专利名称：荧光标记DNA分子量内参照试剂(InMarker)的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、基因组学、分子生物学，它应用基因工程方法，可以提供一个用于确定DNA片段大小的试剂，不仅适用于普通的凝胶电泳，还能适用于基因分析仪。该技术可应用于分子生物学、遗传学、人类学、法医物证生物学等学科领域的基因分析、基因诊断以及个体识别等方面。
背景技术：
人类基因组计划旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。研究发现，生物个体的很多性状和病变是由多个基因控制决定的，即多基因系统。对于这些性状和病变的研究不能只针对单个基因作用，而要综合考虑多个相关基因的作用并考虑环境影响的因素，进行综合的分析。
基因扫描方法通过对相关基因的连锁分析，研究各个基因在多基因体系中的作用。基因诊断运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因结构及其表达方式，是目前诊断技术中一类简便、灵敏、快速、实用的方法，在这一技术中，为了准确的给各等位基因进行定位和识别，必须有用于确定DNA片断大小的标准。目前国内使用的DNA分子量参照标准基本都是经过酶切得到的，片断大小虽然也很精确，但是一般都只能用作DNA分子量外参照标准，国内使用的分子量参照标准(marker)试剂的不足之处一是大都是分子量外参照标准，即电泳时样品与分子量参照标准不在同一条泳道上，由于电泳条件的差异，会引起系统误差。二是要批量生产，必须要经常去挑选和制备能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的纯度及含量等均有出入，使其扩增条件难以标准化。三是利用人基因组DNA作模板，分子量大，结构极其复杂，扩增时极容易出现非特异性扩增，不适合批量生产。四是这些试剂都是自身不带荧光的，需要另外添加染料，不能进行荧光检测，灵敏度低，只能适用于普通的电泳，而不能应用于遗传分析仪等荧光检测仪器，应用范围有限。

发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种荧光标记DNA分子量内参照试剂(InMarker)的制备方法，其具体步骤如下按照国内外公开发表的序列，建立不同片段大小的模板；根据模板设计合成所需荧光和非荧光的引物，分别进行PCR反应；将PCR产物连接到载体上，得到不同片断大小的基因克隆；将单克隆转化到大肠杆菌中，得到含有不同片断大小的基因的质粒；利用质粒作为模板，用相应的含有荧光标记的引物分别进行PCR扩增，制备不同大小的PCR扩增产物；根据各个PCR扩增产物的荧光值检测定量各个基因；等摩尔量混合不同片断大小的PCR扩增产物，用三氯甲烷抽提；用荧光检测法测定，使峰高保持一致，峰值在400-500之间；即得到荧光标记DNA分子量内参照试剂(InMarker)；将荧光标记DNA分子量内参照试剂装入试剂盒。
本发明特点如下1.本发明是一种分子内参照试剂，即样品与分子量内参照标准品在同一泳道上进行电泳分析，电泳条件是一致的，不会产生系统误差；2.根据国内外所发表的分子量内参照标准，设计合成模板，通过基因工程方法制备；3.据模板设计合成所需的荧光引物及普通引物，进行PCR反应，检测简便，准确。
4.本发明所制备分子量内参照标准试剂，除可用于荧光检测外，也可用于普通电泳检测。
5.用于扩增的分子内参照试剂模板是通过分子克隆技术制备的，该模板的DNA序列经测序验证，分子大小精确，确保了对待测样品DNA长度和大小的计算和鉴定更加科学准确。
6.通过分子克隆技术得到的模板长度远远小于人基因组DNA的长度，容易线性化和解链，在相同条件下，得到的扩增产物远高于人基因组DNA扩增的量，而且非特异性扩增产物也远少于人基因组DNA的扩增产物，所以容易批量生产。
7.不同大小的片段是一条一条制备的，然后分别测定其含量，等摩尔量混合后制成分子量标记，这样就确保了各片段含量的一致性。
8.用分子克隆技术制备的模板更容易做到定性定量测定，一次标准化的模板可以用好多年，尽可能地避免了因为每批模板质量的差异，使生产更加标准化和产品质量更加稳定。
本发明除了现有技术的优点之外，还具有如下的优点1.建模板的稳定性较高。
2.本方法制备的内参照试剂物中含有特定强化的片断，便于识别。
3.本法制备的内参照试剂片段，全部使用于定标，而没有定标范围之外的多余片断。
4.制作流程简便，周期短，操作简单。
5.制作成本低，经济实用，6.能批量生产，稳定性好。
具体实施例方式
荧光标记DNA分子内参照试剂的制备方法具体步骤根据国内外所发表的分子量参照标准，设计合成一段100bp的模板；根据模板设计合成所需的荧光引物及普通引物，荧光引物为CAG CCA CAATGA CAG CAG CTA，非荧光引物为CGA CTC ACT ATA GGG AAA GCT GGTGGT A；按照下列程序进行PCR反应95℃10min 94℃30s 63℃30s 72℃60s60℃45min------40cycles----用TAKARA T-Vector载体试剂盒将PCR产物连接到载体上，将含有DNA片段的载体转化到大肠杆菌中，过夜培养，即PMD18-T载体0.015pm，连接溶液12.5ul，经纯化的PCR产物0.075pm，4℃过夜，取5ul转化至DH5α感受态100ul中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂糖平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落。
按照申友公司质粒抽提试剂盒(或其他公司的同类产品)说明书提取质粒即将LB液体培养基培养的重组菌转移到2ml离心管中，最高速度离心30秒，弃上清，加250ulS1溶液，振荡至彻底悬浮；加入250ulS2溶液，立即温和地上下翻转离心管5-10次以混匀，；加入400ul4℃预冷的S3溶液，立即温和并充分地上下翻转离心管5-10次以混匀，室温静置2min，最高速离心10min；将上清转移到DNA吸附柱中，离心2min，弃虑液；加入500ulW1溶液，离心30s，弃虑液；加入700ulW2液，离心30s，弃虑液；再加入700ulW2液，离心30s，弃虑液；将吸附柱放入同一收集管中，最高速离心1min；移入新的1.5ml离心管中，在DNA吸附膜中央加60ul洗脱液，室温静置1min，离心1min洗脱DNA，使用PCR法确认插入片断的长度大小，测序鉴定，保存备用；利用不同片断大小的质粒模板用相对应的荧光引物以及普通引物分别进行PCR反应，制备出不同片断大小的PCR产物；等摩尔量混合不同片段大小的PCR扩增产物，用三氯甲烷抽提；用荧光检测法测定，使峰高保持一致，峰高值在400-500之间，即可得到所需的荧光标记DNA分子量内参照试剂。
将荧光标记DNA分子量内参照试剂装入试剂盒。
权利要求
1.一种荧光标记DNA分子量内参照试剂(InMarker)的制备方法，其具体步骤如下按照国内外公开发表的序列，建立不同片段大小的模板；根据模板设计合成所需荧光引物和普通引物，分别进行PCR反应；将PCR产物连接到载体上，得到不同片断大小的基因克隆；将单克隆转化到大肠杆菌中，得到含有不同片断大小的基因的质粒；利用质粒模板将每个质粒用对应的荧光标记引物分别进行PCR，制备不同片断大小的基因；根据各个PCR扩增产物的荧光值检测定量各个基因；等摩尔量混合不同片断大小的PCR扩增产物，用三氯甲烷抽提；用荧光检测法测定，使峰高保持一致，峰高值在400-500之间；即得到荧光标记DNA分子量内参照试剂；将荧光标记DNA分子量内参照试剂装入试剂盒。
2.根据权利1所述的一种荧光标记DNA分子量内参照试剂制备方法，其特征在于所述的本发明分子量内参照试剂，有别于一般的分子量marker，它与样品在同一条电泳跑道上，电泳系统条件相同，没有系统误差。
3.根据权利1所述的一种荧光标记DNA分子量内参照试剂的制备方法，其特征在于所述的引物为荧光染料标记的引物及非荧光染料标记的引物，可以通过荧光检测。
4.根据权利2所述的一种荧光标记DNA分子量内参照试剂的制备方法，其特征在于所述电泳系统采用遗传分析仪毛细管电泳，激光激发荧光信号，CCD检测收集信号。
5.根据权利1所述的一种荧光标记DNA分子量内参照试剂的制备方法，其特征在于所述电泳系统也可以采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
全文摘要
本发明公开了荧光标记DNA分子量内参照试剂(In Marker)的制备方法。通过建立模板，合成所需荧光引物，进行PCR反应，得到不同片断大小基因的质粒，制备扩增产物，用荧光检测，得到荧光标记DNA分子量内参试剂。本发明所建模板稳定性高，制备的内参照试剂中含有特定强化的片断，便于识别。制作流程简便，周期短，操作简单，成本低，经济实用，适宜于批量生产。
文档编号G01N21/76GK1641340SQ20041005366
公开日2005年7月20日 申请日期2004年8月12日 优先权日2004年8月12日
发明者陈光辉 申请人:上海申友生物技术有限责任公司