专利名称：：酶联免疫试剂盒及用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒及其试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法。
背景技术：
：牛乳铁蛋白是牛乳及其制品中重要的功能蛋白之一，在我国牛乳和乳制品的消费正逐年加大，有人提出应强化牛乳铁蛋白在乳制品、营养保健品和药品中的应用。现有的牛乳铁蛋白的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法和放射免疫法，但是现有的这些牛乳铁蛋白的检测方法对检査设备的要求较高，造成了检测成本较高，操作复杂的问题。
发明内容本发明的目的是为了解决现有的牛乳铁蛋白的检测方法存在的检测成本较高，操作复杂的问题，而提供了一种酶联免疫试剂盒及用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法。本发明的酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为96孔酶联板；样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿204的浓度为1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9.0mmol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7.4;检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG;底物溶液是浓度为lg/L的杂环吖嗪溶液；洗涤液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿204的浓度为1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9.0mmol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L、吐温20的质量浓度为1.25%，洗涤液的pH值为7.4;终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O.lmmol/L、HF的浓度是0.15mol/L禾口Na0H的浓度是6mmol/L本发明用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法按照以下步骤进行一、配制溶液检测溶液用样品稀释液稀释1000倍得到检测稀释液，底物溶液和质量浓度为O.3%的&02按照1:l的比例混合得到底物混合液，洗涤液用去离子水稀释25倍得到洗涤稀释液；二、将抗体结合在酶联板上兔抗牛乳铁蛋白血清用样品稀释液稀释520倍得到兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，然后在酶联板上的每个孔中加入100uL兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，再将酶联板放置在4。C条件下过夜，即将兔抗牛乳铁蛋白血清结合在酶联板上；三、洗涤稀释液清洗有兔抗牛乳铁蛋白血清的酶联板34次，然后向酶联板上的每个孔中加入200yL的封闭液，再将酶联板放置于25°C无光照条件下反应45min，其中封闭液由牛血清白蛋白溶液与样品稀释液按照l:99的体积比组成；四、在步骤三处理后的酶联板上标注出空白孔、标准品孔和待测样品孔，然后向空白孔中加入100yL的样品稀释液，向标准品孔中加入牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液，向待测样品孔中加入100uL的待测样品，然后将酶联板置于37'C条件下孵育2h，然后用洗涤稀释液清洗酶联板34次；其中所述的牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液最高浓度为100yg/L，用样品稀释液按O.20.8倍稀释410个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液；五、向酶联板上的每个孔中加入200yL的检测稀释液，然后将酶联板置于37。C条件下孵育lh，然后用O.5lmL的洗涤稀释液清洗酶联板34次后，在酶联板上的每个孔中加入200uL的底物混合液，将酶联板放置于25。C无光照条件下反应，再向酶联板上的每个孔中加入50yL的终止液；六、用酶标仪检测出酶联板上的每个孔中的光吸收值，酶标仪的检测波长为410nm;七、制作标准曲线标准曲线是以LogC对B进行作图，标准曲线中的横坐标B二OD标准一OD空白，LogC=Log(牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液的浓度)，OD标准表示牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液光吸收值，OD空白表示空白孔的光吸收值；八、待测样品的光吸收值与标准曲线进行对照，计算出牛乳铁蛋白的含量，即实现了牛乳铁蛋白的检测。本发明中所述的兔抗牛乳铁蛋白血清的制备方法为将弗氏完全佐剂置于玛瑙研钵中，再向玛瑙研钵中加入占弗氏完全佐剂质量1%10%的、浓度为O.81.2mg/mL的牛乳铁蛋白标准品溶液，研磨330min，即得到疫苗，然后在每只家兔的后脚掌注射l.2mg的疫苗，14天后在每只家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，20天后再在家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，然后对家兔进行试血检测效价，直至效价达到l:8000090000时在家兔的颈动脉采血，分离出血清即为兔抗牛乳铁蛋白血清。本发明酶联免疫试剂盒为工作液形式，原料价格低廉，且本发明方法对实验设备要求低，极大的降低了检测成本，与现有的牛乳铁蛋白的检测方法相比，本发明的检测成本降低了50%左右，本发明用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法使用方便，操作简单；本发明的检测结果显示乳铁蛋白的最小检出量为0.8yg/L，本发明的检査方法灵敏度高。本发明的检测方法可同时用于多个样本进行检测，适合于现场査验及对大量样本的筛査。图1为具体实施方式十一中的标准曲线图。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为96孔酶联板；样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿204的浓度为1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9.0mmol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7.4;检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG;底物溶液是浓度为1g/L的杂环吖嗪溶液；洗涤液中NaC1的浓度为150mmo1/L、KH2P04的浓度为1.6mmol/L、Na2HP04的浓度为9.0mmol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L、吐温20的质量浓度为1.25%，洗涤液的pH值为7.4;终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O.lmmol/L、HF的浓度是0.15mol/L禾口Na0H的浓度是6mmol/L。本实施方式中的HRP标记的鼠抗牛IgG可从市场上购买得到。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是本实施方式酶联免疫试剂盒还包括兔抗牛乳铁蛋白血清。其它与具体实施方式一相同。本实施方式兔抗牛乳铁蛋白血清的制备方法为将弗氏完全佐剂置于玛瑙研钵中，再向玛瑙研钵中加入占弗氏完全佐剂质量1%10%的、浓度为O.81.2mg/mL的牛乳铁蛋白标准品溶液，研磨330min，即得到疫苗，然后在每只家兔的后脚掌注射l.2mg的疫苗，14天后在每只家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，20天后再在家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，然后对家兔进行试血检测效价，直至效价达到l:8000090000时在家兔的颈动脉采血，分离出血清即为兔抗牛乳铁蛋白血清。具体实施方式三本实施方式用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法按照以下步骤进行一、配制溶液检测溶液用样品稀释液稀释1000倍得到检测稀释液，底物溶液和质量浓度为O.3%的&02按照1:l的比例混合得到底物混合液，洗涤液用去离子水稀释25倍得到洗涤稀释液；二、将抗体结合在酶联板上兔抗牛乳铁蛋白血清用样品稀释液稀释520倍得到兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，然后在酶联板上的每个孔中加入100yL兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，再将酶联板放置在4。C条件下过夜，即将兔抗牛乳铁蛋白血清结合在酶联板上；三、洗涤稀释液清洗有兔抗牛乳铁蛋白血清的酶联板34次，然后向酶联板上的每个孔中加入200yL的封闭液，再将酶联板放置于25。C无光照条件下反应45min，其中封闭液由牛血清白蛋白溶液与样品稀释液按照l:99的体积比组成；四、在步骤三处理后的酶联板上标注出空白孔、标准品孔和待测样品孔，然后向空白孔中加入100uL的样品稀释液，向标准品孔中加入牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液，向待测样品孔中加入100uL的待测样品，然后将酶联板置于37"C条件下孵育2h，然后用洗涤稀释液清洗酶联板34次；其中所述的牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液最高浓度为IOOyg/L，用样品稀释液按O.20.8倍稀释410个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液；五、向酶联板上的每个孔中加入200yL的检测稀释液，然后将酶联板置于37'C条件下孵育lh，然后用0.5lmL的洗涤稀释液清洗酶联板34次后，在酶联板上的每个孔中加入200yL的底物混合液，将酶联板放置于25。C无光照条件下反应，再向酶联板上的每个孔中加入50yL的终止液；六、用酶标仪检测出酶联板上的每个孔中的光吸收值，酶标仪的检测波长为410nm;七、制作标准曲线标准曲线是以LogC对B进行作图，标准曲线中的横坐标B^D标准一OD空白，LogC=Log(牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液的浓度)，OD标准表示牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液光吸收值，OD空白表示空白孔的光吸收值；八、待测样品的光吸收值与标准曲线进行对照，计算出牛乳铁蛋白的含量，即实现了牛乳铁蛋白的检测。本实施方式步骤二中的兔抗牛乳铁蛋白血清的制备方法为将弗氏完全佐剂置于玛瑙研钵中，再向玛瑙研钵中加入占弗氏完全佐剂质量1%10%的、浓度为O.81.2mg/mL的牛乳铁蛋白标准品溶液，研磨330min，即得到疫苗，然后在每只家兔的后脚掌注射l.2mg的疫苗，14天后在每只家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，20天后再在家兔的皮下多点注射lmg的疫苗，然后对家兔进行试血检测效价，直至效价达到l:8000090000时在家兔的颈动脉采血，分离出血清即为兔抗牛乳铁蛋白血清。本实施方式的检査方法与现有的牛乳铁蛋白的检测方法相比较，检测成本降低了50%左右，本实施方式酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法使用方便，操作简单。本实施方式的检测结果显示乳铁蛋白的最小检出量为0.8yg/L。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤一中的样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿204的浓度为1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9.Ommol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7.4。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式三或四不同的是步骤一中检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG。其它步骤及参数与具体实施方式三或四相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式五不同的是步骤一中底物溶液是浓度为lg/L的杂环吖嗪溶液。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式三、四或六不同的是步骤一中洗涤液中NaCl的浓度为150mmol/L、腿204的浓度为1.6mmol/L、化2冊04的浓度为9.Ommol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L、吐温20的质量浓度为1.25%，洗涤液的pH值为7.4。其它步骤及参数与具体实施方式三、四或六相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式七不同的是步骤三中用O.51.5mL的洗涤稀释液清洗有兔抗牛乳铁蛋白血清的酶联板。其它步骤及参数与具体实施方式七相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式三、四、六或八不同的是步骤四中用0.5lmL的洗涤稀释液清洗酶联板。其它步骤及参数与具体实施方式三、四、六或八相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式九不同的是步骤五中终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O.lmmol/L、HF的浓度是O.15mol/L和Na0H的浓度是6mmol/L其它步骤及参数与具体实施方式九相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式三、四、六、八或十不同的是步骤四中用样品稀释液按O.2倍稀释7个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液，这7个牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液分别为100yg/L、50yg/L、25yg/L、12.5yg/L、6.25yg/L、3.125yg/L和1.5625yg/L。其它步骤及参数与具体实施方式九相同。本实施方式用样品稀释液梯度稀释7个牛乳铁蛋白标准品的稀释液，这7个牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液分别为100yg/L、50yg/L、25yg/L、12.5yg/L、6.25yg/L、3.125yg/L和l.5625yg/L。本实施方式中7个牛乳铁蛋白标准品稀释液的光吸光值和空白孔的光吸收值如表1所示。本实施方式制作得到的标准曲线如图l所示，标准曲线线性方程为￥=20.896X—12.767，相关系数1^2为0.9982，标准曲线中的横坐标B二OD标准一OD空白，LogC=Log(牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液的浓度)，OD标准表示牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液光吸收值，OD空白表示空白孔的光吸收值。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本实施方式采用5只不同奶牛的牛乳作为待检测样品，将每个待测样品的光吸收值与图l的标准曲线进行对照，根据标准曲线计算公式进行计算可得到待检测样品的牛乳铁蛋白含量，5只不同奶牛的牛乳作为待检测样品的光吸收值及待检测样品的牛乳铁蛋白含量如表2所示，表2中的0D空白表示空白孔的光吸收值，OD样品表示待检测样品的光吸收值。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本实施方式的检査方法操作简单，灵敏度高，本实施方式白勺检测方法可同时用于多个样本进行检测，适合于现场査验及对大量样本的筛査。权利要求1.酶联免疫试剂盒，其特征在于酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；其中，酶联板为96孔酶联板；样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、KH2PO4的浓度为1.6mmol/L、Na2HPO4的浓度为9.0mmol/L、KCl的浓度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7.4；检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG；底物溶液是浓度为1g/L的杂环吖嗪溶液；洗涤液中NaCl的浓度为150mmol/L、KH2PO4的浓度为1.6mmol/L、Na2HPO4的浓度为9.0mmol/L、KCl的浓度为2.6mmol/L、吐温20的质量浓度为1.25％，洗涤液的pH值为7.4；终止液中乙二胺四乙酸的浓度是0.1mmol/L、HF的浓度是0.15mol/L和NaOH的浓度是6mmol/L。2.用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法按照以下步骤进行一、配制溶液检测溶液用样品稀释液稀释1000倍得到检测稀释液，底物溶液和质量浓度为0.3。/。的H2^32v按照l:l的比例混合得到底物混合液，洗涤液用去离子水稀释25倍得到洗涤稀释液；二、将抗体结合在酶联板上兔抗牛乳铁蛋白血清用样品稀释液稀释520倍得到兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，然后在酶联板上的每个孔中加入100靈兔抗牛乳铁蛋白血清稀释液，再将酶联板放置在4。C条件下过夜;三、洗涤稀释液清洗有兔抗牛乳铁蛋白血清的酶联板34次，然后向酶联板上的每个孔中加入200yL的封闭液，再将酶联板放置于25。C无光照条件下反应45min，其中封闭液由牛血清白蛋白溶液与样品稀释液按照l:99的体积比组成；四、在步骤三处理后的酶联板上标注出空白孔、标准品孔和待测样品孔，然后向空白孔中加入100uL的样品稀释液，向标准品孔中加入牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液，向待测样品孔中加入100uL的待测样品，然后将酶联板置于37"C条件下孵育2h，然后用洗涤稀释液清洗酶联板34次；其中所述的牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液最高浓度为100yg/L，用样品稀释液按O.20.8倍稀释410个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液；五、向酶联板上的每个孔中加入200靈的检测稀释液，然后将酶联板置于37'C条件下孵育lh，然后用O.5lmL的洗涤稀释液清洗酶联板34次后，在酶联板上的每个孔中加入200yL的底物混合液，将酶联板放置于25。C无光照条件下反应，再向酶联板上的每个孔中加入50yL的终止液；六、用酶标仪检测出酶联板上的每个孔中的光吸收值，酶标仪的检测波长为410nm;七、制作标准曲线标准曲线是以LogC对B进行作图，标准曲线中的横坐标B二OD—OD，LogC=Log(牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液的浓度)，OD表示牛乳铁蛋白标准品的梯度稀释液光吸收值，OD表示空白孔的光吸收值；八、待测样品的光吸收值与标准曲线进行对照，计算出牛乳铁蛋白的含量，即实现了牛乳铁蛋白的检测。3.根据权利要求2所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤一中的样品稀释液中NaCl的浓度为150mmol/L、^2[^4的浓度为1.6mmol/L、Na2HPC)4的浓度为9.Ommol/L、KC1的浓度为2.6mmol/L，样品稀释液的pH值为7.4。4.根据权利要求2或3所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤一中检测溶液为HRP标记的鼠抗牛乳铁蛋白IgG。5.根据权利要求4所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤一中底物溶液是浓度为lg/L的杂环吖嗪溶液。6.根据权利要求2、3或5所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤一中洗涤液中NaCl的浓度为150mmol/L、^2[^4的浓度为1.6讓ol/L、Na2HPC)4的浓度为9.0mmol/L、KC1的浓度为2.6讓ol/L、吐温20的质量浓度为1.25%，洗涤液的pH值为7.4。7.根据权利要求6所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤三中用O.51.5mL的洗涤稀释液清洗有兔抗牛乳铁蛋白血清的酶联板。8.根据权利要求2、3、5或7所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤四中用O.5lmL的洗涤稀释液清洗酶联板。9.根据权利要求8所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤四中用样品稀释液按O.2倍稀释7个浓度的牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液，这7个牛乳铁蛋白标准品梯度稀释液分别为100yg/L、50yg/L、25yg/L、12.5yg/L、6.25yg/L、3.125yg/L和l.5625yg/L。10.根据权利要求2、3、5、7或9所述的用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，其特征在于步骤五中终止液中乙二胺四乙酸的浓度是O.lmmol/L、HF的浓度是O.15mol/L禾口NaOH的浓度是6mmol/L。全文摘要酶联免疫试剂盒及用酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法，它涉及一种试剂盒及其试剂盒检测牛乳铁蛋白的方法。本发明解决了现有的牛乳铁蛋白的检测方法存在的检测成本较高、操作复杂的问题。本发明酶联免疫试剂盒包括酶联板、牛乳铁蛋白标准品、样品稀释液、检测溶液、底物溶液、洗涤液和终止液；本发明的检测方法主要经过溶液的配制，将抗体结合在酶联板上，封闭酶联板，将标准品、待测样品固定在酶联板上，然后用酶标仪检测光吸收值，并根据检查结果制作标准曲线，然后计算出待检测样品的牛乳铁蛋白血清的含量。本发明的方法采用了工作液形式，成本低廉，本发明的酶联免疫试剂盒检测牛乳铁蛋白含量的方法操作简单。文档编号G01N33/543GK101666797SQ20091030695公开日2010年3月10日申请日期2009年9月14日优先权日2009年9月14日发明者鹏刘,张英华,阳沈,生庆海,诸晓强,涛迟,韩秀娥申请人:黑龙江省乳品工业技术开发中心