专利名称：检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法。
背景技术：
甲基丙二酸血症是先天性有机酸代谢异常中最为常见的疾病之一，属于常染色体隐性遗传病。该病常见的临床症状表现为嗜睡、生长发育迟缓、发作性呕吐、脱水、呼吸困难、肌张力低下，少见症状还包括智力低下、肝大和昏迷等。自1967年首次报道该病以来， 国内外学者采用不同的方法对患者体液中MMA进行了定性定量分析，以便为临床确诊提供技术服务。采用的方法包括气质联用及串联质谱法等。在我国，当今临床对于该类疾病的诊断方法还十分有限，曾有学者使用气质联用法和串联质谱法检测分析尿中MMA的浓度， 至今尚未建立一种简单、高效、灵敏的适合测定血样的检测方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的检测血液中甲基丙二酸含量的方法。本发明所提供的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，包括如下步骤将标品、待测样本分别和内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入PH < 7的小极性醚混勻，离心；取上清液，吹干；加入饱和的酸性醇溶剂，混勻，密封，加热65°C，20min衍生；衍生完成后吹干溶剂；加入流动相复溶液复溶，混勻；超声萃取，混勻，离心；取上清溶液，经流动相进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中甲基丙二酸的含量。本发明的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，其中所述基质溶液为质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。本发明的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，其中所述流动相复溶液和流动相为含1_5%。甲酸铵的醇水溶液或乙腈水溶液。本发明的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，其中所述流动相复溶液中醇水溶液或乙腈水溶液中醇或乙腈的体积百分比浓度为20-80%。本发明的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，其中所述酸性醇溶剂为盐酸正丁醇或盐酸正戊醇。本发明的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，其中所述萃取试剂为磷酸化甲基叔丁基醚。本发明的检测甲基丙二酸含量的方法以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。以BSA为基质，模拟体液中的蛋白质环境，消除基质效应，提高甲基丙二酸的回收率。以磷酸化甲基叔丁基醚(MTBE)为萃取试剂，萃取效率好于传统的乙醚和乙酸乙酯萃取，减少干扰，且萃取试剂本身易挥发，便于吹干从而使后续的浓缩和衍生实验顺利进行，提高效率。超声萃取促进衍生产物的溶解， 从而提高含量使之大于检测限。本发明的检测甲基丙二酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确。


图1为标准品(甲基丙二酸)的色谱图。图2为内标品(D3-甲基丙二酸)的色谱图。图3为血清中甲基丙二酸的色谱图。图4为血清中内标(D3-甲基丙二酸)色谱图。图5为甲基丙二酸质谱图。图6为内标D3-甲基丙二酸质谱图。
具体实施例方式步骤1 用移液器移取标品和内标溶液，涡旋仪混勻；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混勻；步骤2 向上述混合液中加入基质溶液的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液)， 涡旋混勻；步骤3 加入PH < 7的小极性醚进行萃取，充分混勻并高速离心；步骤4 取部分上清液，于氮吹仪上氮气吹干；步骤5 加入衍生试剂(饱和的酸性醇溶液)，涡旋混勻，密封，加热65°C，20min衍生；步骤6 衍生完成后再次加热吹干溶剂；步骤7 加入流动相复溶液复溶(含1_5%。甲酸铵或乙酸铵的醇水溶液或乙腈水溶液，醇水溶液或乙腈水溶液中醇或乙腈的体积百分比浓度为20-80% )，充分混勻；步骤8 经超声萃取一段时间后，充分混勻并高速离心；步骤9 取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析血液或尿液中甲基丙二酸(MMA)的含量。液相色谱条件样品经液相的自动进样器进样，流动相组成为甲醇水溶液或乙腈水溶液(含 1-5%。甲酸铵或乙酸铵)，梯度洗脱分离，流速200 μ L/min,进样量10 μ L，进样前清洗取样针，六通阀设定 9-14min to load。色谱柱 discovery C18 (SUPELCO，HPLC，5cm*2. 1mm， 5 μ m)三重四级杆串联质谱仪条件ESI离子源，正离子扫描；SRM模式，扫描时间18min，喷雾电压5000V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度300°C，碰撞气(氩气)1.5mTorr ；m/z 231 — 119、m/z 231 — 175 作为 MMA 的特征定性离子对，m/z 234 — 122、m/z 234 — 178 作为内标D3-MMA的特征定性离子对，m/z 231 — 119用于MMA定量，CE为10eV，扫描时间 0.5s，扫描宽度lu。三种萃取试剂对测定值的影响见表。采用乙醚或乙酸乙酯提取后的样本，其最终产物的色谱峰强度远远小于磷酸化甲基叔丁基醚提取后的样本色谱峰强度。表1.不同萃取试剂测定值结果比较
权利要求
1.本发明所提供的检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，包括如下步骤 将标品、待测样本分别和内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入PH < 7的小极性醚混勻，离心；取上清液，吹干；加入饱和的酸性醇溶剂，混勻，密封，加热65°C，20min衍生；衍生完成后吹干溶剂；加入流动相复溶液复溶，混勻；超声萃取，混勻，离心；取上清溶液，经流动相进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中甲基丙二酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基质溶液为质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述流动相复溶液和流动相均为含 1 -5 %。甲酸铵的醇水溶液或乙腈水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述流动相复溶液中醇水溶液或乙腈水溶液中醇或乙腈的体积百分比浓度为20-80%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述酸性醇溶剂为盐酸正丁醇或盐酸正戊醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述萃取试剂为磷酸化甲基叔丁基醚。
全文摘要
本发明公开了一种检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法，包括如下步骤将标品、待测样本分别和内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入萃取试剂混匀，离心；取上清液，吹干；加入饱和的酸性醇溶剂，混匀，密封，加热65℃，20min衍生；衍生完成后吹干溶剂；加入流动相复溶液复溶，混匀；超声萃取，混匀，离心；取上清溶液，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中甲基丙二酸的含量。本发明的检测甲基丙二酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确、特异性强。
文档编号G01N30/88GK102539595SQ20101058163
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪君君, 宋彦强, 崔学峰 申请人:北京国立柏林医学科技发展有限公司