专利名称：一种荧光显微成像方法及成像系统的制作方法
技术领域：
本发明属于光学成像应用技术领域，尤其涉及一种荧光显微成像方法及成像系统。
背景技术：
荧光显微镜是利用特定波长的光照射被检物，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置的一种显微光学检测技术，迄今已有100多年的历史。近年来，由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用，FISH (Fluorescence Situ Hybridization，荧光原位杂交)、GFP (Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广，以及显微照相、数字CXD (Charge Coupled Device,电荷耦合器件)成像等技术的辅助驱动，赋予这一传统技术新的应用价值和生命力。近代荧光显微镜多是在复式显微镜的架构上安装荧光装置集合而成，荧光装置包括照明系统、滤光片系统和显微镜三部分。在荧光显微成像中，激发光照射到样品后，一部分激发光被样品吸收，用于激发样品分子内的电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态，处于激发态的分子通过释放出相应较低能量的荧光回到基态；另一部分激发光对产生荧光信号没有贡献，只在样品上发生反射或透射，结果导致荧光信号淹没在较强的激发光当中。因此荧光显微镜的成像质量在一定程度上也取决于对激发光的滤波效果。根据荧光与激发光波长的差异，可采用频率滤波方法来滤除激发光，提取荧光信号，目前荧光显微镜均采用此方法。但这种方法对荧光和激发光的波长有严重的依赖性，导致荧光显微镜的使用受到激发光与荧光的波长限制，当激发光或荧光波长变化时，需要更换相适应的滤波片；当激发光为白光或宽带光源时，若激发光与荧光在波长上有重叠，采用传统的频率滤波法无能为力。

发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种荧光显微成像方法，旨在解决现有的荧光显微成像方法对激发光与荧光的波长具有严重依赖性的缺陷。本发明提出一种有别于传统荧光显微镜的新型显微成像方法，该方法采用了一种新型的荧光滤波方案，基于激发光与荧光偏振态的差异来滤除激发光，提取荧光信号。本发明实施例是这样实现的，一种荧光显微成像方法，包括以下步骤获取线偏振激发光；利用线偏振激发光照射样品，样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射；被反射的线偏振激发光经过偏振态与激发光正交的检偏器时截止，而自然偏振态的荧光通过该检偏器，成像于CXD相机上。
本发明实施例的另一目的在于提供一种荧光显微成像系统，包括线偏振光产生单元、分光镜、物镜、第一偏振片以及CCD摄相机；所述第一 偏振片的偏振方向与所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光的偏振态正交；所述分光镜用于反射所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光，反射后的激发光通过所述物镜后照射到样品上；样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射；所述分光镜和所述第一偏振片将被样品反射的线偏振激发光过滤掉，而允许产生的荧光中偏振态垂直于线偏振激发光的那部分通过，通过的荧光最终成像于所述CCD相机上。在本发明实施例中，有别于传统技术中，根据激发光与荧光在波长上的差异滤除激发光，而是基于激发光与荧光在偏振态上的差异，利用偏振器件过滤激发光，提取荧光， 不受激发光与荧光波长的限制，适合于不同波长的激发光与荧光。


图1是本发明实施例提供的荧光显微成像方法的实现流程图；图2是本发明实施例提供的荧光显微成像系统的结构原理图；图3是图2所示成像系统的提取荧光信号原理的简化示意图；图4是本发明实施例提供的荧光显微成像实验结果及其对比图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在本发明实施例中，从激发光与荧光在偏振态上的存在差异这一特性出发，利用偏振器件过滤激发光、提取荧光，不受激发光与荧光波长的限制。图1示出了本发明实施例提供的荧光显微成像方法的实现流程，详述如下。在步骤SlOl中，获取线偏振激发光。在步骤S102中，利用线偏振激发光照射样品，样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射。样品中的分子由于受到其中一部分激发光的激励，电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态，激发态的分子重新回到基态时释放出荧光。荧光为自然光，其偏振态为自然偏振或接近于自然偏振，不再保持原来激发光的偏振态。另一部分未被吸收的激发光在样品表面发生反射，对产生荧光信号没有贡献，此部分激发光经过样品的反射后，其偏振态几乎保持不变，仍然为线偏振。在步骤S103中，被反射的线偏振激发光经过偏振态与激发光正交的检偏器时截止，而自然偏振的荧光通过该检偏器，成像于CXD相机上。本发明实施例正是考虑到荧光与激发光的偏振态不同，选择让荧光中偏振态与激发光相垂直的那一部分荧光通过，而激发光被滤除，最终实现荧光的提取。图2示出了本发明实施例提供的荧光显微成像系统的结构框图，为了便于说明，图中仅给出了与本发明实施例相关的部分。参照图2，本发明实施例提供的荧光显微成像系统至少需包括线偏振光产生单元、 分光镜BS、物镜0、第一偏振片Pl以及CCD相机。其中线偏振光产生单元用于产生线偏振激发光(图2中以虚线表示)，第一偏振片Pl的偏振态与所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光的偏振态为正交关系，因此线偏振光产生单元产生的线偏振激发光无法通过第一偏振片Pl。分光镜BS用于反射经过它的线偏振激发光，被反射后的激发光经过物镜0后照射到样品S上。样品S中的分子由于被激发光激励，电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态，激发态的分子重新回到基态时释放出荧光。荧光为自然光，不再保持着原来激发光的偏振态。由于激发光没有完全被样品吸收，其中一部分照射到样品S后，被反射回去，对产生荧光信号没有贡献。这部分激发光经过样品S处发生反射后，其偏振态几乎保持不变，仍为线偏振光，它将被偏振分光镜、第一偏振片Pl双层过滤，无法到达CCD相机。样品S上产生的荧光，由于其偏振态为自然偏振或接近于自然偏振，偏振态与激发光相垂直的荧光能顺利透射过分光镜BS与第一偏振片Pl后，被CCD相机接收。进一步地，线偏振光产生单元包括光源和第二偏振片P2， 光源用于产生激发光，第二偏振片P2配合所述光源获得线偏振激发光。应当理解，若光源可以直接发出线偏振光， 可以将第二偏振片P2省略。将图2中的光路展开，得到如图3所示的光路原理简化示意图，其中，参考面1上的带箭头的虚线和参考面2带箭头的实线表示光的偏振方向，而偏振片P1、偏振片P2上的带箭头的实线表示偏振片P1、偏振片P2的偏振方向，样品S上的带箭头的虚线表示线偏振光的偏振方向，实线为荧光方向。具体地，参考面1位置为激发光(带箭头的虚线表示激发光，箭头表示偏振方向)入射第二偏振片P2前的任意一位置，激发光的偏振态为自然偏振， 经过第二偏振片P2 (若如图中垂直偏振放置)后，入射到样品S上的激发光为线偏振光。样品S被激发光激发后，辐射出荧光信号(带箭头实线表示荧光，箭头表示偏振方向)，荧光为自然光或接近自然光。由于第一偏振片Pl与第二偏振片P2正交，激发光经过第一偏振片Pl时由于其偏振方向与偏振片偏振方向垂直而被过滤掉。样品S被激发所产生的荧光为自然光，其中偏振态平行与第一偏振片Pl的那部分荧光，能顺利得通过第一偏振片P1， 入射到CXD相机上。进一步地，上述系统还可以进一步包括一透镜组件L，透镜组件L可以位于第一偏振片P2的前方(如图2所示)，也可以位于第一偏振片P2的后方，但需保证样品S与CCD 相机相对于透镜组件L与物镜0构成的组合透镜组的位置满足物像关系。进一步，上述分光镜具体选用普通的分光镜和偏振分光镜均可。当选用普通的分光镜时，经样品S反射的激发光和产生的荧光经过分光镜时，将有部分激发光和部分荧光被反射，它们中的另一部分透射过分光镜。透射过的激发光经过后续的第一偏振片Pi时， 由于其偏振态垂直于Pl而被过滤掉；而透射过分光镜的荧光，偏其振态为自然(或接近自然)偏振，能通过后续的第一偏振片P1，入射到CCD相机上。当选用偏振分光镜时，激发光经过BS时基本上会全部被反射，荧光中偏振态平行于激发光的那部分也被反射，而垂直于激发光的那部分荧光发生透射，透射过BS的荧光顺利通过第一偏振片Pl。一般考虑到偏振分光镜的消光比不太高(如1000 1)，因此，没有完全被偏振分光镜过滤掉的激发光经过第一偏振片Pi时，再次被滤除，从而增强了图像成像质量。进一步地，上述分光镜BS还可以替换为镀有激发光高反射膜和荧光增透膜的双色镜，双色镜上的高反射膜对激发光高反，增透膜则会对荧光高透，不过高反射膜对激发光的反射不够彻底，增透膜透射出的光中也会夹杂少许激发光，因此，需要后续的偏振滤波法进行进一步滤除激发光，提取荧光信号。当然，如果使用双色镜分光时，会对光的波长有一定的依赖作用。进一步地，具体实施时还可以在第二偏振片P2前增加其它光学元器件，第二偏振片P2后增加其它非偏振光学元器件；或者在第一偏振片Pl前增加其它非偏振光学元器件， 第一偏振片Pl后 增加其它光学元器件，都不影响荧光信号的提取。也可以在第二偏振片P2 与第一偏振片Pl之间增加一些能使光偏振态产生θ角度旋转的旋光器件，同时，将第一偏振片Pl同样旋转角度θ，或使第二偏振片Ρ2旋转-Θ角度；于是，线偏振激发光经过第一偏振片Pl时，由于其偏振态仍垂直与第二偏振片Ρ2而截止，荧光仍能通过第一偏振片Ρ1， 最终成像于CXD相机上。图4Α为采用偏振滤波之前实验所采集到的图像，图4Β为使用了偏振滤波后实验得到的图像。从图4Α、图4Β可知，本专利所发明的偏振滤波方案能够消除激发光，提取荧光信号，提高图像质量。为了和传统的频率滤波法进行比较，我们在实验中也采集了使用频率滤波法进行滤波后的图像，为图4C。比较图4B、4C比较可知，由本专利所发明的偏振滤波法获得的图像质量并不差于传统滤波法。需要指出的是，本实验中偏振滤波法所采用的起偏器和检偏器为国产吸收型偏振片(大恒新纪元科技股份有限公司，型号GCL-050003)， 其消光比为500 1 ；进行对比实验的频率滤波法采用的是美国进口滤波片(Chroma Technology Corp，型号HQ5101p)。若采用高消光比的检偏器件，如格兰泰勒偏振片消光比小于5X10_6，利用本专利发明的荧光显微成像方法所获得的图像质量也将有进一步地提尚ο本发明实施例基于激发光与荧光在偏振态上的差异的特性，利用偏振器件过滤激发光，提取荧光信号，提取过程不受激发光与荧光波长的限制，能增强荧光成像质量，适合于不同波长的激发光与荧光；本发明实施例也适合于用波长可调谐的激光激励样品，产生多色的荧光的多光谱成像荧光显微镜。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种荧光显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤获取线偏振激发光；利用线偏振激发光照射样品，样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射；被反射的线偏振激发光经过偏振态与激发光正交的检偏器时截止，而自然偏振态的荧光通过该检偏器，成像于CXD相机上。
2.一种荧光显微成像系统，其特征在于，包括线偏振光产生单元、分光镜、物镜、第一偏振片以及CCD摄相机；所述第一偏振片的偏振方向与所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光的偏振态正交；所述分光镜用于反射所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光，反射后的激发光通过所述物镜后照射到样品上；样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射；所述分光镜和所述第一偏振片将被样品反射的线偏振激发光过滤掉，而允许产生的荧光中偏振态垂直于线偏振激发光的那部分通过，通过的荧光最终成像于所述CCD相机上。
3.如权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述线偏振光产生单元进一步包括用于产生激发光的光源和配合所述光源获得线偏振激发光的第二偏振片。
4.如权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统还包括一透镜组件，样品与所述CCD相机相对于所述透镜组件与物镜组成的透镜组的位置满足物像关系。
5.如权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述分光镜为偏振分光镜。
6.如权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述分光镜替换为双色镜，所述双色镜镀有激发光高反射膜和荧光增透膜。
7.如权利要求2所述的成像系统，其特征在于，所述系统还包括一旋光器件，所述旋光器件位于所述线偏振光产生单元与所述第一偏振片之间，所述线偏振光产生单元产生的线偏振激发光，经过旋光器件作用后，激发光的偏振方向垂直于所述第一偏振片的偏振方向。
全文摘要
本发明适用于光学成像应用技术领域，提供了一种荧光显微成像方法，包括以下步骤获取线偏振激发光；利用线偏振激发光照射样品，样品吸收部分线偏振激发光而辐射出自然偏振态或接近自然偏振态的荧光，未被吸收的线偏振激发光在样品处发生反射；被反射的线偏振激发光经过偏振态与激发光正交的检偏器时截止，而自然偏振的荧光通过该检偏器，成像于CCD相机上。本发明有别于传统技术中，根据激发光与荧光在波长上的差异滤除激发光，而是基于激发光与荧光在偏振态上的差异，利用偏振器件过滤激发光，提取荧光，不受激发光与荧光波长的限制，适合于不同波长的激发光与荧光。
文档编号G01N21/64GK102175656SQ20101061621
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者屈军乐, 文侨, 牛憨笨, 王凯歌, 邵永红 申请人:深圳大学