专利名称：一种检测他达拉非及其衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及检测他达拉非及其衍生物的方法。
背景技术：
他达拉非是美国礼来公司研制开发的第二代磷酸二酯酶抑制剂，临床上用于治疗男性勃起功能障碍(ED)，其结构式如式I所示，分子式为C22H19N3O4，商品名称为希爱力，属于处方药。他达拉非与其他两种治疗ED药物西地那非、伐地那非相比起效迅速、药效时间长，目前已多次在食品、壮阳类中药制剂或保健食品中检出，甚至检出其衍生物，对于不知情消费者的危害是不言而喻的，另外也造成了中药制剂和保健食品市场的混乱状况。
目前食品、药品检验行业尚无他达拉非快速检验方法的发布，对于药店和基层药检所，由于缺乏先进的检验设备，甄别食品、中药制剂和保健食品中是否含有违禁药物很困难，因此建立简单、准确、快速的鉴别方法具有特别的意义。此外，某些生产商为了规避执法部门的检查，不断制造上述化合物的衍生物，即使依靠HPLC方法也无法识别新衍生物。

发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、灵敏的检测他达拉非及其衍生物的方法。
本发明所提供的检测他达拉非及其衍生物的方法，包括如下步骤1)显色反应向待测样品加入钼酸钠的硫酸溶液，进行显色反应；2)结果判断当显色反应呈蓝紫色时，说明待测样品中含有他达拉非或其衍生物。
其中，步骤1)所述钼酸钠的硫酸溶液的质量浓度为0.09％-0.11％，优选为0.1％。
本发明方法不仅可以检测他达拉非，还可以检测他达拉非衍生物，其衍生物主要是含N杂环上的甲基被氨基(-NH2)取代，被乙基(-CH2CH3)、羟甲基(-CH2OH)取代的衍生物。检测他达拉非衍生物的过程以及阳性结果判断与他达拉非的检测过程相同。
为了能排除样品辅料对于显色反应结果判断的干扰，显色反应前还可将待测样品制备为供试品进行检测对于固体待测样品，供试品制备过程如下在研细或剪碎的样品中加入氯仿，研磨使溶解，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品。
对于液体待测样品，供试品制备过程如下量取待测样品置分液漏斗中，加氯仿振摇提取30秒，静置使分层，分取氯仿层，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品。
本发明采用他达拉非的专属性费勒德反应来检测他达拉非，具有如下优点(1)快速、简便通常情况下，1分钟之内即可知道结果；即使由于样品辅料有干扰使结果判断模糊，需要将样品用少量三氯甲烷溶解(2分钟)、过滤(2分钟)，滤液吹干或蒸干(10分钟)，然后加入显色剂，整个操作也可在30分钟内完成。相比于液相色谱、液质联用方法(至少5小时)简便快捷得多，并且无需对照品。
(2)反应灵敏最小检出量可达到1μg，而一次服用剂量样品中(1～2片或粒、丸等)掺杂他达拉非的量至少为10mg(10000μg)以上，美国产他达拉非片有两种规格，25mg和50mg，因此用该方法检查食品、中药制剂或保健品中是否掺杂违禁成分具有足够的灵敏度。
(3)专属性强、准确率高根据方法验证结果，片剂、胶囊、蜜丸、酒剂等剂型的常用辅料对他达拉非的检出均无干扰；同法检查了与他达拉非有某些相似结构的化学物质，未发现有与他达拉非产生相同的颜色反应。
(4)适用范围广该方法可以用于液体、固体，无论是食品、中药制剂、保健食品均可使用该方法。
(5)显色试剂配制简单，可长期储存。
具体实施例方式
实施例1、检测他达拉非的方法方法原理他达拉非能与钼硫酸(钼酸钠与硫酸反应而得)进行Frhde(费勒德)反应，生成蓝紫色溶液。虽然也有其他一些特定的生物碱能发生Frhde反应，但生成的溶液颜色由于结构上的差异而有区别。其他特定生物碱Frhde反应颜色见表1表1其他特定生物碱Frhde反应颜色

Frhde反应为吗啡类生物碱的特定反应，Frhde反应所形成的颜色视这类生物碱的结构差异而有明显不同(见表1)；并且多数生物碱Frhde反应显色为渐变过程，例如利血平，加入0.1％钼酸钠硫酸溶液后迅速由黄色变为蓝色，而他达拉非，蓝紫色可稳定较长时间；其次，某些生物碱使用0.1％钼酸钠硫酸溶液不能发生Frhde(费勒德)反应，例如吗啡，必须使用1％钼酸铵硫酸溶液才能显色。
综上所述，他达拉非的Frhde反应基本可与其他化学物质区分，可满足化学鉴别试验的专属性要求。
本发明检测他达拉非的方法具体操作如下一、取样量对于不同种类的待测样品，推荐取样量见下表2。
表2推荐取样表


二、供试品制备固体供试品制备在研细或剪碎的样品中加入5～10ml氯仿，研磨使溶解，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品；液体供试品制备 量取适量供试品，置分液漏斗中，加氯仿5～10ml，振摇提取30秒，静置使分层，分取氯仿，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品。
三、显色反应向上述残渣加入0.1％钼酸钠的硫酸溶液1滴，进行显色反应。
四、阳性结果判断当待测样品中含有他达拉非或其衍生物时，加入显色剂后应立即显蓝紫色；他达拉非浓度微量(μg级)时显紫红色，放置后渐显蓝紫色；浓度高时所呈现的溶液颜色很浓，表面看去呈黑色，只需旋转白瓷蒸发皿将溶液铺开，即可见蓝紫色。
如果显色后溶液渐渐显黄褐色甚至灰黑色，那是由于硫酸的腐蚀作用，不作为阳性反应的结果。
五、注意事项由于本反应灵敏度高，凡是呈阳性反应试验用过的器具，如白瓷蒸发皿，再次使用前必须充分清洗，必要时加入0.1％钼酸钠的硫酸溶液1滴，如果不显色，冲洗干净，擦干使用；如果显蓝紫色，不能使用。
实施例2、本发明方法检测他达拉非的准确性试验对市售39批样品采用本发明方法进行检测，同时，根据国家药品食品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件(2006009，2006年3月14日发布)，采用HPLC-MS-MS方法检查他达拉非、枸橼酸西地那非、盐酸伐地那非，结果见表3。
表3多批样品试验结果



*“不含”表示不含他达拉非、枸橼酸西地那非和盐酸伐地那非。
结论上述试验与二级质谱验证结果表明，本发明检测方法无一例假阳性报告，同时也未漏检任何含他达拉非及其衍生物的样品，结果准确可靠。
取上述他达拉非呈阴性反应的样品，掺入他达拉非对照品10mg，研磨，按本发明方法进行试验，试验均呈阳性反应，结果表明本发明方法具有良好的准确性，可排除样品中各种辅料的干扰，专属性强。
实施例3、本发明方法检测他达拉非衍生物本发明方法不仅可以检测他达拉非，还可以检测他达拉非衍生物，其衍生物主要是含N杂环上的甲基被氨基(-NH2)取代，见式II；以及含N杂环上的甲基被乙基(-CH2CH3)、羟甲基(-CH20H)取代的衍生物。检测他达拉非衍生物的过程与他达拉非的检测过程相同，阳性结果判断也与之相同。

对于HPLC-MS-MS方法检测含有如式II结构的他达拉非衍生物(氨基他达拉非)的胶囊样品，取1粒内容物进行检测，显色结果呈蓝紫色，阳性结果。
实施例4、本发明检测方法的灵敏度试验一、样品、对照品来源1、他达拉非对照品礼来公司，批号060904纯度100％2、他达拉非片礼来公司，规格20mg3、氨基他达拉非片20mg二、方法灵敏度1、对照品最小检出量取他达拉非对照品10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释制成每1ml中含1μg的溶液，摇匀，精密量取1ml，水浴蒸干后，加入显色剂(0.1％钼酸钠的硫酸溶液)紫红色，放置渐变蓝紫色。
2、制剂最小检出量取他达拉非片(规格20mg)1片，研细，取细粉适量(约相当于他达拉非10mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取滤液1ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(1μg)，水浴蒸干后，加入显色剂(0.1％钼酸钠的硫酸溶液)显紫红色，放置渐变蓝紫色。
3、他达拉非衍生物-氨基他达拉非最小检出量取氨基他达拉非片(含量20mg/片)1片，研细，取细粉适量(约相当于氨基他达拉非10mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取滤液1ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(1μg)，水浴蒸干后，加入显色剂(0.1％钼酸钠的硫酸溶液)显紫红色，放置渐变蓝紫色。
结论根据上述试验结果，可判定他达拉非及其衍生物在Frhde(费勒德)反应中的灵敏度至少可达到1μg。
权利要求
1.一种检测他达拉非及其衍生物的方法，包括如下步骤1)显色反应向待测样品加入钼酸钠的硫酸溶液，进行显色反应；2)结果判断当显色反应呈蓝紫色时，说明待测样品中含有他达拉非或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述钼酸钠的硫酸溶液的质量浓度为0.09-0.11％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述钼酸钠的硫酸溶液的质量浓度为0.1％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述他达拉非衍生物是在他达拉非的含N杂环上的甲基被氨基(-NH2)，乙基(-CH2CH3)或羟甲基(-CH2OH)取代的化合物。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于对于固体待测样品，进行显色反应前还进行如下过程处理在研细或剪碎的样品中加入氯仿，研磨使溶解，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于对于液体待测样品，进行显色反应前还进行如下过程处理量取待测样品置分液漏斗中，加氯仿振摇提取30秒，静置使分层，分取氯仿层，用预先以氯仿湿润的滤纸过滤，滤液置白瓷蒸发皿中，80℃水浴蒸干或用电吹风吹干，残渣即为供试品。
全文摘要
本发明公开了一种检测他达拉非及其衍生物的方法。本发明所提供的检测他达拉非及其衍生物的方法，包括如下步骤1)显色反应向待测样品加入钼酸钠的硫酸溶液，进行显色反应；2)结果判断当显色反应呈蓝紫色时，说明待测样品中含有他达拉非或其衍生物。本发明采用他达拉非的专属性费勒德反应来检测他达拉非，具有快速、简便、灵敏度高、专属性强等优点。
文档编号G01N1/28GK101021482SQ20071006456
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月20日 优先权日2007年3月20日
发明者高青, 张喆, 车宝泉, 周立春, 代红, 王志斌, 赵明, 方颍, 郭洪祝 申请人:北京市药品检验所