专利名称：一种利用纳米材料电极增强电化学发光信号的方法
技术领域：
本发明涉及电化学发光信号检测技术领域，是一种利用纳米材料制备的电极来增强电化学发光检测信号的方法。技术背景
目前对于痕量分析物包括环境污染物、药物、激素、蛋白质、核酸等的高灵敏度定量筛选和检测已经成为广大研究工作者和临床工作者关注的焦点之一。为了实现痕量分析物的高特异性检测，各种基于生物特异性亲合反应如抗原-抗体、核酸杂交、受体-配体反应的生物检测方法和体系日益发展起来。由于生物亲合反应自身产生的物理变化非常微弱，难于直接检测，通常将亲合反应的反应物之一标记上能产生特异信号的物质或分子，称为标记物。根据产生信号的不同，标记物可分为放射性同位素、荧光染料、电化学分子、酶、 化学发光物、电化学发光物等。比如，免疫检测最初使用125I作为标记物，通过放射性信号测量进行检测定量。这个方法精密度高，测定可靠，但由于放射性元素的使用，需要建立特殊的实验室，否则对人体会造成很大的伤害。另外，125I有一定的半衰期。为了克服这些缺点，后来发展了使用酶作为标记物，利用酶催化底物的显色反应进行检测的酶联免疫反应 (ELISA)，但其灵敏度受到了限制。
电化学发光免疫检测技术是在免疫检测技术基础上，继放射免疫、酶联免疫和普通化学发光免疫技术以后的新一代检测技术。与其它技术比较，该技术除了具备普通化学发光所有的灵敏度高、线性范围宽、检测项目广泛、试剂安全等特点外，还具有标记物体积小、试剂稳定、发光剂为单组分、发光信号可控性强等特殊优势，是目前最先进的标记免疫检测技术。电化学发光(ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。在电极上施加一定的电压或电流时，电极上发生电化学反应，在电极反应产物之间、或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态返回到基态时产生发光现象。电化学发光的现象很早就被发现，运用电化学发光进行检测分析的文献报道直至80年代初才出现，90年代开始用于试剂的临床检测中。从整体上讲，电化学发光包括了电化学和化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，但同时与化学发光又有一定的区别和其独特的优势一般的化学发光生物分析的标记物是化学发光反应催化酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或化学发光分子(如鲁米诺、吖啶酯等)，其发光强度受周围环境的影响较大，而且稳定性不高，特别是生物酶。而电化学发光免疫分析一般采用三联吡啶钌Ru(bpy)32+为标记物，Ru(bpy)32+在三丙胺阳离子自由基(TPA+)的催化及三角形脉冲电压激发下，只需毫秒内就可发出稳定的光。Ru(bpy)32+在发光过程中的再循环利用大大提高了分析的灵敏度；小分子的金属配合物作为标记物，稳定性高。因此，电化学发光生物分析有其突出的优点标记物稳定，灵敏度高，过程可控性强。ECL具有更好的发展趋势。
根据科学界公认的ECL反应机理(如图1所示)，产生电化学发光信号的物种是激发态的标记物Ru (bpy) 32+。激发态的Ru (bpy) 32+可以通过两种反应途径生成⑴Ru (bpy) 32+ 在电极上被氧化生成Ru (bpy)33+，同时共反应物三丙胺(TPA)也在电极上被氧化成为TPA+。由于这个有机阳离子在水溶液中不稳定，迅速分解成为自由基TPA+。后者是个极强的还原剂，能与Ru (bpy)33+进行快速氧化还原反应，生成激发态的Ru(bpy)32+。(2) Ru (bpy) 32+在电极上被氧化生成Ru (bpy) 33+，然后通过溶液均相氧化还原反应将TPA氧化，二者再通过上述的反应生成激发态的Ru (bpy) 32+。在生物检测中，一般采用Ru (bpy) 32+作为信号标记物，它的浓度非常低，所以ECL信号产生的主要途径是第一个。由此可以看出，TPA的电极氧化反应是ECL检测中一个非常关键的步骤。在现在通用的体系中，绝大多数都使用金、钼金、碳等作为电极材料，对TPA的电极氧化反应具有较高的活性，所以ECL信号较高。而在常规的金属氧化物电极如氧化铟锡(ITO)电极上，TPA的电极氧化反应非常缓慢，导致ECL信号低。发明内容
本发明的目的是公开一种提高电化学发光信号强度的方法。为达到上述目的，本发明的技术解决方案是
a)以一种金属氧化物导电纳米材料制备成电极；
b)用该电极加快电化学发光体系(发光剂+共反应物)中共反应物的电极反应速率，由此增强电化学发光的信号强度；
所述的电化学发光信号增强方法中，其所述的金属氧化物，为氧化铟、氧化锡、氧化锌、氧化铟锡或其复合物。
所述的电化学发光信号增强方法中，其所述的纳米材料，其形状为球形、线形、管状、片状、立方体形，其尺寸在1-100纳米之间。
所述的电化学发光信号增强方法中，所述的电化学发光体系，发光剂是三联吡啶钌Ru (bpy) 32+或其化学类似物，共反应物是三丙胺或其化学类似物。
本发明与现有的其他方法相比具有以下优点
1)目前流行的电化学发光检测方法中，均使用常规导电材料作为电极，如金、 钼金、玻碳、氧化铟锡厚膜电极等。在这些电极上，特别是在氧化铟锡厚膜电极上，共反应物三丙胺的电极氧化反应速率较慢，导致三丙胺电化学氧化电流偏低，最终影响发光剂Ru (bpy) 32+的电化学发光信号强度。本发明使用了纳米级的金属氧化物材料如氧化铟锡纳米颗粒作为电极，提高了共反应物三丙胺的电极氧化反应速率，最终增强了发光剂 Ru (bpy) 32+的电化学发光信号强度。
2)常规导电材料做成的电化学发光电极，如金、钼金、玻碳等，这些电极的透光性较差，不适合光信号的检测。本发明使用了纳米级的金属氧化物材料如氧化铟锡纳米颗粒作为电极，在提高电化学发光信号强度的同时，也保证了电极的透光性，有利于光信号的检测。


图1含有发光剂三联吡啶钌(Ru (bpy) 32+)和共反应物三丙胺(TPA)的电化学发光体系的信号产生原理图。
图2合成的粒径为25nm的氧化铟锡纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
图3由25nm氧化铟锡纳米颗粒制备的纳米电极的扫描电子显微镜照片。
图4不同电极在0. IM三丙胺中的电化学电流响应曲线图，其中(a)常规氧化铟锡电极；(b)氧化铟锡纳米电极；(c)常规金膜电极。测量条件Ag/AgCl (3M KCl)参比电极， 100mV/s电压扫速。
图5不同电极的电化学发光响应曲线图，其中(a)常规氧化铟锡电极；(b)氧化铟锡纳米电极；(c)常规金膜电极。测量条件:1 μ M Ru(bpy)32+，0. IM三丙胺，150mM磷酸缓冲液，pH 7. 4，Ag/AgCl (3M KCl)参比电极，100mV/s 电压扫速。
图6不同电极对可见光的透光率，其中(a)常规氧化铟锡电极；(b)由1. 25%纳米氧化铟锡胶体制备的纳米电极；(c)由10%纳米氧化铟锡胶体制备的纳米电极。(d)常规金膜电极。
具体实施方式
本发明方法在实施过程中使用的试剂包括以下几种成分金属氧化物纳米材料， 由金属氧化物纳米材料制备的纳米电极，以及可以产生电化学发光信号的发光剂和共反应物。使用的装置包括恒电位仪和弱光检测器(光电倍增管PMT或C⑶成像仪等)。采用上述纳米电极作为工作电极，在电化学发光剂和共反应物存在时，通过恒电位仪向工作电极施加电压，可产生电化学发光信号，光信号由弱光检测器进行定量检测。
以氧化铟锡纳米颗粒、Ru(bpy)32+电化学发光剂、三丙胺共反应物为例，来说明本发明方法的具体实施流程
(1)粒径为25nm的氧化铟锡纳米颗粒的合成
取结晶四氯化锡、三氯化铟以超纯水配成100mL、0. 5M的10% SnCl4+90% MCl3溶液。取IOmL此溶液转入放有磁力搅拌子的锥形瓶中，置于恒温加热磁力搅拌器上(实验过程中恒温在80°C，搅拌转速为600r/min，并加入一片聚乙二醇约0. 03g)。取约0. 8g氢氧化钠以超纯水配成40mL溶液转入固定在锥形瓶上方的滴液漏斗中。控制滴速在约lmL/min 向锥形瓶中滴加NaOH溶液至整个锥形瓶中溶胶pH值为7为止。将已呈灰白色的上述溶胶转移至烧杯中，80°C下加入40mL超纯水，搅拌，静置，分层。去除上层清液后，向溶胶中加入 0. 04% Triton-IOO溶液定容至50mL备用。图2为合成的粒径为25nm的氧化铟锡纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
(2)氧化铟锡纳米电极的制备
导电玻璃购买于深圳南玻集团，导电膜厚度为900 ± 100 A，方阻为19 士 2. 1 Ω / 口。 将导电玻璃自行加工至5cmX5cm规格，分别用洗涤剂(15分钟)、纯水Qmin，两次)、丙酮 (5min)、异丙醇(5min)和纯水(lOmin，两次)超声洗涤，置于50°C烘干。用CTD-1000型等离子体表面处理仪(南京昆仑电子有限公司产品)对导电玻璃表面进行60s处理，以获得更为洁净的表面。取适量(1)中制备的纳米氧化铟锡胶体溶液均勻铺展在导电玻璃表面， 干燥后，置于450°C烧结30min，即获得氧化铟锡纳米电极。经烧结后，氧化铟锡纳米颗粒膜层牢固地吸附于导电玻璃表面(见图3氧化铟锡纳米颗粒制备的纳米电极的扫描电子显微镜照片)。
(3)电化学电流信号的检测
电化学电流信号检测在0. IM三丙胺溶液中(pH 7. 4，150mM磷酸缓冲液)进行。 电化学电流检测装置为CHI 660B电化学分析仪(上海辰华仪器公司)，采用的三电极体系为纳米氧化铟锡、常规氧化铟锡或常规金膜电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极(3M KCl)，钼片为辅助电极，工作电极接触面积为0. 25cm2。不同电极在0. IM三丙胺中的电化学电流响应见图4，可见三丙胺在纳米氧化铟锡电极上的氧化电流显著高于常规氧化铟锡电极上的电流。
(4)电化学发光信号的检测
电化学发光信号检测在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中(pH 7. 4，150mM 磷酸缓冲液)进行。电极电压控制装置为CHI 660B电化学分析仪(上海辰华仪器公司)， 采用的三电极体系为纳米氧化铟锡、常规氧化铟锡或常规金膜电极为工作电极，Ag/AgCl 电极为参比电极(3M KCl)，钼片为辅助电极，工作电极接触面积为0.25cm2。电化学发光信号使用光电倍增管(日本滨松，型号H9306-0;3)采集，利用CHI 660B电化学分析仪对产生的光电流信号进行记录。电化学发光检测在密闭的暗箱中进行。不同电极在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中的电化学发光响应见图5。可见在纳米氧化铟锡电极上的电化学发光信号是常规氧化铟锡电极上的10倍，是常规金电极上的2倍。
(5)电极透光率的测量
以空气作为空白，分别将纳米氧化铟锡、常规氧化铟锡和常规金膜电极放入美国安捷伦89090A型紫外-可见分光光度计的样品池中，测量各个电极在可见光光谱(350-800 纳米)范围内的透光率。不同电极对可见光的透光率见图6，可见由1.25%纳米氧化铟锡胶体制备的纳米电极的透光率与常规氧化铟锡电极比较只有轻微的下降，但远远高于常规金膜电极的透光率。
本发明方法通过采用金属氧化物纳米材料制备纳米电极，加快电化学发光体系中共反应物在电极上的氧化反应速率，由此增强电化学发光剂的发光信号强度，同时保持电极的透光性。与现有的其他电化学发光电极相比，该方法中的电极具有信号高、透光性好等优点，可以用于各种电化学发光检测分析中。
权利要求
1.一种利用纳米材料电极增强电化学发光信号的方法，其特征在于a)以一种金属氧化物导电纳米材料制备成电极；b)用该电极加快电化学发光体系(发光剂+共反应物)中共反应物的电极反应速率， 由此增强电化学发光的信号强度；
2.如权利要求1所述的电化学发光新方法，其特征在于所述的金属氧化物，为氧化铟、氧化锡、氧化锌、氧化铟锡或其复合物。
3.如权利要求1所述的电化学发光新方法，其特征在于所述的纳米材料，其形状为球形、线形、管状、片状、立方体形。
4.如权利要求1所述的电化学发光新方法，其特征在于所述的纳米材料，其尺寸在 1-100纳米之间。
5.如权利要求1所述的电化学发光新方法，其特征在于所述的电化学发光体系中，发光剂是三联吡啶钌Ru(bpy)32+或其化学类似物。
6.如权利要求1所述的电化学发光新方法，其特征在于所述的电化学发光体系中，共反应物是三丙胺或其化学类似物。
全文摘要
一种利用纳米材料电极增强电化学发光信号的方法，涉及电化学发光信号检测技术。该方法以一种金属氧化物导电纳米材料制备成电极，用该电极加快电化学发光体系中共反应物的电极反应速率，由此增强电化学发光的信号强度，提高电化学发光检测技术的灵敏度。本发明与现有的电化学发光电极材料相比，具有信号强度高、透光性好等优点，特别适合电化学发光信号的检测。
文档编号G01N21/76GK102539411SQ201010578278
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者郭良宏 申请人:郭良宏