专利名称：一种基于微流控芯片的细胞分选方法及其专用芯片的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及在微流控芯片上实现细胞分选的方法。
背景技术：
细胞分选是从复杂环境中获取性质均一的目标细胞的必要手段。现阶段实现细胞分选的主要工具是流式细胞仪。现有商品化流式细胞仪已在各医院、科研院所得到广泛应用。但该设备明显的缺点是价格昂贵，结构复杂，体积庞大，不易普及。微流控芯片的出现有望将细胞分选仪微型化。
在微流控芯片上实现细胞分选的途径按机理来分主要有两大类。一种是以反馈信号判断的方式决定细胞流向的分选方法。比如文献[1 Fu AY，Spence C，Scherer A et al..Nat.Biotech.1999，17，1109-1111。2 Fu AY，Chou HP，Spence C et al..Anal.Chem.2002，74，2451-2457。3 Wolff A，Perch-Nielsen IR，Larsen UD et al..LabChip，2003，3，22-27]报道以激光激发出的荧光作为细胞流向判据的荧光激发细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS)方法。该方法原理与流式细胞仪类似。除荧光信号外，文献[4 Gawad S，Schild L，Renaud Ph，Lab on a Chip，2001，1，76-82]以细胞穿过通道内电极时引起的电阻变化作为区分目标细胞的判据。上述方法中收集到的与细胞相关的信息(如荧光，散射光，电子信号等)经过判断作为反馈信号影响驱动力的施加(力的大小，方向等)，从而将满足预先设置判据的细胞在某种驱动力(电动力、压力等)下流向指定方向。
另一类分选方式无需信号反馈，主要依靠细胞自身的某种差异在某种力场中的放大来完成细胞分选。比如，细胞表面结合磁材料的能力差异可以导致细胞在磁场中的分选[5 Sun L，Zborowski W，Moore LR et al..Cytometry，1998，33，469-475]。
无论是上述哪一类方法，都没有真正在微流控芯片上实现高效细胞分选，目前尚缺少一种普遍认可的分选方式。

发明内容
本发明的目的在于提供一种与现有分选方案不同的在微流控芯片上完成细胞分选的方法，此方法无需信号反馈，也不需将细胞预先标记上各种分子(如磁性材料分子)。
本发明提供了一种基于微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁两侧施以局部电场，使细胞在通道横截面按照表面电荷性质不同而重新排列；再在通道的十字交叉处施以相互垂直的电动力和压力，相互垂直的双力作用将使重新定位的细胞流向不同空间，从而实现细胞的分选。
本发明基于微流控芯片的细胞分选方法中，局部电场强度在100V/cm到1000V/cm，加在细胞上的压力从1帕到1000帕；电场强度从10V/cm到1000V/cm。
本发明基于的原理是，压力驱动下的细胞进入进样通道，向分选区(十字形交叉区)流动，其在进样通道横截面的位置为随机分布。流经局部电场区时，细胞表面电荷与局部电场相互作用，使细胞在进样通道横截面的位置按照细胞表面电荷密度的大小重新排布。经过重新定位的细胞在压力作用下继续流向分选区。分选区由相互垂直的连通微通道构成，其中流体流动驱动力分别为电动力和压力，二力垂直。流至分选区的细胞在电动力和压力联合作用下，按照在进样通道横截面的位置不同流向不同空间。
本发明一种专门用于上述细胞分选方法的微流控芯片，其特征在于该微流控芯片具有双层结构；一层的表面刻有十字型通道，垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池；另一层的表面镀有成对的定位电极；上述两层相对封接后，所述电极恰好位于所述垂直微通道内。
本发明中进样通道内定位电极数目可以是一对也可以是多对如图2，探入通道内电极宽度从几个微米到几厘米。
本发明微流控芯片中，水平通道与垂直通道的交叉区域可以是一个或多个(如图9)。电极可以直接相对也可以错开一定位置(如图8)。芯片材料可以是多种聚合物，玻璃，陶瓷或它们的复合体。通道宽度在100微米到2000微米之间。细胞可以是未经任何处理的细胞，也可以是标有各种抗体或其他分子的细胞。
对于非细胞的带电颗粒(直径在几十微米)本发明同样适用。


图1为芯片结构图，浅色部分为分选通道和储液池，深色部分为定位电极；图2为在压力和局部电场力作用下细胞流向十字交叉处轨迹示意；图3为在电动力、压力联合驱动下细胞沿压力方向流动过程示意；图4为在电动力、压力联合驱动下细胞双向流动过程示意；图5为在电动力、压力联合驱动下细胞沿电动力方向流动过程示意；图6为在电动力、压力联合驱动下细胞沿压力逆方向流动过程示意；图7为经不同处理的鲤鱼血红细胞速度迁移图；图8另一种定位位置；
图9串联两个十字交叉区的芯片。
具体实施例方式以十字型通道的微流控芯片为操作平台，垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池。水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池，并分别接高电压和接地。芯片由上下两层组成。下层镀上所需形状和位置的铂金电极，与上层封接后，电极位于微通道内。该电极称为定位电极，见图1；将缓冲液加入到缓冲池和废液池中，使缓冲液充满所有通道，然后将细胞液加入细胞池中，在压力的作用下，细胞从细胞池流向空池；流经定位电极的细胞在局部电场作用下向通道壁面移动，使不同荷电性质和密度的细胞在通道径向重新排布，细胞流动轨迹见示意图2，图2中的浅色细胞和深色细胞经过定位电场后在通道内径向位置改变；在压力和电动力的作用下，流至十字交叉处的细胞流动方向按照两种力的大小比例可以划分为压力方向流，双向流，电动力方向流，压力方向逆流等四个区间，见示意图3-6。在双向流区间(图4)，细胞的流动方向取决于进入交叉区域时细胞所处的位置，处于不同径向位置的细胞在双力作用下流向不同方向。
缓冲液池和废液池先后加入13微升10mMPBS缓冲液，显微镜下观察各通道中均连续充满缓冲液后，在缓冲液池和废液池插入铂金电极，分别接100V和地。进样通道上的三对定位电极均接入相同方向电势差5V，从而在通道径向产生电场强度为50V/cm。加13微升鲤鱼红细胞液(细胞浓度约108个mL)于细胞池。细胞在静压力作用下向空池流动。流经定位电极时细胞偏离原压力驱动轨迹，更靠近通道侧壁见图2。经不同处理的鲤鱼红细胞在电场下迁移速度的差别见图7和表1。
交叉区域电场强度为50V/cm，保持交叉区域内为双向流动区间。经通道内定位电场重新排位的细胞流过交叉区时，根据细胞所处位置向不同通道流动(见图4)。
表1细胞处理事项和对应细胞淌度

权利要求
1.一种基于微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁两侧施以局部电场，使细胞在通道横截面按照表面电荷性质不同而重新排列；再在通道的十字交叉处施以相互垂直的电动力和压力，相互垂直的双力作用将使重新定位的细胞流向不同空间，从而实现细胞的分选。
2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于局部电场强度在100V/cm到1000V/cm，加在细胞上的压力从1帕到1000帕；电场从10V/cm到1000V/cm。
3.按照权利要求1所述基于微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于所述细胞为标有各种抗体或其他分子的细胞。
4.一种专门用于权利要求1、2或3所述细胞分选方法的微流控芯片，其特征在于该微流控芯片具有双层结构；一层的表面刻有十字型通道，垂直通道两端的液池分别为细胞池和空池，水平通道两端的液池分别为缓冲池和废液池；另一层的表面镀有成对的定位电极；上述两层相对封接后，所述电极恰好位于所述垂直微通道内。
5.按照权利要求4所述用于细胞分选方法的微流控芯片，其特征在于所述通道宽度在100微米到2000微米之间。
6.按照权利要求5所述用于细胞分选方法的微流控芯片，其特征在于所述探入到通道内的定位电极的宽度从1个微米到10厘米。
7.按照权利要求4、5或6所述用于细胞分选方法的微流控芯片，其特征在于所述芯片材料是多种聚合物，玻璃，陶瓷或它们的复合体。
全文摘要
一种基于微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁两侧施以局部电场，使细胞在通道横截面按照表面电荷性质不同而重新排列；再在通道的十字交叉处施以相互垂直的电动力和压力，相互垂直的双力作用将使重新定位的细胞流向不同空间，从而实现细胞的分选。本发明方法以细胞自身表面电荷密度的差异导致其静电场中的受力差异为分选基础，以压力和电动力的垂直结合为分选驱动力，其中进样通道内部的局部电场使细胞按照表面电荷密度在进样通道径向上重新分布，相互垂直的双力作用将使细胞流向不同空间，从而自动完成细胞分选过程。此方法无需信号反馈，也不需将细胞预先标记上各种分子。
文档编号G01N27/00GK1566951SQ0313346
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月16日 优先权日2003年6月16日
发明者盖宏伟, 於林芬, 戴忠鹏, 罗勇, 马银法, 林炳承 申请人:中国科学院大连化学物理研究所