专利名称：可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法
技术领域：
本发明涉及一种检测自身抗体的芯片和检测方法，具体涉及一种可同时检测80 种自身抗体的蛋白质芯片和方法。
背景技术：
自身抗体为人体内出现的针对自体蛋白质(或称自身抗原)的抗体。自身抗体的出现通常预示着机体免疫系统出现异常状况，不能正确识别和处理凋亡坏死的自身抗原物质，从而产生针对自身抗原的抗体。自身抗体的出现与多种疾病的发生发展有密切关系，特别是自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎等，自身抗体在疾病发展的早期即可以出现在血液中，随着病情的发展，自身抗体的种类和滴度不断增加。因此，测定体内自身抗体的种类和水平对疾病的早期诊断、病情监测以及预后判定都有重要意义。传统检测自身抗体方法为基于微孔板的酶联免疫检测法(ELISA)，或基于微球载体的免疫荧光检测技术，这些技术的缺点是检测的自身抗体数量有限(一般不超过 10种)，且需要较大量的样本(一般需要100 μ L血清)。近年虽有应用蛋白质芯片技术检测自身抗体的方法和产品问世，但一般仅能检测8种自身抗体。能同时检测十种以上自身抗体的蛋白质芯片和技术目前尚未成熟。

发明内容
本发明的目的是提供一种可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，它可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正， 并生成各自身抗体信号强度的图表。为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片固定在一起。它的检测方法为1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化；2、抗原蛋白与生物素交联 增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析。所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白打印在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗原点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原点样区位于各个孔的正中位置。本发明精选80种目前已经临床证实的与自身免疫性疾病相关的自身抗体，首先选择与这些自身抗体相对应的抗原(蛋白质)，通过蛋白质交联技术，将抗原蛋白和生物素(Biotin)联接，然后利用微阵列技术，用微阵列点样仪将生物素化的抗原固定于包被了亲和素(Sti^ptavidin)的玻片载体上。每张玻片05mmX73mm)被划分为16个区块，每个区块均含有70种自身抗原和8种对照蛋白，每种蛋白均重复两次。因此，每张芯片均含有16 个包含了 80种自身抗原和8种对照蛋白的蛋白质微阵列，可同时检测16个样本。检测装置为一个有16个孔的橡胶分隔垫片和两个固定夹，橡胶分隔垫片与玻片大小一致，其孔的位置和大小与玻片上16个蛋白点样区的位置符合。检测时，首先将橡胶分隔片放置于玻片表面，用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起，将1 μ L样本与50 μ L样本稀释剂混合后，加入橡胶分隔片的孔中进行反应，60min后弃反应液，加入100 μ L洗涤液，振荡洗涤3次，每次 5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1 1000 稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸入PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm);3min使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为5;35nm(Cy3)和632nm(Cy5)。图像用Gen印ix6. 0软件分析，得出各点Cy3和Cy5 的荧光强度，并以Cy3为内参算出各点的校正信号强度，然后用自身抗体分析软件，计算出各个自身抗体的平均强度。本发明可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。


图1为本发明中玻片的结构示意图，图2为本发明中处理后玻片的结构示意图，图3为本发明中橡胶分隔片的结构示意图，图4为本发明中金属固定夹的结构示意图，图5为本发明检测装置的装配结构示意图。
具体实施例方式参照图1-5，本具体实施方式
采用以下技术方案它的检测装置是由玻片1、橡胶分隔片2和金属固定夹3组成，橡胶分隔片2设置在玻片1上方，两侧分别插入金属固定夹 3的凹槽中，将玻片1和橡胶分隔片2固定在一起。它的检测方法为1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化将玻片浸泡在一定浓度的亲合素(Sti^ptavidin)溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4°C 冰箱备用。2、抗原蛋白与生物素交联增加抗原的结合强度和灵活度。用Solulink ChromaLink试剂盒进行抗原蛋白和生物素分子的交联，将100 μ g抗原蛋白在交联液透析平衡，然后加入试剂Chromalin-biotin进行标记反应(室温90min)，将标记物过柱，去除游离的Chromalin-biotin，收集标记后的蛋白，进行蛋白定量并测定交联效率。3、抗原芯片的制备将抗原用抗原稀释剂稀释为lmg/mL，并转入384孔板中。用喷射式微阵列点样仪将抗原打印在玻片表面的NC膜上。每张玻片上点制16个膜块，每个膜块都含有80个抗原和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复两次。点样时湿度保持在75%。完成后室温放置浊，然后真空包装，4°C可保存两年。4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体检测时，首先将芯片恢复至室温，然后将橡胶分隔片放置于玻片表面，使带有抗原的NC膜块位于分隔片的孔中。用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起。加入50 μ L封闭液于每孔中，室温封闭30min后吸去封闭液，将1 μ L样本与50 μ L样本稀释剂混合后，加入孔中进行反应，60min后吸去反应液， 加入100 μ L洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素 Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1 1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗 3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸入PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm);3min， 使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)，图像用 Genepix6. 0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度。5、数据分析用自身抗原芯片分析软件进行分析。首先每个抗原点荧光强度 (Cy5)用内参(Cy!3)进行标准化校正，然后每个抗原取平均值，即为抗原所对应抗体的表达强度。所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白打印在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置与孔径与抗原打印区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原打印区位于各个孔的正中位置。本具体实施方式
可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。
权利要求
1.可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于它的检测装置是由玻片(1)、橡胶分隔片( 和金属固定夹C3)组成，橡胶分隔片( 设置在玻片(1)上方，两侧分别插入金属固定夹(3)的凹槽中，将玻片(1)和橡胶分隔片O)固定在一起。
2.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于它的检测方法为1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化将玻片浸泡在一定浓度的亲合素溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4°C冰箱备用；2、抗原蛋白与生物素交联增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片将抗原用抗原稀释液稀释为lmg/mL，并转入384孔板中，用喷射式微阵列点样仪将抗原点在玻片表面的NC膜上，每张玻片上分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗原和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复点样两次，点样时湿度保持在75%，点样完毕后室温放置2h，然后真空包装；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析用自身抗原芯片分析软件进行分析。
3.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白点样在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。
4.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗原点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原点样区位于各个孔的正中位置。
全文摘要
可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，它涉及一种检测自身抗体的芯片和检测方法。它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片固定在一起。它的检测方法为1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化；2、抗原蛋白与生物素交联增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析。它可同时检测80种自身抗体，操作简便，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。
文档编号G01N33/543GK102539740SQ20101061014
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者李全贞 申请人:河北省健海生物芯片技术有限责任公司