专利名称：一种基于表面等离子共振技术的食品中生物毒素检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种食品中生物毒素检测技木。特别是基于表面等离子体共振技木，通过核酸适配体与未标记、标记样品进行特异性竞争识别，采用分子探针适配体修饰的传感元件间接检测食品中生物毒素的方法。
背景技术：
食品中存在的生物毒素严重危害着人民身体健康，引起了人们的广泛关注。生物毒素种类繁多，常见的生物毒素包括罐头食品及密封腌溃食品中的肉毒杆菌神经毒素、果仁中黄曲霉毒素和谷物中的赭曲霉素等，一般具有极强的毒性作用，中毒症状各异，可导致神经麻痹、癌症、肝毒性、肾损伤等。食品生产、加工、运输与食用过程均有可能产生或感染生物毒素，导致严重的食品安全事故。因此，无论在食品安全监测工作还是在医学治疗过程中，实现对食品中生物毒素的准确、灵敏、快速、自动化检测具有极其重要的意义。目前，针对生物毒素的检测方法较多，主要涉及了生物測定法(细胞毒性法等)、理化分析法(荧光分析法和色谱及联用技术等)、免疫法(酶联免疫分析法、荧光免疫法和电化学免疫分析法等)。由于生物測定法具有操作繁琐、费时等缺点，难以广泛推广；理化分析方法通常需要昂贵的仪器设备，对检测原的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。因此，基于免疫法的生物毒素检测技术得到了快速发展，代表性方法为酶联免疫分析法(ELISA)、免疫传感器等。这些检测技术是将生物毒素与其抗体特异性反应，能够快速、准确的检测出食品中存在的微量生物毒素。免疫分析是在表面等离子体共振检测技术上的应用时间最早、范围最广、发展也最为完善的领域之一，但是具有以下缺点(I)抗体需要动物实验体内筛选，抗体使用及存放时间短；(2)抗体的专ー性，导致检测用的试剂盒和传感器专ー性強，如针对赭曲霉素的酶联免疫试剂盒是无法检测其它生物毒素。这些使得芯片重复使用性能较差、耗材需要量很大、检测成本昂贵，极大地限制了表面等离子体共振检测技术的应用发展。近年来，随着适配体体外筛选和检测技术的发展，特别是适配体相对抗体具有筛选简单、稳定性高、成本偏低，逐渐成为抗体的代替品。文献报道，采用适配体检测肉毒杆菌神经毒素时，检测限可达40pg/mL。因此，表面等离子体共振技术结合适配体检测成为近十年来热门研究方向，与常规检测技术相比，其具有高灵敏度、响应快、体积小、无须标记、可保持分子的生物活性等优点。检测方法包括直接检测和竞争检测法前者直接在传感芯片上固定相应生物毒素的适配体，当生物毒素样品流过时，通过检测光学信号变化确定含量。该方法简单易操作，但对于分子量为几百Da的生物毒素，无法检测信号。竞争法需要在传感器表面固定待测生物毒素，在样品中加入过量的该生物毒素的适配体进行竞争抑制，当样品流经传感器时，可以特异性的吸附未与生物毒素结合的多余适配体，由于抗体分子量很大(几万 几十万Da)，从而极大地增强检测信号，目前被广泛采用。但传感芯片的专ー性问题仍然存在，如采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片CM5成本为2000多元人民币。专利报道，采用抗体二次竞争抑制表面等离子体共振技术可解决芯片专ー性问题，但其使用免疫分析检测抗生素，抗体造价昂贵，芯片使用及存放时间短，且二次竞争抑制要求抗体和待测抗生物均过量，造成检测成本升高
发明内容
为了解决现有表面等离子体技术在检测食品中生物毒素时存在芯片专ー性、稳定性差、耗材量大、造价昂贵等问题，同时极大提高生物毒素检测限，本发明提供了ー种食品中生物毒素的表面等离子体共振检测方法。本发明的技术方案为一种应用表面等离子体共振仪的食品中生物毒素检测方法，利用同一传感芯片对不同生物毒素的含量进行检测；包括以下步骤
(一)传感芯片表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50 L浓度为l-50ii g/L已标记生物素的标记分子探针适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上标记分子探针适配体；
(ニ)对待测生物毒素进行分子探针标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基；
(三)标准溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置生物毒素的标准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测生物毒素的标准溶液和分子探针标记的待测生物毒素充分混合后，竞争结合生物毒素相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中分子探针标记的生物毒素量应不少于加入的适配体量；
(四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测分子探针的含量，间接检测生物毒素含量；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
(五)定量检测对于未知含量的生物毒素样品进行检测，同样按照步骤(三)进行；采用表面等离子体共振检测仪记录生物毒素的光谱图；将光谱图中稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出食品中生物毒素的浓度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它生物毒素的检测。所述分子探针包括线粒体tyrosyl-tRNA合成酶、蛋白激酶MEKI、Rho蛋白等多肽或蛋白质，标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤
(1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液；
(3)通入5-50u L浓度为1-50 u g/L生物素修饰的分子探针适配体溶液，进行在线偶联
至基线稳定；
(4)重复步骤(2)至(3)，获得分子探针适配体修饰的传感芯片。
可以采用分子探针标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。所述步骤(四)和(五)中通过检测分子探针的含量，间接检测生物毒素的浓度值，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种生物毒素的检测。本发明的有益效果
(1)本发明解决芯片专一‘丨生差问题，引入线粒体tyrosyl-tRNA合成酶、蛋白激酶MEKI、Rho蛋白等多肽或蛋白质作为标记分子，采用标记分子的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰，将待测生物毒素的測量转换为对标记分子的測量，实现传感芯片的通 用性，可对食品中不同生物毒素进行分子标记后測量。具体检测原理见附图I ;
(2)本发明解决芯片稳定性差问题，采用适配体作为芯片表面通用配体，再生容易。相对抗体可重复使用性强，极大地延长了芯片的使用寿命，降低检测成本；
(3)本发明解决试剂消耗量大问题，采用待测样品生物毒素与分子标记的生物毒素混合后，加入适量的生物毒素适配体，即可进行竞争结合。相对于以往的竞争抑制结合思想，无须加入过量的适配体，既实现了响应信号放大，也节省了试剂消耗；
(4)本发明提高了检测灵敏度，操作中可选用纳米粒子修饰的生物毒素适配体，基于表面等离子体共振检测时，信号显著增加。


图I是本发明所述的生物毒素检测原理图；其中&为食品中生物毒素，g为蛋白质标记的生物毒素，_为生物毒素适配体，Ij为蛋白激酶MEKI适配体，，为金属纳米粒子。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。实施例具体实例分子探针以蛋白激酶MEKI为例，选择两种食品中生物毒素肉毒杆菌神经毒素和黄曲霉毒素为检测对象，具体操作步骤如下
(1)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入20y L浓度为30 u g/L已标记生物素的蛋白激酶MEKI适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上蛋白激酶MEKI适配体；
(2)分子标记物偶联将待测物通过戊ニ醛法与蛋白激酶MEKI进行偶联标记，标记方法根据待测物基团不同选择，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如肉毒杆菌神经毒素，可采用EDC/NHS法与蛋白激酶MEKI连接，待用；
(3)标准溶液配制称取肉毒杆菌神经毒素标准品10mg，溶解于0. 01 mol/L (pH =7. 4) HEPBS缓冲液定容至10 mL,即为I mg/mL的标准贮备液；用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，浓度在pg/mL"ng/mL级，依次为Opg/mL, 20pg/mL, 500pg/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL ；
(4)标准曲线绘制将上述浓度为Ong/mL未标记的标准溶液与适量的蛋白激酶MEKI标记的肉毒杆菌神经毒素溶液充分混合；再加入肉毒杆菌神经毒素相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中蛋白激酶MEKI标记的肉毒杆菌神经毒素量应不少于加入的适配体量；采用表面等离子共振谱仪测量，通入0. 01mol/L (pH = 7. 4) HEPBS缓冲液作为测量基准，然后泵入待测混合样品，待表面等离子体共振响应值稳定后，记录表面等离子体共振光谱 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，冲洗传感芯片表面，破坏蛋白激酶MEKI与适配体的结合，完成传感元件再生；
(6)浓度由低到高，依次通入其他浓度(20pg/mL-6ng/mL)的待测标准样品测量方法同
(4)，获得相应表面等离子体共振光谱图；取肉毒杆菌神经毒素的表面等离子体谱图稳定值，绘制标准曲线，并进行多项式曲线拟合，获得浓度-稳定值关系回归曲线方程；
(7)传感芯片再生后，将实际未知浓度待测样品按步骤(4)与蛋白激酶MEKI标记的肉毒杆菌神经毒素溶液充分混合；泵入的表面等离子体共振谱仪中，同时记录肉毒杆菌神经毒素的光谱图，确定相应稳定值，代入各自标准曲线，确定各组分含量，检测限可达Pg/mL^ng/mL级,低于国家规定的最高允许含量；
(8)再次通入0.02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液,冲洗表面等离子体共振传感芯片，进行芯片再生，用于黄曲霉毒素检测；将适配体变换为黄曲霉毒素适配体，而肉毒杆菌神经毒素-蛋白激酶MEKI偶联物变为黄曲霉毒-蛋白激酶MEKI偶联物；黄曲霉毒检测中步骤(3)中配制的溶液浓度改为 Opg/mL, 100pg/L, 500pg/L, 2ng/mL, 5ng/mL, I Ong/mL 检测限可达到pg/mL ng/mL，低于国家规定的最高允许含量。本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中以肉毒杆菌神经毒素和黄曲霉毒为例进行详细描述，但本发明同样适用于食品中其他生物毒素的測定，如蓖麻毒素、河豚毒素等生物毒素的精确检测和定性分析。传感器表面再生所用溶液选择0.02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，但还可以选择盐溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液，如
0.5mol/L氢氧化钠溶液或10 mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液，破坏标记分子探针与适配体的结合，因此上述内容均在本发明保护范围之内。此外，根据实施例的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，准确度提高2 10倍，探头寿命延长10倍以上，现有表面等离子体检测技术不能准确检测的黄曲霉素等小分子量(〈1000Da)物质，可以采用本发明的方法获得准确的检测結果。权利要求
1.一种应用表面等离子体共振仪的食品中生物毒素检测方法，利用同一传感芯片对不同生物毒素的含量进行检测；其特征在于包括以下步骤 (一)传感芯片表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50 L浓度为l-50ii g/L已标记生物素的标记分子探针适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上标记分子探针适配体； (ニ)对待测生物毒素进行分子探针标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基； (三)标准溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置生物毒素的标准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测生物毒素的标准溶液和分子探针标记的待测生物毒素充分混合后，竞争结合生物毒素相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中分子探针标记的生物毒素量应不少于加入的适配体量； (四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测分子探针的含量，间接检测生物毒素含量；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (五)定量检测对于未知含量的生物毒素样品进行检测，同样按照步骤(三)进行；采用表面等离子体共振检测仪记录生物毒素的光谱图；将光谱图中稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出食品中生物毒素的浓度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它生物毒素的检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述分子探针包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤 (1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰； (2)通入0.02mol/L (pH = 7.4)的磷酸盐缓冲液； (3)通入5-50y L浓度为1-50 u g/L生物素修饰的分子探针适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定； (4)重复步骤(2)至(3)，获得分子探针适配体修饰的传感芯片。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用分子探针标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(四)和(五)中通过检测分子探针的含量，间接检测生物毒素的浓度值，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种生物毒素的检测
全文摘要
一种基于表面等离子共振技术的食品中生物毒素的检测方法，属于食品安全危害因子检测技术领域。本发明包括传感表面适配体固定、样品标记、样品检测、传感元件再生四个步骤，利用同一传感芯片对不同生物毒素的含量进行检测；其特征在于采用传感芯片表面连接标记分子探针相应的适配体；对食品样品进行一系列预处理，加入分子探针标记的生物毒素，混合后竞争结合金属纳米粒子修饰的生物毒素相应的适配体；利用表面等离子体共振检测仪检测分子探针的含量，间接检测生物毒素；并对传感芯片进行再生，用于检测其它生物毒素。本发明传感芯片上用于识别分子的适配体与传统抗体相比，具有稳定性高、响应快速、操作简便的特点，不仅大大延长了芯片的使用寿命，也显著提高了检测灵敏度，并实现了同一表面等离子体共振传感芯片对食品中各种生物毒素的检测。
文档编号G01N21/55GK102628802SQ20121011073
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者王利兵, 苏荣欣, 韩伟 申请人:王利兵