专利名称：血清结核分枝杆菌抗体快速检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种快速检测血清结核分枝杆菌抗体的检测试剂及检测方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(M. tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，其传播和传染呈全球性加剧的态势。对结核病流行的国家和地区来说，加强对结核病人特别是传染性结核病人的管理和治疗，是最重要的防治措施。由于多种耐药结核菌的增多、HIV/AIDS的流行、移民、以及不少国家和地区对结核病控制的忽视等因素，20世纪90年代以来，全球结核病死灰复燃而且发病率迅速回升。结核病已成为紧迫的全球公共卫生问题。我国结核病的流行十分严重，在全球仍属高发地区。 主要表现为三高一低患病率高、死亡率高、耐药率高、年递降率低。传染性肺结核疫情居高不下。据2000年全国结核病流行病学抽样调查揭示，全国活动性肺结核患病率为367/10 万，涂阳肺结核患病率为122/10万，推算全国有451万活动性肺结核病人，其中150多万为涂阳肺结核病人，即结核病传染源。15 59岁其活动性、涂阳和菌阳肺结核病例占各类病例人数的53%、61. 6%和56. %。我国结核病死亡居各种死因顺位的第9位，全国结核病死亡专率为9. 8/10万，每年死于结核病者达12万余人，相当于各种其他传染病和寄生虫病死总和的两倍。近年来，我国报告HIV感染和艾滋病呈急剧上升趋势，HIV和结核菌双重感染必将对我国结核病流行带来不可忽视的影响。随着我国加入世界贸易组织后，进出口贸易的迅速发展，交通工具、人员、货物的往来日益频繁，急剧增加的流动人口对于结核病流行和控制带来复杂和负面影响。增加了肺结核传播和扩散的机会，对社会造成极大的危害。因此我国结核病流行形势仍十分严峻。鉴于目前我国对结核病的实验室诊断主要通过痰涂片和病原分离培养，而痰涂片和病原分离培养受实验室条件、检验人员的实验和镜检技术水平的影响较大，灵敏度和特异度都达不到要求，阳性率低，检验时间长，不能满足进行结核病快速检测和诊断的要求。 大量结核病患者未能被及时诊断而延误了治疗时机，这也是目前结核病流行日趋严重、死亡率急剧增高的重要原因之一。因此，迫切需要特异、灵敏、快速、简便易行的肺结核实验筛查、诊断方法和试剂。目前的研究表明结核杆菌菌体抗原能刺激B淋巴细胞分化增殖成浆细胞，并由浆细胞分泌特异性抗体。如Mcholls等用全细胞抗原作凝集反应，Nassau用固相放射免疫法和酶联免疫吸附试验(ELISA)，以及Mahfonz以聚合结核菌素抗原作免疫荧光技术等研究，均证明活动性或某些类型的结核病人体内出现一定量的抗体。虽然抗体难以进入细胞内，对胞内寄生的结核菌免疫作用不显著，但利用体内抗体的测定，作为疾病的辅助诊断和观察化疗疗效的指标是有意义的。Grange等进一步研究证明活动性结核病人体内升高的特异性抗体主要为IgG类。上述研究为免疫学诊断结核病开辟了新的途径。
而运用ELISA检测特异性结核抗体对结核病的诊断和鉴别有重要价值。抗体滴度愈高者，则患结核病的可能性愈大。结核病的血清抗体滴度与临床经过呈正相关。对结核病患病期抗体水平的动态观察结果显示随着治疗好转患者血清抗体水平平行降低。这可作为病情转归的一项参考指标。当早期抗体呈阴性反应，以后抗体反应阳转对诊断有意义；当抗体维持在阳性反应范围，其病状可视为稳定期；抗体水平持续在较高水平，一般认为病情迁延、疗效较差。肺结核，尤其是肺外结核，临床表现的多边性和不典型性，早期诊断较为困难。如采用特异抗原进行特异性IgG抗体的检测，在诊断上具有较高的敏感性和特异性，同时测定血清与腹水或脑脊液中的抗体，二者同时增高则具有极为重要的诊断价值。因此，许多学者致力于从结核杆菌中分离和鉴定特异性抗原用作诊断试剂。已有如结核菌38kDa蛋白等抗原用分别于ELISA、EIA等方法，进行结核病的诊断，但是目前的这些抗原的检测准确率还是较低。因此研究建立完善、快速、简便易行的血清结核分枝杆菌实验诊断方法，进行特异、灵敏、快速诊断试剂的研究、应用是本领域亟待解决的问题。

发明内容
本发明要解决的技术问题是本领域难以快速、较为准确地检测血清中结核分枝杆菌抗体的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种用于检测离体血清中分支结核杆菌的上述细菌的试剂及快速检测方法。本发明的血清结核分枝杆菌抗体检测试剂包含混合的三种结核杆菌抗原蛋白 38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。本发明还提供了结核分枝杆菌抗体检测试剂盒。该试剂盒以结核杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白混合物作为检测抗原。其中，上述的结核杆菌抗体检测试剂盒是免疫检测试剂盒。其中，上述的免疫检测试剂盒是ELISA试剂盒、层析金标法试剂盒或IFA法试剂盒中的任意一种。其中，上述的免疫检测试剂盒是胶体金标记双抗原夹心法试剂盒。进一步的，上述胶体金标记双抗原夹心法试剂盒是双抗原夹心法胶体金试纸卡； 试纸卡的硝酸纤维素膜混合固定有结核杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白三种抗原于检测线上，质控线上固定羊抗兔IgG抗体。本发明提供的血清结核分枝杆菌抗体检测方法包括以下步骤将离体血清与同时含有结核分枝杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的试剂接触，进行抗原抗体反应的检测，根据是否检测到了产生抗原抗体反应，判断离体血清中是否存在结核杆菌抗体。其中，上述方法中所述的抗原抗体反应的检测是靠ELISA法、胶体金标记法或IFA 法中的任意一种进行。其中，上述方法中所述的胶体金标记法为胶体金双抗原夹心法。本发明通过大量工作，创造性地发现，将三种结核杆菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白共同用于血清结核杆菌抗体的检测具有很好的效果， 甚至好于更多种抗原蛋白的组合。并在此基础上开发出了检测试剂和检测方法。将本发明的胶体金免疫层析法试纸卡内部应用到四家省级结核病院，得到的结果证实了这种试剂具有快速(10 15分钟出结果)、敏感(以细菌学检测方法为金标准，敏感度为80. 4% )、特异(特异性为86.3%)、简便等特点。可用于离体血清样本中结核杆菌抗体的快速筛查，适于各级实验室使用，具有很好的应用前景


图1、不同浓度的38kDa抗原蛋白包被酶标板ELISA结果。图2、不同稀释度的结核病病人血清与阴性血清的ELISA检测结果图3、38kDa抗原检测的ROC曲线Wouden指数为0. 51)图4、38kDa+CFP10抗原联合检测的ROC曲线Wouden指数为0. 549)图5、38kDa+MPT64抗原联合检测的ROC曲线Wouden指数为0. 5)图6、38kDa+CFP10+Ag85B抗原联合检测的ROC曲线Wouden指数为0. 52)图 7、38kDa+CFP10+MPT64 抗原联合检测的 ROC 曲线(Youden 指数为 0. 557)图8、胶体金快速检测卡用于结核抗体检测结果。左边3个位阳性结果，右边3个为阴性结果，质控线均可见。
具体实施例方式下面结合附图通过实施例对本发明方法作进一步的描述。实施例一结核分枝杆菌特异性抗原的筛选1特异抗原的筛选、确定采用蛋白质组分析、Western blot等技术，分析了结核分枝杆菌的蛋白抗原谱，确定6种特异性抗原成分38KD、Ag85B、MPT64、16KD、CFP10和IOKD蛋白抗原。2特异蛋白抗原编码基因的克隆、表达和纯化采用分子克隆技术，对确定的38KD、Ag85B、MPT64、16KD、CFPlO和IOKD蛋白抗原成分进行克隆、表达，并采用分子筛和离子交换柱层析获得了纯化抗原，经验证所获产物的序列正确后，将其用于后继试验。当然，使用其他方式获得的结核分枝杆菌的上述抗原蛋白也能用于下述试验并取得相一致的结果。实施例二结核抗原的诊断效能分析和抗原组合方式的筛选试验方法1、确定各抗原最佳ELISA条件1)蛋白浓度的测定蛋白测量仪测得重组蛋白在沈此！！！和^Onm波长的OD值，依据公式蛋白含量=0D280X1. 45+0D260X0. 74(mg/ml)计算出蛋白含量。2)最佳抗原包被浓度的确定用碳酸盐包被液(PH9.6)稀释纯化的蛋白抗原至不同的浓度(10ug/ml、8ug/ml、6ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml、0. 75ug/ml、0. 5ug/ml、 0. 25ug/ml、0. lug/ml、0· 075ug/ml、0. 05ug/ml)，酶标板中每孔加入 0. lml，4°C 过夜；取出， 空干，每孔加入O.aiil 30%小牛血清，4°C过夜；分别加入稀释好的结核病阳性血清和阴性血清，并作空白对照，37°C孵育2小时；加入羊抗人IgG-HRPd 2000)，37°C孵育1小时； 加入四甲基联苯胺(TMB)显色液显色15分钟，而后用2M硫酸终止反应，在495nm波长条件下测OD值；根据测定OD值和蛋白浓度绘出标准曲线，根据标准曲线确定适合的抗原浓度；3)血清抗体稀释度的确定根据已确定的抗原的合适浓度用包被缓冲液稀释抗原， 包被酶标板，4°C过夜；封闭同上步；加待测血清，用结核病病人血清和健康人血清，按一定浓度稀释(1 20、1 50、1 75、1 100,1 125,1 150,1 175,1 200,1 225、 1 250,1 300,1 500)，37°C孵育 2 小时；加入羊抗人 IgG-HRP(l 2000)，37°C孵育 1小时；显色检测OD值同上步；根据检测0D450值，选择0D450值高且稳定的血清最高稀释倍数为合适稀释度；2、利用上述确定的各抗原最佳ELISA条件，检测同样的105份阳性血清和100份阴性血清。3、绘制受试者工作特征曲线法(Receiver Operating Characteristic，ROC)利用 SPSS软件绘制各种抗原诊断的ROC曲线，用ROC曲线来描述该抗原检测的灵敏度和特异度之间的关系，并以^uden指数最大的切点对应的OD值就是该抗原检测的Cut-off值；采用该Cut-off值去判断105份阳性血清和100份阴性血清的阳阴性，待测标本OD >该Cut-off 值为阳性，待测标本OD <该Cut-off值为阴性；4、总结计算出不同抗原组合的灵敏度和特异度、阳性预测值和阴性预测值，采用 Youden指数评价得出最适的抗原组合方式；5、用SPSS软件对^uden指数较高的几种组合进行具体分析，并对筛选出的最佳组合进行综合性评价；实验结果1、蛋白的浓度测量纯化得到的CFP1 OkDa、38kDa、MPT64蛋白和本实验室保存的Ag85B的浓度，各种重组蛋白的浓度分别为 38kDa 2. 53mg/ml、CFP10 1. 24mg/ml, Ag85B 0.41mg/ml、 MPT641. 28mg/ml。2、最佳ELISA反应体系的确定(以38kDa为例)重组蛋白38kDa分别以一系列浓度包被酶标板，结核病病人的血清和健康人的血清按1 50稀释，ELISA检测A值显示2ug/ml为纯化蛋白适宜的包被浓度(参见图1)。重组蛋白38kDa按检测得到的最佳包被浓度包被酶标板，封闭。加入稀释结核病病人血清和健康人血清。结果显示血清为1 225(见图幻适宜稀释度；其他三种的蛋白的ELISA最佳条件摸索实验方法同38kDa，结果见表1 :表1 3种重组蛋白ELISA检测的最佳蛋白包被浓度和血清稀释度
权利要求
1.血清结核分枝杆菌抗体检测试剂，其特征在于包含混合的三种结核杆菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。
2.结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于以结核杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白混合物作为检测抗原。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于所述的结核杆菌抗体检测试剂盒是免疫检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于所述的免疫检测试剂盒是ELISA试剂盒、层析金标法试剂盒或IFA法试剂盒中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于所述的免疫检测试剂盒是胶体金标记双抗原夹心法试剂盒。
6.根据权利要求5所述的结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于所述的胶体金标记双抗原夹心法试剂盒是双抗原夹心法胶体金试纸卡；试纸卡的硝酸纤维素膜混合固定有结核杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白三种抗原于检测线上，质控线上固定羊抗兔IgG抗体。
7.血清结核分枝杆菌抗体检测方法，其特征在于包括以下步骤将离体血清与同时含有结核分枝杆菌38kDa抗原蛋白、CFPlO抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的试剂接触，进行抗原抗体反应的检测，根据是否检测到了产生抗原抗体反应，判断离体血清中是否存在结核杆菌抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述抗原抗体反应的检测方法是靠ELISA 法、胶体金标记法或IFA法中的任意一种。
9.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述胶体金标记法为胶体金双抗原夹心法。
全文摘要
本发明要解决的技术问题是本领域难以快速、较为准确地检测血清中结核分枝杆菌抗体。本发明技术方案是提供一种用于检测离体血清中分支结核杆菌抗体的检测试剂及快速检测方法。本发明的血清结核分枝杆菌抗体检测试剂包含混合的三种结核杆菌抗原蛋白38kDa抗原蛋白、CFP10抗原蛋白和MPT64抗原蛋白。本发明提供的血清结核分枝杆菌抗体检测方法是将离体血清与同时含有结核分枝杆菌38kDa抗原蛋白、CFP10抗原蛋白和MPT64抗原蛋白的试剂接触，根据是否检测到了产生抗原抗体反应，判断离体血清中是否存在结核杆菌抗体。将本发明试剂具有快速、敏感、特异、简便等特点、可用于离体血清样本中结核杆菌抗体的快速筛查，适于各级实验室使用，具有很好的应用前景。
文档编号G01N33/558GK102495206SQ20111043016
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者杨雨, 樊学军, 田绿波, 石莹, 陈肖潇 申请人:杨雨, 樊学军, 田绿波, 石莹, 陈肖潇