专利名称：一种双功能探针及其制备方法与在检测g-四链体结构中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型双功能探针及其制备方法，以及其在检测G-四链体核酸二级结构的用途。
背景技术：
G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的DNA 二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c_myb、bcl_2、PDGF> kRAS、VEGF> Rb和胰岛素基因等。最新研究表明，很多非编码区的RNA序列也可以形成G-四链体结构，RNA的G-四链体结构比DNA更稳定，该结构可能通过阻止基因的翻译或参与蛋白结合识别的过程而达到抑制肿瘤生长的效果。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些 启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前体外实验中检测G-四链体结构主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振、表面等离子共振、荧光共振能量转移等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的Isaindigotone类的化合物,其对G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素结构融合到Isaindigotone结构当中，利用分子内电荷转移的机理,得到了新型的G-四链体探针。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种双功能探针。本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。本发明的再一个目的在于提供上述探针在检测G-四链体结构的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
本发明提供了一种双功能探针，其结构式为
权利要求
1.一种双功能探针，其特征在于结构式为
2.如权利要求I所述的双功能探针，其特征在于A—为N原子甲基化反应后的阴离子。
3.—种如权利要求I或2所述的双功能探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤 先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物
4.如权利要求I或2所述的双功能探针在检测G-四链体结构中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构1)将待测DNA溶于PH值7.2-7. 4的缓冲液，得到溶液A ;将所述探针溶解，再用PH值7. 2-7. 4的缓冲液稀释，得到溶液B ； 2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为f3，混合后对混合液进行紫外可见光谱分析或荧光光谱分析，或者在日光或紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为G-四链体结构；判断方法如下 (a)在日光下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在日光下的颜色由红色变为蓝紫色，则待测DNA为G-四链体结构； (b)在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到荧光增强，则待测DNA为G-四链体结构； (c)对混合液进行紫外可见吸收光谱分析时，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰发生红移，则待测DNA为G-四链体结构； Cd)对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则待测DNA为G-四链体结构。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于判断方法(c)中，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰红移50-70nm，则待测DNA为G-四链体结构。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于判断方法(d)中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强20倍或以上，则待测DNA为G-四链体结构。
8.如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。
9.如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于所述探针用二甲基亚砜溶解。
10.如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于溶液A和溶液B的混合反应时间为2分钟。
全文摘要
本发明公开了一种双功能探针及其制备方法与在检测G-四链体结构中的应用。该类探针制备简单、易得，并且结构稳定，可用于特异性检测G-四链体核酸二级结构，可以通过紫外可见吸收光谱，或者荧光分光光度计，或者直接通过肉眼观察就可以快速检测出溶液中的DNA样品的二级结构。该类探针对G-四链体核酸二级结构的检测方法具有操作简便，选择性好，快捷，肉眼可见的优点，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。
文档编号G01N21/31GK102719238SQ201210207279
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者古练权, 叶文杰, 谭嘉恒, 颜金武, 黄志纾 申请人:中山大学