专利名称：一种以离子液体作为添加剂的反向微乳毛细管电动色谱分析化妆品中的糖皮质激素的方法
技术领域：
本发明属于分析检测技术领域，公开了采用以离子液体作为添加剂在反向电压下，利用微乳毛细管电动色谱法测定化妆品中糖皮质激素的方法。
背景技术：
糖皮质激素(Corticosteroids),是由肾上腺皮质分泌的一类留体激素,具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢的作用，有重要的生理活性，如抗炎及抗过敏，降低毛细血管壁和细胞膜的通透性，减少炎性渗出等作用。在一些化妆品中添加少量糖皮质激素能增加抗过敏的疗效并能提高皮肤的嫩白程度，长期使用该类物质易使皮肤产生激素依赖症。短时间使用激素可使皮肤保湿，恢复弹性，减少皱纹或治疗粉刺，促进毛发生长。但长期使用含有激素的化妆品会导致很多副作用，如皮肤长期接触糖皮质激素易导致皮肤变薄、发红、发痒，出现血糖升高、高血压、骨质疏松、胎儿畸形、免疫功能下降等现象。皮肤长期接触有些激素甚至能引发细胞癌、乳腺癌、卵巢癌等疾病。我国的化妆品规范中规定化妆品中不得添加激素类物质。这就需要高效快速的方法来检测其含量，这对于化妆品的质量控制有重要意义。关于糖皮质激素的测定方法有高效液相色谱法、LC-MS, GC-MS、毛细管电动色谱法和薄层色谱法等。其中高效液相色谱是最常用的方法，但是该方法需要比较复杂的样品预处理过程去除基质，且液相色谱仪及液相色谱柱价格昂贵，仪器的运行成本也比较高。因而有必要建立一种简单、快速、灵敏度高且成本低的检测方法。离子液体(ILs)是一种新型的绿色溶剂，由特定阳离子和阴离子构成，在室温或近于室温下呈液态的熔盐体系，可以和有机溶剂、水混溶或不溶形成两相或多相反应体系。作为一类新型的绿色溶剂，离子液体具有非常广泛的应用前景。离子液体良好的热稳定性、化学稳定性和溶解性使其非常适合用作色谱固定相，既可以用来分离极性物质，也可以用来分离非极性物质。在毛细管电动色谱方法中也常利用离子液体作为添加剂来改善分离度。

发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种以离子液体作为添加剂，利用反向微乳毛细管电泳(MEEKC)法测定化妆品中三种结构相似的糖皮质激素(氢化可的松，泼尼松，醋酸氢化可的松)的方法，该方法样品处理简单、样品用量少、方法经济快速、具有优良的分离度和灵敏度高等优点。本发明的目的通过下列的技术方案实现以离子液体作为添加剂，在反向电压下，利用合适的微乳体系同时分离分析三种糖皮质激素，达到同时检测的目的。该方法的检测步骤如下(I)精密称取氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松各14. Omg, 17. Omg, 16. Omg,置于10. OOmL容量瓶中，加甲醇超声溶解后，冷却至室温，再加甲醇稀释至刻度，摇匀后即得。避光4°C保存。使用时根据需要稀释成不同浓度的标准液。(2)在反向电压下利用经典的微乳体系，以磷酸二氢钠(pH. 2. 2)作为缓冲液，在低电渗流条件下用微乳毛细管电动色谱法(MEEKC)分离分析三个物质。再以离子液体作为添加剂的微乳毛细管电动色谱法(IL-MEEKC)分离分析三个激素，得到标准谱图。(3)采用离子液体作为添加剂的微乳毛细管电动色谱法，在最佳检测条件下，对样品的提取液进行分析，获得样品的毛细管电泳图。(4)根据氢化可的松，醋酸氢化 可的松，泼尼松的校正曲线方程，计算出步骤(3)中化妆品样品中的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松含量。所述最佳检测条件为微乳液的组成为SDS 2.4% (界/界)，正丁醇6.6% (w/w)，正辛烷0. 5 % (w/w),35mmol/L I-甲基-3-正丁基四氟化硼(BMM-BF4)，20mmoI/L磷酸二氢钠缓冲液(pH =
2.2)。微乳毛细管电动色谱条件采用低pH条件有效地抑制了电渗流，建立起低电渗流体系。在分析中采用的运行条件为在反相电压条件下，以含离子液体BMIM-BF4的微乳液作为运行液，运行电压_20kV(检测端位于正电压一端)，运行温度20°C，检测波长250nm。步骤(3)中化妆品样品预处理过程按照以下步骤进行称取2. OOOg化妆品，力口A 25. OOmL甲醇，超声助溶30min，过滤定容于50. OOmL。所有溶液进入毛细管前均经过0. 45um过滤膜过滤，经超声脱气后使用。对毛细管进行如下处理毛细管在使用时，分别用0. lmol/LHCl、超纯水、0. Imol/LNaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗lOmin。两次MEEKC样品分析运行期间，分别用0. lmol/L NaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗5min，以获得良好的分离检测重现性。在最佳的检测条件下，氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松在9分钟内达到基线分离，显示了良好的分离选择性和灵敏度。三个物质在该方法的线性范围分别为5-400 y g/mL、5-400 u g/mL 和 5-800 u g/mL,检出限为 0. 9 y g/mL、0. 9 u g/mL 和 I. 2 y g/mL (S/N = 3)，迁移时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别小于4. 8%和3. I %。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(I)本发明为化妆品的质量控制提供技术支持，检测快速；(2)环境友好，经济环保，所用的缓冲液多为水相，无需消耗大量的有机溶剂，比液相色谱更环保，更有利于检测者的身体健康；(3)分析成本低，所需样品和溶剂都很少，检测一个样品消耗的缓冲溶液不到lmL，且不需要特殊的色谱柱，仅使用普通的空心毛细管柱，价格比一般的色谱柱要低好几倍，使用方便；


图I为标准品混合液的微乳毛细管电动色谱图，其中I为氢化可的松和泼尼松，2为醋酸氢化可的松。图2为标准品的混合液的图离子液体微乳毛细管电动色谱图，其中I为氢化可的松，2为泼尼松，3为醋酸氢化可的松。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。所需的仪器装置为CAPEL105高效毛细管电泳系统，配有紫外检测器；未涂层石英毛细管(0 75iimX65cm，有效长度50cm)。所需试剂氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品，十二烷基硫酸钠(SDS)，磷酸二氢钠(NaH2PO4)，I-甲基-3-正丁基 四氟化硼(BMM-BF4)，磷酸，乙腈，甲醇，0. lmol/L HCl，0. lmol/L NaOH,超纯水,所用缓冲液及样品溶液均经过0. 45 y m过滤膜过滤后使用。I)最佳检测条件的确定(I)微乳运行液的配制用超纯水分别配制浓度为120mmoI/LNaH2PO4和100mmol/L I-甲基_3_正丁基四氟化硼(BMM-BF4)母液。a.利用浓度为 120mmol/L NaH2POjP IOOmmoI/L BMM-BF4母液，配制 SDS分别为质量比 6. 6%，3. 3%，3. 0%，2. 8%，2. 4% 的 15mmol/L 磷酸二氢钠(pH = 2. 2)-正丁醇 6. 6%(w/w)_正辛烷0. 5% (w/w)MEEKC缓冲液。用5mmol/L氢氧化钠和磷酸调节pH为2. 2。超声30min即得不同浓度的透明稳定的微乳溶液。b.利用浓度为 120mmol/L NaH2POjP IOOmmoI/L BMM-BF4母液，配制 SDS分别为质量比 6. 6%，3. 3%，3. 0%，2. 8%，2. 4% 的 15mmol/L 磷酸二氢钠(pH = 2. 2)-正丁醇 6. 6%(w/w)_ 正辛烷 0. 5% (w/w) -25mmol/L BMIM-BF4 的 IL-MEEKC 缓冲液。用 5mmol/L 氢氧化钠和磷酸调节pH为2. 2。超声30min即得不同浓度的透明稳定的微乳溶液。c.利用浓度为120mmol/L NaH2PO4母液，配制磷酸二氢钠浓度分别为10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L 和 30mmol/L 的 SDS 质量比 2. 4% -正丁醇 6. 6% (w/w)-正辛烧 0. 5%(w/w) -25mmol/L BMIM-BF4的IL-MEEKC缓冲液。用5mmol/L氢氧化钠和磷酸调节pH为2. 2。超声30min即得不同浓度的透明稳定的微乳溶液。d.利用浓度为 120mmol/L NaH2PO4 和 IOOmmo I/L BMIM-BF4 母液，配制 BMM-BF4 分别为 10mmol /I,、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L 和 SOmmoI /I,的 SDS 质量比 2. 4 -正丁醇6.6% (w/w)_正辛烷0.5% (w/w)-20mmol/L磷酸二氢钠缓冲液的IL-MEEKC缓冲液。用5mmol/L氢氧化钠和磷酸调节pH为2. 2。超声30min即得不同浓度的透明稳定的微乳溶液。(2)标准品的配制精密称取氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松各14. Omg, 17. Omg, 16. Omg,置10. OOmL容量瓶中，加甲醇超声溶解后，冷却至室温，再加甲醇稀释至刻度，摇匀后即得。避光4°C保存。使用时根据需要稀释成不同浓度的标准液。运行电压_20kV，检测波长250nm。(3) MEEKC法分离分析氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松将步骤(2)中的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品进行微乳毛细管电动色谱法分析，在进样压力为3kPa，进样时间15s、检测波长250nm，检测温度为20°C条件下，在 SDS 的质量比为 6.6%，3.3%，3.0%，2.8%，2.4% 的 15mmol/L 磷酸二氢钠(pH =
2.2)-正丁醇6. 6% (w/w)_正辛烷0. 5% (w/w)的MEEKC缓冲液之间调节SDS的质量比，在反向15-20kV之间调节分离电压。综合峰形对称、分离度好、重现性好等检测条件为最佳检测条件，发现用经典的微乳体系无法使这三个结构相似的物质很好地实现分离。(4) IL-MEEKC法分离分析氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松
将步骤(2)中的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品进行离子液体微乳毛细管电动色谱检测，检测波长250nm，检测电压_20kV，检测温度为20°C，在SDS的质量比为6. 6%-2. 4%之间的15mmol/L磷酸二氢钠(pH = 2. 2)-正丁醇6. 6 % (w/w)-正辛烷0. 5% (w/w)-25mmol/L BMIM-BF4的IL-MEEKC缓冲液之间调节SDS的质量比，在磷酸二氢钠浓度分别为10mmol/L-30mmol/L之间的SDS质量比2. 4% -正丁醇6. 6% (w/w)-正辛烷0.5% (w/w)-25mmol/LIL-MEEKC运行缓冲液中调节磷酸二氢钠的浓度，在BMM-BF4 浓度为 10mmol/L-50mm ol/L 之间的 SDS 质量比 2. 4% -正丁醇 6. 6% (w/w)_ 正辛烷0. 5% (w/w)-20mmol/L磷酸二氢钠的IL-MEEKC缓冲液中调节BMM-BF4浓度，在反向电压15-25kV之间调节分离电压。根据峰形对称、分离度高、分析时间短、重现性好等条件选择了最佳检测条件微乳液的组成为SDS 2. 4% (w/w)，正丁醇6. 6% (w/w)，正辛烷0. 5%(w/w),35mmol/L 1_甲基_3_正丁基四氟化硼(BMM-BF4)，20mmo I/L磷酸二氢钠缓冲液(pH= 2.2)。进样压力为3kPa，进样时间15s，运行电压-20kV(检测端位于正电压一端)，运行温度20°C，检测波长250nm。2)氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品的微乳毛细管电动色谱同时分离检测将氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品溶液，分别在在最佳MEEKC条件和IL-MEEKC条件下进行分离分析，电泳谱图分别如图I、图2所示。3)校正曲线的制定将氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品溶液分别稀释为400i! g/mL、200 u g/mL、100 u g/mL、25 u g/mL、10 u g/mL、5 u g/mL、2 u g/mL 的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准。在最佳检测条件下，对上述系列标准溶液进行毛细管电泳分析。以分析物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校正曲线，获得校正曲线方程、线性相关系数，线性范围和检测下限如表I所示。表I三种糖皮质激素的线性范围和检出限。表I氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松的线性范围和检出限
mmEEmi线性方程相关系数检出限
AnalyteLinear range (ng/mL) Regression equationR2LOD(S/N=3)
____(Hg/mL)
L0Q42」 丽百丽'^5j0400 ——099709
泼尼松5.0-400y = 3.38xl03* -0.810.9990.9
醋酸氢化可的松5.0-800y =1.26x10^+ 1.210.9981.24)重现性实验在最佳检测条件下，考察重现性分别吸取浓度为IOii g/mL、50 ii g/mL、IOOii g/mL的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松在一天内连续进样测定5次，记录迁移时间和峰面积，考察日内精密度。再将上述三份浓度每天进行检测，连续检测5天，记录迁移时间和峰面积，考察日间精密度。氢化可的松，醋酸氢化可的松的迁移时间和峰面积的日内精密度在3. 1% 4. 4%和2. 4% 3. 6%之间，曰间精密度分别为4. 1% 5. 4%和3. 1% 4. 8%之间。5)实际样品检测加标样品提取液的制备称取2. OOOg不同品牌的化妆品乳液、霜剂、爽肤水和洗面奶，加入25. OOmL甲醇，超声助溶30min，过滤定容于50. OOmL。所有溶液进入毛细管前均经过0. 45 i! m过滤膜过滤，经超声脱气后使用。得到空白样品提取液。取空白提取液2mL，将氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品加入到空白溶液中，分别配制成浓度为20 y g/mL>60 u g/mL的加标样品提取液。根据电泳图谱和步骤3)所得的校正曲线方程，计算得到回收率和RSD见表2。按上述优化实验方法对某品牌化妆品中的乳液、霜剂、爽肤水和洗面奶进行测定，平行测定3次。按照实验方法进行回收率实验(见表2)，每个添加水平平行测试3次，结果可知，三个物质的回收率在91 % 105 %之间，其RSD均小于4. 3 %，说明建立的方法具有良好的准确性和重复性。表2回收率实验结果
~加.标量回收率相对标准偏差￥均回收率
AnalyteAddedRecovery */%RSD/%Average
/((ig/mL)(n=3)recovery*/%
一~20~105 _4.3~" 102"
60973.7
泼尼松201024.097
60923.1
醋酸氢化可的松20972.794
60913.6^Recovery = (Found-Background)/AddedX 100%。在实验过程中，为保证获得较高的信号响应和较好的检测重现性，需对毛细管进行适当的处理毛细管在使用时，分别用0. lmol/L HCl、超纯水、0. Imol/LNaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗lOmin。两次MEEKC样品分析运行期间，分别用0. lmol/L NaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗5min，以获得良好的分离检测重现性。
权利要求
1.一种以离子液体作为添加剂的反向微乳毛细管电动色谱同时分析化妆品中的三种糖皮质激素的方法， 其特征在于包括如下步骤 (1)准确称取氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松各14.Omg, 17. Omg, 16. Omg,置于.10.OOmL容量瓶中，加甲醇超声溶解后，冷却至室温，再加甲醇稀释至刻度，摇匀后即得。避光4°C保存。制成待测标准品混合液，使用时根据需要稀释成不同浓度的标准液。在普通MEEKC和IL-MEEKC模式下，在最佳检测条件下，对氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品进行毛细管电泳分析。得到标准谱图。
(2)采用IL-MEEKC方法在最佳检测条件下，对样品的空白提取液和加标提取液进行分析。
(3)根据氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松的校正曲线方程，计算出步骤(2)中不同加标样品中氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松的回收率。
所述最佳检测条件为 微乳液的组成为=SDS 2.4% ( / )，正丁醇6.6% (w/w)，正辛烷 0. 5% (w/w), 35mmol/L I-甲基-3-正丁基四氟化硼(BMM-BF4)，20mmol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH = 2. 2)。进样压力为3kPa，进样时间15s，运行电压_20kV(检测端位于正电压一端)，运行温度20°C，检测波长250nm。
根据权利要求I所述的一种同时分离分析化妆品中的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松的方法，其特征在于步骤(2)化妆品中的氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松的样品预处理过程按照以下步骤进行称取2. OOOg不同品牌的化妆品乳液、霜剂、爽肤水和洗面奶，加入25. OOmL甲醇，超声助溶30min，过滤定容于50. OOmL。所有溶液进入毛细管前均经过0. 45 y m过滤膜过滤，经超声脱气后使用，得到空白样品提取液。取空白提取液.2mL,将氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松标准品加入到空白溶液中，分别配制成浓度为..20 u g/mL、60 u g/mL的加标样品提取液。
根据权利要求I所述的一种以离子液体作为添加剂的反向微乳毛细管电动色谱同时分析化妆品中的三种糖皮质激素(醋酸氢化可的松，泼尼松)的方法，其特征在于对毛细管进行如下处理 毛细管在使用时，分别用0. lmol/L HC1、超纯水、0. lmol/L NaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗lOmin。两次MEEKC样品分析运行期间，分别用0. lmol/L NaOH、超纯水、运行缓冲液冲洗5min，以获得良好的分离检测重现性。
根据权利要求I所述的一种以离子液体作为添加剂的反向微乳毛细管电动色谱同时分析化妆品中的三种糖皮质激素(氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松)的方法，其特征在于在最佳的富检测条件下，氢化可的松，醋酸氢化可的松，泼尼松在9分钟之内能达到基线分离。迁移时间和峰面积的日内精密度在3. I % 4. 4%和2. 4% 3. 6%之间，日间精密度分别为4. 1% 5. 4%和3. 1% 4. 8%之间。检出限为0.9-1.2iig/mL(S/N = 3)，加标加收率在91% 105%之间。
全文摘要
本发明属于分析检测技术领域，公开了采用以离子液体作为添加剂，在反向电压下利用微乳毛细管电动色谱法测定化妆品中糖皮质激素(氢化可的松，泼尼松，醋酸氢化可的松)的方法。该方法采用IL-MEEKC对化妆品的提取液进行分析检测，获得氢化可的松，泼尼松，醋酸氢化可的松的电泳谱图，根据校正曲线方程可以计算出三个物质的浓度。本发明能够同时分析检测化妆品中氢化可的松、泼尼松、醋酸氢化可的松的浓度。方法简单、快速和高效；所用的缓冲液主要是水溶液，无需大量使用有机溶剂，污染小，环境友好；所需溶剂和样品用量小，使用的空心毛细管柱价格便宜，分析成本低。
文档编号G01N30/02GK102706971SQ20101057972
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者刘瑛, 陈新 申请人:江南大学