专利名称：一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒。
背景技术：
妊娠，即怀孕，是指人和动物母体内有胚胎在发育成长。初次妊娠是指第一次妊娠。随着我国性观念日渐开放，未婚先孕的情况逐步增加，导致初次妊娠的人工流产的比率逐渐上升。但是，因为第一次妊娠时子宫腔比较狭小，人工流产常使子宫内膜的深层受到损伤，愈合之后易造成子宫腔的粘连，导致月经血排出受阻，引起顽固性的痛经，若粘连面积较大时，会使受精卵无立足之地而造成生育困难。目前，初次妊娠后人工流产导致子宫腔粘连，进而导致不孕症的情况已屡见不鲜。因此，在人工流产时，检查孕妇是否为初次妊娠，对减少不孕症有极大的作用。另外，初次妊娠孕妇对妊娠的过程，以及妊娠过程中的注意事项都不甚了解，导致很多胎儿患有先天性疾病。因此，在妊娠初期检查孕妇是否为初次妊娠，及时对初次妊娠孕妇进行妊娠相关知识的普及，有利于提高我国人口质量。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒以及检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。PLGF,即胎 盘生长因子(placenta growth factor, PLGF),是一种二聚体糖蛋白，属于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族中的一员，PLGF通过与特异性受体结合而发生生物学作用。本发明孕妇初次妊娠筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清PLGF水平的试剂。其中，所述试剂为ELISA检测用试剂。所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。 优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。本发明还提供了检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。其中，所述检测孕妇血清PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂。所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。优选地，所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。本发明孕妇初次妊娠筛查试剂盒可以有效筛查孕妇是否为初次妊娠，有利于孕妇身心状况的整体判断，并且操作简单，仅需血液检查，患者依从性高，为孕妇的临床诊疗提供了可靠的依据，具有良好的应用前景。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式实施例1样本采集1、采集对象:2011年10月-2012年4月在四川大学华西第二医院门诊及成都中医药大学第二附属医院门诊就诊的孕早期孕妇共34例。
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2、早期妊娠诊断标准:参考全国高等医学院校教材《妇产科学》第7版记载的方法(包括①停经史；@HCG阳性；③确诊为宫内妊娠(B型超声见到宫腔内有妊娠囊)。3、纳入标准:①符合上述诊断标准者；②孕周:5周-13+6周；③知情同意，志愿受试。4、排除标准:有心血管、肝、肾和造血系统等并发症，或其他原发性疾病及精神病患者。5、脱落标准:①纳入后发现不符合纳入标准或伴有排除标准的病例予以剔除
因其他原因失访的病例患者自行退出；④纳入后发现无法从受试者处获得真实、全面的临床资料。6、样本人口特征:纳入孕妇年龄范围21岁-43岁，平均年龄31.96±6.1岁。7、血液样本:采用含有EDTA的试管采集孕妇静脉血(空腹)4ml,经4°C低温离心(4000rpm, IOmin)后将其上清液，编号保存于_80°C冰箱冷冻待测。实施例2PLGF水平的检测方法1、主要仪器(I)酶标仪:Molecular Devices 公司，Spectra Max5(2)冷冻离心机:BECKMAN 公司，AllegraTMMR(3)_2CTC冰箱:Electrolux 公司(4)超低温冰箱:Thermo 公司，SK501(5)电热恒温培养箱:上海森信实验仪器有限公司，DRP-91622、实验试剂及材料(I) Capture Antibody:鼠抗人 PLGF 单克隆抗体 Human PLGFAntibody (Monoclonal Mouse IgGl),购自 R&D 公司，MAB264 ;(2)Detection Antibody:生物素标记的羊抗人PLGF多克隆抗体Human PLGFBiotinylated Antibody (Ployclonal Goat IgG)，购自 R&D 公司，BAF264 ;(3)PLGF 标准品:重组人 PLGF Recombinant Human PLGF,购自 R&D 公司，264-PG-10 ；(4)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素Streptavidin-horseradish peroxidase:R&D 公司，DY998 ；(5) TMB:Sigma 公司，T0440-1L ；(6) PBS:自配，ρΗ7.4，137mM NaCl, 2.7mM KC1,8.1mM Na2HPO4, 1.5mMKH2PO4, pH7.2-7.4, 0.2 μ m filtered ；(7) Tween-20:上海生工；(8)包被缓冲液:自配，ρΗ9.6、50mM 碳酸盐缓冲液，Na2CO3L 59g，NaHC032.93g，加蒸馏水至IL ；(9)洗涤液:自配，PBS-T (PBS，含 0.02%Tween-20)(10)终止液:自配，2M H2SO4 ；(11)脱脂奶粉:伊利集团；(12)牛血清白蛋白(BSA):罗氏公司；(13)胎牛血清(FBS):GIBC0 公司；(14)可拆式 96 孔 ELISA 板:C0STAR 公司。3、实验方法(I)将所测样本放在室温下复苏后，再进行检测；(2)包被 Capture Antibody, 4 μ g/ml, 100 μ 1/well, 4°C放置过夜(约 16_20h);(3)3%BSA溶液、3%FBS溶液或为5%脱脂奶粉溶液封闭，100 μ 1/well，37 °C孵育2h ；(4)PBS-T洗板三次；分别加入8个不同浓度PLGF标准品(浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml)及待测样品，100μ 1/well，均设置两个复孔，同时设置两个空白孔，37°C孵育2h ；(5)PBS_T 洗板三次;分别加入 Detection Antibody, I μ g/ml, 100 μ 1/well, 37°C孵育2h ；(6) PBS-T 洗板三次；加入 streptavidin-horseradish peroxidase, 1:200,100μ 1/well，室温，Ih ；(7) 85-1'洗板三次；加入了]\^，10(^1/^11，避光于371:孵育 IOmin ;(8)直接加终止液，50 μ 1/well ；450nm处检测OD值，绘制标准曲线，计算待检样品的PLGF水平。实施例3PLGF水平与孕妇初次妊娠的相关性按照实施例2的方法分别检测实施例 1采集的血液样本，应用SPSS17.0统计软件进行统计分析。计数资料用t检验，P < 0.05认为有统计学意义。统计结果如表I所示:表I孕妇初次妊娠与血清PLGF水平的相关性
权利要求
1.一种孕妇初次妊娠筛查剂盒，其特征在于:它包括检测孕妇血清PLGF水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的筛查试剂盒，其特征在于:所述试剂为ELISA检测用试剂。
3.根据权利要求2所述的筛查试剂盒，其特征在于:所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
4.根据权利要求3所述的筛查试剂盒，其特征在于:所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
5.根据权利要求4所述的筛查试剂盒，其特征在于:所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
6.检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于:所述检测孕妇血清PLGF水平的试剂为ELISA检测用试剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于:所述ELISA检测用试剂为ELISA直接法、ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法或者ELISA竞争法检测用试剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述ELISA双抗体夹心法检测用试剂包括抗人PLGF抗体、人PLGF标准品、ELISA检测用酶和ELISA检测用底物。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于:所述抗人PLGF抗体包括抗人PLGF单克隆抗体和生物素标记的抗人PLGF多克隆抗体；所述ELISA检测用酶是辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；所述ELISA检测用底物为TMB。
全文摘要
本发明公开了一种孕妇初次妊娠筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清PLGF水平的试剂。本发明还公开了检测孕妇血清PLGF水平的试剂在制备孕妇初次妊娠筛查试剂中的用途。本发明试剂盒可以对孕妇是否为初次妊娠进行评估，临床应用前景良好。
文档编号G01N33/68GK103235142SQ20131015734
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者陆华, 高小平, 刘小章 申请人:成都中医药大学