专利名称：Thbs-1的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉THBS-I的新用途。
背景技术：
前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是北美国家男性中最常见的恶性肿瘤之一，据 2009年美国癌症协会统计数字表明，新确诊为前列腺癌的患者占该年新确诊为恶性肿瘤患者的25% [1]，占男性肿瘤的第一位；死亡人数占总男性恶性肿瘤死亡人数的9%，仅次于肺癌(33%)。在我国，随着人口结构逐步老龄化和生活环境的改变，前列腺癌的发病率正在逐年增高，处于快速发展阶段。分泌蛋白质组是指能分泌到细胞外的全部蛋白质总和，其广义的含义为通过多种方式、能够“释放”到细胞外的全部蛋白质。肿瘤细胞分泌蛋白中的一部分可以释放入血， 成为潜在的血清标志物。质谱技术为肿瘤标志物的发现提供了一个庞大的蛋白质序列数据库。直接对恶性细胞的分泌蛋白进行分析，对鉴定血清中的恶性肿瘤标记物来说是一个更高效的方法。前列腺是一个雄激素依赖性器官，雄激素撤除治疗对于前列腺癌早期有效，但是患者往往会在这样的治疗后约两年时间发展为雄激素非依赖性，雄激素撤除治疗便失去了作用，肿瘤往往会获得更强的侵袭性和转移能力。LNCaP (雄激素依赖性AR阳性)是具有代表性的前列腺癌细胞系，C4-2细胞(雄激素非依赖性和AR阳性)是由LNCaP演变而来的细胞系。将LNCaP接种于裸鼠皮下8周并将裸鼠去势，4周后取出肿瘤接种于裸鼠皮下，再次将裸鼠去势。这样就得到了 C4-2细胞，它们与LNCaP细胞遗传背景相同，但却获得了雄激素非依赖的生长能力，并具有更强的成瘤性。LNCaP和C4-2细胞很好地模拟了临床上患者的病情发展过程，是国际上承认的前列腺癌研究细胞模型。PC3是前列腺癌骨转移的细胞模型，雄激素受体阴性；C4-2B，该细胞系也是由LNCaP演变而来，为骨转移的细胞系，同样也具有雄激素非依赖的性质；DU145是前列腺癌脑转移的细胞系，雄激素受体阴性。凝血敏感蛋白l(thrombospondin-l，THBS-1)是α血小板颗粒的主要成分，可以与细胞表面CD36结合抑制内皮细胞的迁移和管腔形成。THBS-I的氨基酸序列如SEQID NO 1所示。前列腺特异性抗原(PSA)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

发明内容
本发明的一个目的是提供凝血敏感蛋白1的新用途、抗凝血敏感蛋白1的抗体的新用途及检测凝血敏感蛋白1的试剂盒的新用途。本发明所提供的抗凝血敏感蛋白1的抗体的新用途是抗凝血敏感蛋白1的单克隆抗体和/或抗凝血敏感蛋白1的多克隆抗体在制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。上述抗体均是从商业途径得到的抗体，或经细胞体外培养得到的抗体，具体可购自R&D公司。
本发明所提供的检测凝血敏感蛋白1的试剂盒的新用途是检测凝血敏感蛋白1的试剂盒在制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。本发明所提供的凝血敏感蛋白1的新用途的新用途是凝血敏感蛋白1在设计和/ 或制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。上述任一所述应用中，所述抗凝血敏感蛋白1的单克隆抗体为抗凝血敏感蛋白1 鼠单克隆抗体。上述任一所述应用中，所述癌症为前列腺癌、膀胱癌或肾透明细胞癌。上述任一所述应用中，所述前列腺癌为前列腺特异性抗原(PSA)阴性的前列腺癌。上述任一所述应用中，所述PSA阴性为血清中PSA浓度小于等于lOng/ml。上述任一所述应用中，检测凝血敏感蛋白1的试剂盒具体可购自R&D公司，产品目录号为DTSP-10。上述任一所述应用中，所述凝血敏感蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；前列腺特异性抗原(PSA)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。实验证明，用THBS-I的单抗或检测THBS-I的试剂盒检测THBS-I浓度值，进而诊断前列腺癌，对前列腺癌的阳性诊断率为100%，更突出的是，该方法能将PSA阴性(血清 PSA水平小于lOng/ml)的前列腺癌患者诊断为阳性，说明该方法的精确度明显高于现有的 PSA诊断方法。


图1为THBS-I浓度的对数与血清双夹心ELISA检测获得的校正后450nm光吸收 (0D450Correct)的对数拟合的标准曲线。图2为THBS-I在前列腺癌患者和其他男性泌尿系肿瘤患者血清中的表达明显高于正常老年人。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、试剂盒的组成一、试剂盒组成试剂盒(Human Thrombospondin-I定量试剂盒)购自R&D公司，产品目录号为 DTSP-10，具体组成如下1、Thrombospondin-IMicorplate :^1^7 Thrombospondin-I H13 11 #白勺 96孔聚苯丙烯微板(8孔X 12条)；2、Thrombospondin-IConjugate :21ml 偶联了辣根过氧化物酶的抗 Thrombospondin-I 多克隆抗体；3> Thrombospondin-IStandard =IOOOng Thrombospondin-I 重组蛋白冻干粉；4、Assay Diluent RD1-56 :17ml 缓冲蛋白溶液；5、Calibrator Diluent RD5-33Concentrate :2 管(21ml/ 管)缓冲蛋白碱；
6、Wash Buffer Concentrate :21ml/管25 X缓冲表面活性剂浓缩溶液(含防腐剂)；7、Color Reagent A :12. 5ml 稳态过氧化氢溶液；8、Color Reagent B :12. 5ml稳态色原质(四甲基联苯胺)；9、Stop Solution :6ml 2mol/L 硫酸水溶液；10、Plate Covers 微板密封条 4 条。实施例2、试剂盒诊断前列腺癌一、用试剂盒进行检测的方法(一 )工作液的制备和标准品、样品的稀释Wash Buffer 工作液20ml Wash Buffer Concentrate，加入去离子水定容至 500ml。Calibrator Diluent RD5-33 工 # if :20ml Calibrator Diluent RD5-33Concentrate与20ml去离子水充分混勻。 Thrombospondin-I 丰示 M ηππ # # ^ IOOOng Thrombospondin-I M S S ^ ^ 粉加入Iml去离子水，轻轻搅动，然后静置15分钟以上使其充分溶解，即得IOOOng/ mlThrombospondin-1 t示 M ηππ C # 1。 ffi Calibrator Diluent RD5-33 工 # if M Thrombospondin-I标准品贮存液进行7次二倍稀释，获得了浓度分别为500，250，125， 62. 5，31. 3,3. 1,15. 6和7. 8ng/ml的标准品稀释液。用不加标准品的Calibrator DiluentRD5-33工作液作为空白对照(Ong/ml)；用于上样血清样品10 μ 1血清加入990 μ 1 Calibrator Diluent RD5-33工作液， 充分混勻。( 二)操作步骤2.1标准曲线的制备(1)取出两条Thrombospondin-lMicorplate，余下重新用锡箔密封好；(2)每孔加入 100 μ 1 Assay Diluent RD1-56 ；(3)每孔分别加入 50 μ 1 Thrombospondin-I 浓度为 500，250，125，62. 5，31. 3， 3. 1，15. 6和7. 8ng/ml的标准品稀释液及空白对照，每个浓度做两个重复。用Plate Covers 密封各个孔，常温在微型摇床(转速为500rpm)孵育两小时；(4)彻底弃去每孔中的样品，将每孔加满Wash Buffer工作液(约400 μ 1)，常温在ELISA专用洗板机上洗3分钟，彻底弃除Wash Buffer工作液，重复该清洗4次，最后一次结束后，将Ilirombospondin-IMicorplate倒扣在清洁的纸巾上。(5)每孑L力口入 200 μ 1 Thrombospondin-lConjugate，用 Plate Covers 密封各个孔，常温在微型摇床(转速为500rpm)孵育两小时；(6)彻底弃去每孑L中的 Thrombospondin—lConjugate，将每孑L力口满 Wash Buffer X 作液(约400 μ 1)，常温在ELISA专用洗板机上洗3分钟，彻底弃除Wash Buffer工作液，重复该清洗4次，最后一次结束后，将Thrombospondin-lMicorplate倒扣在清洁的纸巾上。(7) Color Reagent A与Color Reagent B等体积混合，混合后15分钟内必须使用；(8)每孔加入200 μ 1 (7)混合液，常温避光孵育30分钟；
(9)每孔加入50μ1 Stop Solution，颜色应由蓝色变为黄色，如果颜色不均一，轻拍微板使其内容物充分混合；(10)30 分钟内用微板读数器(Microplate Reader,Model 680,Biorad)读取各个孔的450nm和570nm光吸收读数，后者减去前者得到每孔的0D450*读数，计算每个浓度两个重复0D450*读数的平均值，该值减去空白对照孔两个重复0D450*读数的平均值即为每 f Thrombospondin-I 农貞)(寸0D450Correct 1 . Thrombospondin-I 农it禾口)(寸jS 的0D450Correct分别取对数，应用Microsoft Office Excel 2003软件绘制散点图，并拟合线形关系，获得标准曲线(举例如表1，图1)。标准曲线的函数式为y = 0. 6664X-1.325。 R2 = 0. 9762。表 IThrombospondin-I 双夹心 ELISA 检测
权利要求
1.抗凝血敏感蛋白1的单克隆抗体和/或抗凝血敏感蛋白1的多克隆抗体在制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。
2.检测凝血敏感蛋白1的试剂盒在制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。
3.凝血敏感蛋白1在设计和/或制备用于辅助诊断癌症的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述癌症为前列腺癌、膀胱癌或肾透明细胞癌； 所述抗凝血敏感蛋白1的单克隆抗体为抗凝血敏感蛋白1鼠单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述前列腺癌为前列腺特异性抗原阴性的前列腺癌。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述前列腺特异性抗原阴性为血清中前列腺特异性抗原浓度小于等于lOng/ml。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于所述凝血敏感蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述前列腺特异性抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。
全文摘要
本发明公开了THBS-1的新用途。该新用途为凝血敏感蛋白1在设计和/或制备用于诊断前列腺癌的试剂盒中的应用。实验证明，用THBS-1的单抗或检测THBS-1的试剂盒检测THBS-1浓度值，进而诊断前列腺癌，对前列腺癌的阳性诊断率为100％，更突出的是，该方法能将PSA阴性(血清PSA水平小于10ng/ml)的前列腺癌患者诊断为阳性，说明该方法的精确度明显高于现有的PSA诊断方法。
文档编号G01N33/577GK102346188SQ20101024444
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者周建光, 钱晓龙 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所