专利名称：一种同位素标记试剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同位素标记试剂及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂及其制备方法和该同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。
背景技术：
转化医学(TranslationalMedicine)(参见 Clin. Sci.，2007，112，217)是应对现在医学研究日趋复杂化和与基础临床严重脱离所提出的一种研究新策略。它是不断循环、 不断上升、不断深入的一种新的医学研究模式，缩短了从实验室到病床的距离，是21世纪医学发展的一个新动力。转化医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数——生物标志物(biomarker)(参见J. Clin. Pharmacol. 2003，43，329)。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，如蛋白质和多肽。通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。而蛋白质组学技术便是发现生物标志物的重要途径。蛋白质组研究具有在整体水平上发掘与寻求潜在疾病标志物的能力，蛋白质组技术完善了以基因组学为基础的方法，集中于动态描述基因调节，其主要研究目标在于对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响以及解释基因表达调控的机制。近年来，利用蛋白质组技术检测与疾病相关标志物的研究在国内外争相报道，为疾病的临床诊断开辟了新的途径。20世纪80年代末，电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)两种软电离技术的出现，极大的推动了蛋白质组学的发展。应用串联质谱的技术，高效率的鉴定目标蛋白的酶解肽段，进而推测蛋白质种类的“bottom up”模式被广泛应用于蛋白质组学中生物标志物的定性研究中。但是一些情况，如非正常的碎片离子、不准确的质量、不可靠地数据库搜索方式，往往会导致错误肽段序列的产生，通过鉴定多肽N端残基，可以很好的排除假阳性以及不确定的序列，进而提升测序准确性，进而提高所鉴定的靶蛋白(生物标志物biomarker) 的可靠性。目前具体主要对肽段的N端α氨基进行化学标记，并结合多级质谱的碰撞诱导裂解(collision induced dissociation, CID)专一性的诱导产生N端标记产物离子，如 ^b1离子。对于 离子而言，Hsu等率先采用N端肽的双甲基化的标记方法，研究了衍生肽段在二级质谱中的Ei1离子信号(参见J. ftOteome Res.，2005，4，101)。而另一种广泛应用的是异硫氰酸苯酯(PITC)的标记方法(参见J. Mass Spectrom. 1997，32，225)，该试剂通过在串联质谱中诱导肽段发生气相埃德曼(Edman)裂解，从而生成Id1离子，在N端氨基酸测序和MRM定量中都有较好的应用。但是，以往的手段仍存在一些缺陷，如标记后产物质谱信号下降，标记效率低下，某些肽段因为不能产生明确的N端离子，而得出错误的结果。此外， N端同分异构残基(亮氨酸、异亮氨酸)也不能够很方便的鉴定。针对上述现有技术的不足之处，本发明的目的之一是提供一种可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号、有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性的同位素标记试剂；本发明的目的之二是提供所述同位素标记试剂的一种制备方法；本发明的目的之三是提供所述同位素标记试剂在多肽N端残基鉴定及蛋白质比较分析中的应用。本发明提供的同位素标记试剂，为异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂，其化学名为[dQ]/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，简写为[dQ]/[d6]-
权利要求
1. 一种同位素标记试剂，其特征在于为异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂，其化学名为[dj / [d6] _4，6- 二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，简写为[dj /
2.—种权利要求1所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤a)将金属钠溶于无水甲醇/氘代甲醇中，配制成甲醇钠/氘代甲醇钠溶液；b)将4，6-二氯-2-氨基嘧啶溶于无水甲醇/氘代甲醇中，再逐滴滴加到现配的甲醇钠 /氘代甲醇钠溶液中，在15 35°C下搅拌过夜，制得[dQ]/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物；c)将[dj/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物溶于无水二氯甲烷中，再加入硫光气和碳酸氢钠，进行回流反应7 9小时；使反应体系冷却到室温，倾入水中淬灭反应，得到 [dQ]/[d6]-4，6- 二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯粗产品；d)进行柱层析，得到纯化的[cU/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯，即为本发明所述的同位素标记试剂。
3.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于甲醇钠/氘代甲醇钠溶液的浓度为0. 1 1. Omol/L。
4.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于甲醇钠/氘代甲醇钠与4，6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为O 4) 1。
5.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于硫光气与4，6_二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(1.2 2.0) 1。
6.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于碳酸氢钠与4， 6-二氯-2-氨基嘧啶的摩尔比为(3 5) 1。
7.根据权利要求2所述的同位素标记试剂的制备方法，其特征在于柱层析的洗脱液是体积比为16的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂。
8.—种权利要求1所述的同位素标记试剂在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中的应用。
9.根据权利要求8所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于是先将目标分析物分别与轻质的和重质的标记试剂反应，再进行除杂后处理，然后用氮气吹干纯化后的标记分析物，用体积比为1 1的乙腈/水溶液溶解标记分析物，最后进行电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析。
10.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于所述的目标分析物为 N端α氨基无修饰多肽或蛋白质经过变性、酶解而得到的混合肽段或不同生理状态下的生物体蛋白质提取物。
11.根据权利要求10所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，蛋白质经过变性、酶其中当X = H时，为[dj-DMPITC ；当X = D时，为解的操作过程如下将蛋白质置于pH = 8. 0 8. 5，含有40 50mmol/L碳酸氢铵的缓冲溶液中，在lmg/ml的浓度下进行变性操作75°C热变性10分钟；冷却至室温后，按照重量比50 1加入胰蛋白酶，在37°C酶解12 16小时。
12.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的目标分析物与标记试剂的反应条件是在体积比为2 2 1的吡啶/乙醇/水的混合溶剂中，于55 60 °C反应90 120分钟。
13.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的除杂后处理是指将目标分析物与标记试剂的反应后溶液用氮气吹干后，用二氯甲烷萃取除去多余的标记试齐LU
14.根据权利要求9所述的同位素标记试剂的应用，其特征在于，所述的电喷雾-离子阱-飞行时间串联质谱(ESI-IT-TOF)分析条件是在正离子的模式下进行数据采集，流动相是体积比为(1 1) (7 3)的乙腈-水溶液，检测器电压为1.7kV，碰撞气为氩气，碰撞能量为10 50%。
全文摘要
本发明公开了一种同位素标记试剂，是异硫氰酸基嘧啶类同位素标记试剂，其化学名为[d0]/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯。该试剂的制备是首先将4，6-二氯-2-氨基嘧啶与甲醇钠/氘代甲醇钠反应，制得[d0]/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗产物；再将所得粗产物与硫光气和碳酸氢钠进行回流反应，得到最终粗产品；然后进行柱层析，即得本发明所述的同位素标记试剂。本发明的同位素标记试剂可应用在多肽N端残基的鉴定分析及蛋白质的定量分析中，可以加快标记反应速率、提高标记肽段的信号、有利于增强鉴定肽段的准确性和可信性；且标记部分的分子量较小，结构相对简单，性质稳定，具有操作简便等优点。
文档编号G01N30/00GK102174025SQ20111002079
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者冷嘉鹏, 张立, 张菁, 王昊阳, 郭寅龙 申请人:中国科学院上海有机化学研究所