专利名称：采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法
技术领域：
本发明属于水质成分在线检测分析技术领域，涉及水中的藻类和有色可溶性有 机物(Chromophoric dissolved organic matter，CD0M)的检测方法，具体地说是一种采用 流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法。
背景技术：
藻类指是原生生物界一类真核生物(有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类)。主要 水生，无维管束，能进行光合作用。其中含有藻胆蛋白，其主要功能是作为光合作用的捕光 色素复合体，由色素基团藻胆素和载体蛋白共价结合而成。它分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻 红蓝蛋白和别藻蓝蛋白四种，由于它们在不同藻类中的含量不同，致使有的藻类呈现红色， 有的则为绿色。国内蓝藻中含有的蛋白以藻蓝蛋白为主，该蛋白的最大吸收峰在620nm附 近，能发射强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率。蓝藻水华是由于水体中氮、磷等营养物质大量累积，在气候条件适宜情况下，快速 繁殖并在水面聚集而产生的自然灾害现象。蓝细菌为单细胞生物，个体比细菌大，一般直径 或线度为;Γ15微米。蓝藻可在短时间内迅速繁殖，使水体透明度显著下降。蓝藻生长还加 快了水体氧的消耗，使水体缺氧，导致鱼类和其它水生生物大量死亡，破坏生态功能和生物 多样性。此外，某些藻类本身含有藻毒素，会危及饮水安全。如蓝藻含有神经毒素，可通过 食物链不断富集。人们吃了含有神经毒素的鱼类、螃蟹等，将加速人脑神经退化、肌肉萎缩， 加大老人痴呆症发病风险；其中微囊藻毒素毒性非常强，将严重损害人的肝脏，导致肝癌。湖泊是人类最重要的水资源之一，在湖泊周围也是我国人口和工业聚集区。因为 人类活动的影响，湖泊的富营养化日趋严重，其直接后果就是蓝藻水华的发生，2007年太湖 爆发的蓝藻水华严重影响了周边居民的正常生活。2009年山东境内多处湖水暴发蓝藻。今 年9月湖北武汉东湖的子湖水果湖暴发大量蓝藻，沿湖行走就能闻到强烈臭味。同年江西 南昌市军山湖水质明显变差，蓝藻暴发，连村民家养的牛都不愿意喝湖水了。蓝藻已成为我 国湖泊、河流等水体的主要污染之一。如何在蓝藻水华爆发前进行准确的预警变得非常重要。目前我国对蓝藻的监测主 要采用显微计数、叶绿素含量测定、卫星遥感等技术。显微计数需要由专业人员操作，花费 的时间长，过程复杂，并且分析样品的效率低。叶绿素含量测定是一种相对较快速简单的 测量技术，但传统的测量方法多为现场抽滤后带回实验室抽提，然后进行分光光度计分析、 荧光分光光度计分析或高效液相色普(HPLC)分析，但这种技术最快也需要广2天才能获得 结果。这两种方法均不能立即反映出水体中的藻类信息，而是要经过一段分析时间，从而降 低了生物监测的时效性，大大影响有害蓝藻的监测/预警。卫星遥感具备监测范围广、数据 多、不受地理位置和人为条件限制等优点，但其容易受天气条件影响，且往往需要藻类细胞 累积到一定程度才能监测到，往往达不到预警的效果，而且费用高，数据分析复杂。南非的 湖泊学家保罗·奥博郝斯特博士研究出一种可以预测有毒的蓝绿藻在淡水环境(如江河湖泊)中暴发的方法，其采用水蛭作为生物指示物，因为与某些大型无脊椎动物相反，水蛭可 以在被蓝藻释放的有毒物质污染的水中生存，它们的存在往往是水质差的证明。如果水蛭 出现在比较稠密的蓝藻周围，说明这种蓝藻极有可能是有毒的。但水蛭不能说明水体中的 毒性水平到底有多高。同时这种方法需要专业的人员进行操作，耗时长，方法的通用性差。要想在蓝藻水华爆发前进行准确的预警，对水中蓝藻含量进行连续监测是切实可 行的途径。目前的连续监测主要依靠流失细胞仪来监测分析，流式细胞仪检测的基本原理 为根据流体动力学原理让液体中的颗粒(包括细胞)逐一通过激光束(检测区)，激光照射 到颗粒上会引起光的散射，如果颗粒(如藻细胞)含有色素还可以发出荧光，这些散射光和 荧光被检测器收集后转换成电信号存储下来，并利用软件进行自动分析。水中的浮游植物 细胞做为一个个颗粒，当然可以进行流式细胞计数，由此即可监测水中蓝藻的含量。有色可溶个生有机物(Chromophoric dissolved organic matter, CD0M)存在于所 有水体中，又称黄质。它是溶解性有机物库的重要组成部分。由腐殖酸，芳烃聚合物等一系 列物质组成，主要是土壤和水生植物降解的产物，在内陆水体和海湾沿岸CDOM以河流陆源 排放为主，在远海CDOM浓度非常低，其来源主要是海水中低等植物残体腐烂降解后形成。 由于有色可溶性有机物(CDOM)中含有丰富的碳、氮、磷等湖泊生源要素，在湖泊各种物理， 化学和生物反应以及藻类暴发过程中都扮演了重要的角色。有色可溶性有机物(CDOM)存在于所有水体中，其浓度不能直接测定，现在常用的 检测方法是用355nm的波长的光照射CD0M，以其荧光数值作为浓度的单位。目前该测试只 能在荧光分光光度计上完成，测试使用的专业设备不仅价格昂贵，而且体积庞大不能移动， 测试结果不连续，不能实现对有色可溶性有机物的在线检测。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种采用流式细胞术检测藻 类和有色可溶性有机物的方法，该方法检测简便、快速，可同时在线连续检测水质中的藻类 和有色可溶性有机物(CD0M)，对水体的富营养化进行预警检测。本发明的目的是通过以下的技术方案实现的
采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，特征在于包括
(1)藻类检测首先用进样器采集水样，滤除水样中粒径大于Imm的泥沙颗粒；然后在 进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大 的砂粒作为待检测颗粒；最后采用流式细胞术对待检测颗粒进行测定，待检测颗粒进入藻 类检测区，通过与其呈90度角的激光束照射，激光束照射到藻类上会引起光的散射，由于 藻类细胞中含有可以吸收激光束并发射荧光的藻胆蛋白色素还可以发出荧光，检测系统检 测颗粒的前向散射光(FWC)、侧向散射光(SWC)和多色荧光，这些光信号被检测系统收集储 存，并利用软件进行自动分析，以获得藻类细胞荧光信号强度和藻类细胞大小和单位体积 内个数等相关信息；
(2)有色可溶性有机物(CDOM)检测将已经被检测的藻类等颗粒滤除，滤液进入CDOM 检测区，通过特定波长的激光束照射，检测系统收集滤液在特定波长范围内的光吸收信号 和荧光信号，并将信号输送到智能仪表；智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，进 行有色可溶性有机物(CDOM)分析。
作为本发明的进一步改进，所述进样器采集水样的进样流速为广2 cm/So作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中的藻类检测采用波长范围为 30(T800nm的激光束照射。作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的有色可溶性有机物检测采用波长为 355nm的激光束照射滤液，所述检测系统收集滤液在38(T600nm波长范围内的光吸收信号 和荧光信号。作为本发明的进一步改进，所述有色可溶性有机物(CDOM)分析方法为根据滤液 在特定波长范围内的光吸收信号和荧光信号，计算吸光度D ( λ )，然后结合光程路径r，根 据下面的公式(1)计算获得波长λ未校正的吸收系数α (λ)'，该吸收系数α (λ)'用 于表示CDOM的浓度；
α (λ ) ‘ =2. 303D(A )/r(1)
式(1)中λ为波长；α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，其单位为(m-l);DU)为 吸光度；r为光程路径，其单位为m。作为本发明的进一步改进，由于滤液还有可能残留细小颗粒，可能会引起散射，所 以需要获得的波长λ未校正的吸收系数α (λ)'进行校正，以消除滤液中可能残留细小 颗粒而引起的散射效应，校正后获得波长λ的吸收系数α (λ)；校正根据下面的公式(2) 进行；
α (λ) = α (λ)' -α (750) X λ/750(2)
式(2)中α (λ)为波长λ的吸收系数，α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，它们 的单位都为(m-1)。本发明与现有技术相比优点在于
(1)本发明能够同时对水中的藻类和有色可溶性有机物(CDOM)进行在线检测分析，在 一次测量过程中，能够同时检测出藻类浓度和CDOM浓度，荧光值，吸收系数等参数，能够对 水质的富营养度进行预警，提前预防蓝藻水华的爆发；
(2)本发明的流式细胞术检测无论采用循环鞘液方式或非循环鞘液方式，都可以有效 检测CD0M，并提高藻类检测结果的精确性；
(3)本发明在增加有限使用成本的条件下，有助于获取更多的水质信息。


图1是采用流式细胞术在线检测藻类和有色可溶性有机物(CDOM)的流程示意图。图2是采用流式细胞术对水中的颗粒进行在线检测分析的结果图。图3是采用流式细胞术对水中的蓝藻进行在线检测分析的结果图。图4是采用流式细胞术在线对冬季水中的CDOM进行一个月的连续检测分析结果 图。图5是采用流式细胞术在线对夏季水中的CDOM进行一个月的连续检测分析结果 图。图6是图4、图5中的分析结果对比情况示意图；图中，曲线1为冬季检测分析结 果、曲线2为夏季检测分析结果。
具体实施例方式下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明，下述实施例仅用于对本发明 作进一步的举例说明，而不能理解为对说明书作出任何限定。本发明采用流式细胞术对藻类和CDOM进行在线连续检测。检测对象中藻类中含 有藻胆蛋白，其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体，由色素基团藻胆素和载体蛋 白共价结合而成。它分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白四种，由于它们在 不同藻类中的含量不同，致使有的藻类呈现红色，有的则为绿色。国内蓝藻中含有的蛋白以 藻蓝蛋白为主，该蛋白的最大吸收峰在620nm附近，能发射强烈的荧光，具有很好的吸光性 能和很高的量子产率。检测对象中的有色可溶性有机物(CDOM)的检测是利用355nm波长 的激光束照射，收集其在38(T600nm波长范围内的光吸收信号和荧光信号。相关研究表明， 即便⑶OM来源和化学组成差异万千，⑶OM吸收与荧光强度均存在显著线性关系，因此可 以利用其荧光强度和吸收的线性关系，反演得到CDOM吸收系数。如图1所示，本发明的一个实施例的具体操作如下 (1)藻类检测
(a)样品采集与处理用进样器采集水样，进样流速为广2 cm/s，水样被进样器采集后， 首先滤除粒径大于Imm的泥沙颗粒，然后在进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的 浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大的砂粒作为待检测颗粒，进入流动室，进行流式 细胞计数和其它分析；对于粒径介于5(Γ100 μ m的砂粒而言，它们的沉降速率大于进样流 速，因此不会被进样器吸入。(b)检测步骤(a)中的待检测颗粒被不含任何颗粒的鞘液包裹着流过流动室，所 述鞘液可以采用纯净水、PH值范围在2 11之间的磷酸盐缓冲液或pH值范围在2 11之间的 碳酸盐缓冲液，本实施例中，鞘液采用纯净水；鞘液包绕着待检测颗粒高速流动，组成一个 圆形的流束，待检测颗粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过藻类检测区；这个过程中，颗 粒间的距离被拉开，当颗粒被与之呈90度角的激光束(激光束采用波长为488nm的激光束) 照射时，颗粒的散射光和荧光会被检测系统检测；激光束照射到藻类上会引起光的散射，由 于藻类细胞中含有可以吸收激光束并发射荧光的藻胆蛋白色素还可以发出荧光，检测系统 检测颗粒的前向散射光(FWC)、侧向散射光(SWC)和多色荧光，这些光信号被检测系统收集 储存，并利用软件进行自动分析，以获得藻类细胞荧光信号强度和藻类细胞大小和单位体 积内个数等相关信息；检测获得的二维点图如图2所示，由图中可以看出检测水样中的藻 类直径集中10 μ m以下，在1(Γ20 μ m的较少。因藻类中含有的藻红蛋白在激光照射下会有 黄绿色荧光产生，通过检测样品通过流动室后产生的荧光信号(Fluorescence Light)和前 向散射光信号(Forward Scatter)，可以检测出水体中蓝藻的相关信息，检测获得的二维点 图如图3所示，由图中可以看出蓝藻具有较强的荧光。( 2 )有色可溶性有机物(⑶0M)检测
(a)滤除藻类在所述流动室内的藻类检测区后设置一个过滤器，将已经被检测的藻类 等物质滤除，滤液在流动室内继续流动并通过CDOM检测区；
(b)检测步骤(a)过滤后的滤液流过⑶OM检测区，被波长为355nm的激光束照射，检 测系统收集其在38(T600nm的波长范围内的光吸收信号和荧光信号，并将信号输送到智能 仪表；(C)结果输出与计算智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，计算吸光度 D(A)，然后结合光程路径r，根据下面的公式(1)计算获得波长λ未校正的吸收系数 α (λ)'，该吸收系数α (λ)'用于表示CDOM的浓度； α (λ ) ‘ =2. 303D(A )/r(1)
式(1)中λ为波长；α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，其单位为(m-l);DU)为 吸光度；r为光程路径，其单位为m。(d)校正计算由于上述步骤(3)中的滤液还有可能残留细小颗粒，可能会引起散 射，所以需要对步骤(5)中获得的波长λ未校正的吸收系数α (λ)'进行校正，以消除滤 液中可能残留细小颗粒而引起的散射效应，校正后获得波长λ的吸收系数α (λ)，校正根 据下面的公式(2)进行；
α (λ) = α (λ)' -α (750) X λ/750(2)
式(2)中α (λ)为波长λ的吸收系数，α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，它们 的单位都为(m-1)。本发明在冬季和夏季分别对太湖水质的CDOM进行了连续一个月的在线连续检 测，检测及计算结果如表1和表2所示
表1 冬季(2010年1月20号 2010年2月20号)以检测天数为横轴、吸收系数为纵轴，生成图4，分析图4可知水质的有色可溶性有机 物吸收系数的变化范围在2. 3Γ4. 72之间，最高值出现在24日左右。
表2 夏季(2010年7月20号 2010年8月20号)
权利要求
1.采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于包括(1)藻类检测首先用进样器采集水样，滤除水样中粒径大于Irnm的泥沙颗粒；然后在 进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大 的砂粒作为待检测颗粒；最后采用流式细胞术对待检测颗粒进行测定，待检测颗粒进入藻 类检测区，通过与其呈90度角的激光束照射，激光束照射到藻类上会引起光的散射，由于 藻类细胞中含有可以吸收激光束并发射荧光的藻胆蛋白色素还可以发出荧光，检测系统检 测颗粒的前向散射光、侧向散射光和多色荧光，这些光信号被检测系统收集储存，并利用软 件进行自动分析，以获得藻类细胞荧光信号强度和藻类细胞大小和单位体积内个数等相关 fn息；(2)有色可溶性有机物检测将已经被检测的藻类颗粒滤除，滤液进入CDOM检测区， 通过特定波长的激光束照射，检测系统收集滤液在特定波长范围内的光吸收信号和荧光信 号，并将信号输送到智能仪表；智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，进行有色可 溶性有机物分析。
2.如权利要求1所述的采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征 在于所述进样器采集水样的进样流速为广2 cm/So
3.如权利要求1所述的采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征 在于所述步骤(1)中的藻类检测采用波长范围为30(T800nm的激光束照射。
4.如权利要求1所述的采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征 在于所述步骤(2)中的有色可溶性有机物检测采用波长为355nm的激光束照射滤液，所述 检测系统收集滤液在38(T600nm波长范围内的光吸收信号和荧光信号。
5.如权利要求1所述的采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征 在于所述有色可溶性有机物分析方法为根据滤液在特定波长范围内的光吸收信号和荧 光信号，计算吸光度 (λ)，然后结合光程路径r，根据下面的公式(1)计算获得波长λ未 校正的吸收系数α (λ)'，该吸收系数α (λ)'用于表示CDOM的浓度；α (λ ) ‘ =2. 303D(A )/r(1)式(1)中λ为波长；α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，其单位为(m-l);DU)为 吸光度；r为光程路径，其单位为m。
6.如权利要求5所述的采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征 在于由于滤液还有可能残留细小颗粒，可能会引起散射，所以需要获得的波长λ未校正 的吸收系数α (λ)'进行校正，以消除滤液中可能残留细小颗粒而引起的散射效应，校正 后获得波长λ的吸收系数α (λ)；校正根据下面的公式(2)进行；α (λ ) = α (λ ) ‘ -α (750) X λ/750(2)式(2)中α (λ)为波长λ的吸收系数，α (λ)'为波长λ未校正的吸收系数，它们 的单位都为(m-1)。
全文摘要
本发明涉及一种采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法。其包括(1)藻类检测待检测颗粒通过与其呈90度角的激光束照射，检测系统检测颗粒的前向散射光(FWC)、侧向散射光(SWC)和多色荧光，并利用软件进行自动分析，以获得藻类细胞荧光信号强度和藻类细胞大小和单位体积内个数等相关信息；(2)有色可溶性有机物检测将已经被检测的藻类等颗粒滤除，滤液通过波长为355nm的激光束照射，检测系统收集滤液在特定波长范围内的光吸收信号和荧光信号，智能仪表进行有色可溶性有机物分析。本发检测简便、快速，可同时在线连续检测水质中的藻类和有色可溶性有机物(CDOM)，对水体的富营养化进行预警检测。
文档编号G01N15/10GK102128776SQ20101059575
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者孔巢城, 楚建军, 邵建辉, 陈力 申请人:无锡荣兴科技有限公司