简单的相关检测试剂盒。

发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种尿P -胶原降解产物检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下ー种尿P -胶原降解产物检测试剂盒,主要包括有(A)包被CTX-I抗原的微孔板，每个微孔包被的CTX-I抗原量为0. 54-0. 66 U g ；(B)兔抗CTX抗体溶液，兔抗CTX抗体的浓度为3. 8 y g/ml-4. 2 u g/ml (最佳优选浓度为4. 0 ii g/ml)，用量为每微孔100 ill。优选地，所述每个微孔包被的CTX-I抗原量为0. 6 ii g。所述尿3 -胶原降解产物检测试剂盒还包括有过氧化物酶偶联抗体。本发明另一目的是提供ー种尿P -胶原降解产物检测试剂盒的制备方法。实现上述目的的技术方案为ー种尿￠-胶原降解产物检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤I)包被CTX-I抗原的微孔板把浓度为6. 0 ii g/ml的CTX-I抗原在每个微孔板的反应孔中加0. 09-0. Ilml (最优选为0. 1ml)，37°C干燥，4°C密封保存；洗板；封闭；2)制备兔抗CTX抗体溶液将抗体效价达I : 10000的兔抗CTX抗体用IOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，兔抗CTX抗体的浓度为3. 8 u g/m 1-4. 2 u g/ml,4 °C密封保存。优选地，所述微孔板的洗板和封闭为加入CTX-I抗原次日弃去孔内液体，吸去残留液体，加入洗涤液280-300ul/孔，漂洗3次，每次3min ;按200_250ul/孔加入封闭液，37°C封闭1-2小时或在4°C封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。所述尿3 -胶原降解产物检测试剂盒还包括有氧化物酶偶联抗体，该氧化物酶偶联抗体的制备为取羊抗兔抗体冻干粉0. Ig,与IOmL浓度为10mmol/L的PBS缓冲液混合；取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与羊抗兔抗体交联；取制备后的HRP-抗兔抗体，用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，酶偶联抗体的工作浓度为I : 2950-3050，加入防腐剂和稳定剂。
所述兔抗CTX抗体的制备为取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL ;拉颈处死家兔，收集血液，离心取上清液，加入防腐剂和稳定剂，再将抗体纯化，測定抗体效价。所述尿0 -胶原降解产物检测试剂盒采用酶联免疫法，基于抗CTX-I抗体对可溶性CTX-I抗原或包被CTX-I抗原的微孔的竞争性结合。所述尿￠-胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
具体实施例方式本发明所述的尿￠-胶原降解产物检测试剂盒，其检测方法为标准品、质控和待测样本加入微孔板中，再加入抗CTX-I抗体，18-22°C孵育I小时。洗涤微孔板，加入过氧化物酶偶联抗兔抗体，18-22°C下再孵育I小吋。第二次洗涤微孔板后，与生色底物孵育15分钟，终止显色反应，測量吸光度。

实施例I(一 )、本实施例所述的尿P -胶原降解产物检测试剂盒的主要组成成份如下I.微孔板预包被CTX-I抗原的6条微孔板(2x 8孔/每条)，置于ー塑料框架中。2. CTX-I 标准品 0一瓶(IlmL)可直接使用的缓冲溶液。3. CTX-I 标准品 1-5五瓶(0. 3mL/瓶)可直接使用的CTX-I标准品。4.尿质控品两瓶(0. 5mL/瓶)可直接使用的人尿。5. ー抗溶液一瓶(12mL)可直接使用的兔抗CTX-I抗体溶液。6.过氧化物酶偶联抗体一瓶(12mL)可直接使用的辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体，工作浓度为I 3000。7.底物溶液一瓶(12mL)可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性缓冲液中)。请注意该生色底物可带浅蓝色。8.终止液一瓶(12mL)可直接使用的0. 18mol/L硫酸溶液。9 冲洗液50倍一瓶(20mL)含有去污剂和防腐剂的浓缩冲洗缓冲液。用前I : 50的比例稀释。10.封 ロ膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。( ニ)、所述尿0 -胶原降解产物检测试剂盒的制备方法如下—、包被CTX-I抗原的微孔板
CTX-I 抗原购自 Nordic Bioscience Diagnostic A/S 公司。用 0. 05M PH 为 7. 4的PBS缓冲液将CTX-I抗原稀释至CTX-I抗原含量为6. 0 ii g/ml。I)包被把稀释好的CTX-I抗原在每个微孔板的反应孔中加0. lml，37°C干燥2h，4°C密封保存。2)洗板次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(约280-300ul/ 孔
)，漂洗3次，每次3min。洗涤液含0.05 % Tween 20的PBS) ILPBS中加入Tween-20500u L03)封闭按200-250ul/孔加入封闭液，封闭液10mM的PBS缓冲液含10A的BSA，37°C封闭1-2小时，也可4°C封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。ニ、制备ー抗溶液I)抗体制备取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX抗原0. 2mL,第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL。拉颈处死家兔，收集血液，2000r/min离心30min后取上清，加入I %的BSA、0. I %的Tween20和0. 0075%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。抗体纯化用Buffer A(0. 05M 硼酸,4. OM NaCl,pH 9. 0)平衡 rProtein A 亲和层析柱,加少量血清抗体，用BufferB (0. 05M磷酸钠，0. 05M柠檬酸钠，0. 3MNaCl, pH3. 0)洗脱，收集蛋白进行效价评定。抗体效价的測定制备的兔抗CTX抗体用ELISA法測定效价，以OD值P > I. 0的稀释度作为效价，抗体效价达I : 10000。2) ー抗溶液制备取制备后的兔抗CTX抗体，用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，取12mL分装，4°C密封保存。用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合液将兔抗CTX抗体稀释成0. I u g/ml, I. 0 u g/ml, 2. 0 u g/ml, 4. 0 u g/ml, 6. 0 u g/ml, 8. 0 u g/ml, 10. 0 u g/ml 六个浓度，经过综合测试和评估，得到OD值在I. 0时的兔抗CTX抗体浓度作为工作浓度。最終，确定的兔抗CTX抗体的浓度为3. 8-4. 2 u g/ml，本实施例的最佳浓度为4. 0 y g/ml。三、过氧化物酶偶联抗体通用羊抗兔抗体冻干粉购自英国Abcam公司。取羊抗兔抗体冻干粉0. Ig,与IOmL浓度为lOmmol/L的PBS缓冲液混合。取HRP (辣根过氧化物酶)固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与羊抗兔抗体交联。取制备后的HRP-抗兔抗体，用IOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入I %的BSA,0. I %的Tween 20和0. 0075 %的Bronidox5L做为防腐剂和稳定剂，取12mL分装，4°C密封保存。酶标记抗体工作浓度的选择酶结合物使用稀释度测定先将浓度6. 0 ii g/ml的抗原包被固相载体，洗涤后加一系列不同稀释度(I 1000，I 2000，I 3000，I 4000，I 5000,1 6000,1 7000)的酶结合物进行孵育，洗涤后加底物显色，加终止液终止反应。在酶标比色计中測定不同稀释度酶结合物的OD值，选择OD值> I. 0的那个酶结合物稀释度即为酶结合物的使用浓度。最终确定本实施例的酶标抗体最佳工作浓度为I : 3000。四、标准品与质控品的制备
I)来源CTX尿液样本取自某认证医院健康人群，_20°C下保存。2) CTX样本制备取CTX尿液样本,2000r/min离心IOmin后取上清,与10mmol/L的PBS缓冲液等体积混合，并加入I %的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。3)质控品制备从CTX尿液样本中取高值、低值样本，制备内部质控。8000r/min离心IOmin后取上清，与10mmol/L的PBS缓冲液等体积混合,并加入I %的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，各取0. 5mL分装，4°C密封保存。低值内部质控通常约为1000-1300ii g/L,高值内部质控通常约为2200-3500 u g/L。4)标准品制备标准品0取IlmL浓度10mmol/L的PBS缓冲液，加入I %的BSA和0. 018 %的BronidoX5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。标准品1-5取已配制的CTX样本混合溶液，分别用10mmol/L的PBS缓冲液稀释至CTX 浓度为 IOOii g/L、300 ii g/L、850 ii g/L、2500 ii g/L 和 7500 y g/L。各取 0. 3mL 分装，4°C
密封保存。底物溶液、終止液、冲洗液和封ロ膜等可以按照常规购买。实施例2 :运用实施例I所述的检测试剂盒对样品进行检测使用前，将所有溶液平衡至室温。在18 22°C下进行实验。确定实验所需微孔板数量。另外，每轮实验共需要16孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。I.加入标准、质控和待测样本移取15iU标准品，质控或待测样本于微孔板中。2.微孔板孵育向各孔加入100 ill —抗溶液。用封ロ膜密封微孔板，在18_22°C，以300rpm在微孔板振荡器上孵育60 ±5分钟。3.冲洗冲洗液50x以I体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。用稀释的冲洗缓冲液手工清洗微孔板5次。用洗板机，请參照产品说明或实验室指南。通常清洗3-5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔板中的溶液倒干净。4.与过氧化物酶偶联抗体孵育向各孔加入IOOiU过氧化物酶偶联抗体。用封ロ膜密封微孔板，在18_22°C以300rpm在振荡器上孵育60 ±5分钟。5.冲洗见第3步。6.与底物溶液孵育向各孔加入100微升底物溶液，用封ロ膜密封，18_22°C，在振荡器上(300rpm)避光孵育15±2分钟。不要直接从盛TMB底物的小瓶吸取，将所需体积的TMB移入干净容器中使用。容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回瓶中。7.终止显色反应向各孔加入100微升终止液。 8.测定吸光度在2小时内以650nm为參照测定450nm下的吸光度。检测范围如果待测样本的吸光度低于标准品5，应该用标准品0稀释样本并重新分析。參考值(參考范围)各类人群的平均值和标准差举例如下。所有样本均采自第二次晨尿。
权利要求
1.ー种尿3-胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，主要包括有 (A)包被有CTX-I抗原的微孔板，每个微孔包被的CTX-I抗原量为0.54-0. 66 u g ； (B)兔抗CTX抗体溶液，其中兔抗CTX抗体的浓度为3.8 ii g/ml-42 u g/ml，用量为每微孔 IOOu I0
2.根据权利要求I所述的尿￠-胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述每个微孔包被的CTX-I抗原量为0.6 Ug0
3.根据权利要求I所述的尿￠-胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述兔抗CTX抗体的浓度为4. Oii g/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的尿3-胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述尿@ -胶原降解产物检测试剂盒还包括有过氧化物酶偶联抗体，酶偶联抗体的工作浓度为I 2950-3050。
5.ー种尿￠-胶原降解产物检测试剂盒的制备方法，其特征是，主要包括以下步骤 1)包被CTX-I抗原的微孔板把浓度为6.0 ii g/ml的CTX-I抗原在每个微孔板的反应孔中加0. 09-0. 11ml，37°C干燥，4°C密封保存；洗板；封闭； 2)制备兔抗CTX抗体溶液将兔抗CTX抗体用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，兔抗CTX抗体的浓度为3. 8 ii g/m 1-4. 2 u g/ml，4°C密封保存。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述微孔板的洗板和封闭为加入CTX-I抗原的次日，弃去孔内液体，吸去残留液体，加入洗涤液280-300ul/孔，漂洗3次，每次3min ;按200-250ul/孔加入封闭液，37°C封闭1_2小时或在4°C封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤I)中，加入CTX-I抗原的量为0.Iml ;所述兔抗CTX抗体的浓度为4. 0 ii g/ml。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述尿3-胶原降解产物检测试剂盒还包括有氧化物酶偶联抗体，该氧化物酶偶联抗体的制备为取羊抗兔抗体冻干粉0. Ig,与IOml浓度为lOmmol/L的PBS缓冲液混合；取HRP固体用去离子水稀释为5mg/ml，采用简易过碘酸钠法将HRP与羊抗兔抗体交联；取制备后的HRP-抗兔抗体，用lOmmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，酶偶联抗体的工作浓度为I : 2950-3050，加入防腐剂和稳定剂。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述兔抗CTX抗体的制备为取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX抗原0. 2ml，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4ml ;拉颈处死家兔，收集血液，离心取上清液，加入防腐剂和稳定剂,再将抗体纯化，測定抗体效价。
全文摘要
本发明公开了一种尿β-胶原降解产物检测试剂盒，主要包括有包被CTX-I抗原的微孔板，每个微孔包被的CTX-I抗原量为0.48-7.2μg；兔抗CTX抗体溶液，兔抗CTX抗体效价达1∶10000。所述尿β-胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
文档编号G01N33/68GK102650637SQ20111004554
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者郭志程 申请人:广州固康生物科技有限公司