专利名称：：全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法及其分析仪器的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种医疗检测仪器类血细胞分析方法及仪器，特别涉及一种全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法及其分析仪器。
背景技术：
：1、历史回顾血细胞分析仪，也称血细胞计数仪，是对血液中各种组成细胞进行计数和分类分析的最常用的重要临床检验仪器的一种。1852年就有人试图对红细胞计数，1855年出现了用于血细胞计数的方法。这种用显微镜人工镜检的方法既费时又费力，需专业训练的操作人员，在大批量标本检查时难以及时给出报告，并存在人为计数误差。1949年，美国人瓦莱思·库尔特(WallaceH.Coulter)顺利地在美国提交了发明专利，并在1953年获得了此项专利USPatent2656508“MEANSFORCOUNTINGPARTICLESSUSPENDEDINFLUID"(〃悬浮在液体中粒子的计数方法〃)。同年，库尔特送交了两台库尔特血细胞计数仪原型给(美国)全国卫生研究所NationalInstitutesofHealth(NIH)作鉴定。NIH不久就在发布的两篇关键性文章中，肯定了血细胞计数的库尔特方法的准确性和便利性。也是在同年，库尔特在美国全美电工大会(NationalElectronicsConference)上发表了他一生中唯一的技术论文《高速自动化血细胞计数和细胞大小分析仪》(“HighSpeedAutomaticBloodCellCounterandCellSizeAnalyzer")。用显微镜方法需要30分钟的人工镜检时间，用库尔特血细胞计数仪在15秒的时间内即可完成，同时检测样本的大小也增加了100倍，并且误差降低了近10倍。1958年，瓦莱思·库尔特(WallaceH.Coulter)和他的弟弟约瑟夫·库尔特(JosephCoulter,Jr.)共同创建了"库尔特电子公司“，开始销售库尔特血细胞计数仪。从此开启了血细胞计数和分析自动化的新纪元。瓦莱思·库尔特(WallaceH.Coulter)因其发明的库尔特原理(CoulterI^inciple)于1960年获得了享有崇高声望的约翰斯葛特科学成就奖(JohnJcottAwardforScientificAchievement)，这一为有独创性的男女设立的科学成就奖创始于1816年，是专门颁发给对人类具有革命性发明的发明家，迄今获此殊荣的发明家中，大家较熟悉的有发明电灯的爱迪生(ThomasEdison)，发现原子裂变的居里夫人(MarieCurie)，无线电通信的奠墓人马可尼(GuglielmoMarconi)等著名科学家和发明家。2、库尔特原理(CoulterPrinciple)(参见图2)一个容器(图2中的微孔池21)被分成两个部分(图2中的微孔管22)，两个部分由一个微孔25连结，两个电极沈、27分别置于容器的两个部分，于是电流就在通路中形成(图2中的微孔电流观)，当悬浮在弱电解质溶液中的一个粒子(例如血细胞24)通过微孔时，由于粒子的阻抗比电解质溶液的阻抗大，在微孔25两端就有一个瞬时的阻抗增加。微孔阻抗改变的区域形成了一个"敏感区"。阻抗的瞬间变化产生一个电脉冲，通常被称为直流(DirectCurrent)脉冲，简称DC脉冲。这一DC脉冲的幅度与通过微孔25的粒子的体积成正比。这就是库尔特原理。利用库尔特原理就可以对通过微孔的粒子进行计数并分析粒子的大小，这种方法也被称为直流阻抗法或库尔特阻抗法。库尔特原理可以对各种不同的粒子进行分析，不仅适用于血细胞，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业等，航空航天工业中同样也用来检测燃料的纯度。库尔特原理和库尔特阻抗法是血细胞计数及分析的最为经典的原理和方法，自发明一直沿用至今，是任何一台血液分析仪器所必不可少的组成部分，而其原理和方法几十年来基本上没有什么根本的改变。3、血液成分，参见图6及参考文献1)血液由血浆61(58%)和有形细胞成分62(42%)组成。有形分成主要包括红细胞64(每微升4-5百万个，RBC为红细胞RedBloodCell的简称)、白细胞65(每微升59千个，WBC为白细胞WhiteBloodCell的简称)和血小板63(每微升20-40万个，PLT为其Platelet的简称)三大类。白细胞65可以粗分为粒性白细胞(Granulocyte)，淋巴细胞69(Lymphocytes)和单核细胞610(Monocyte)。粒性白细胞包括嗜碱粒细胞68(Basophil)，嗜酸粒细胞67(Eosinophil)和中性粒细胞66(Neutrophil)。所以白细胞可以细分为五个亚细胞群，即淋巴细胞69、单核细胞610、中性细胞66、嗜酸细胞67、嗜碱细胞68。4、三分类和五分类血细胞分析仪由于库尔特原理是以粒子通过微孔时电阻抗的变化产生的DC脉冲的幅度来鉴别不同体积的血细胞，而白细胞中的中性、嗜酸、嗜碱三种细胞的体积很接近，所以仅用库尔特原理制成的血细胞分析仪只能将白细胞分为三类，故称为三分类仪器，即中性粒细胞(GRN)，淋巴细胞(LYM)，和中间细胞群(MID，包括嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞)。能鉴别白细胞中的五种组分(即淋巴、单核、中性、嗜酸、嗜碱细胞)并分类计数的血细胞分析仪就是通常所称的五分类血细胞分析仪。为了达到五分类的目的，90年代，激光光散射、射频、化学染色计数等方法相继被应用于对细胞特性的分析，出现了五分类血液分析仪。5、基于流式细胞仪原理的激光光散射方法为利用激光光散射，90年代开始出现基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪，其基本原理可用图7来说明。核心部分是通称为流式细胞盒71(FlowCell)的提供液体和粒子通道的小盒，如图8所示。在一个约4毫米x4毫米x8毫米的石英长方柱体沿长轴在中心以某种方法(譬如激光)钻出一条直径约50微米的直通微孔，然后从直通孔的两端磨出相对对准的两个圆锥83，直至在方柱体的中心留有约70微米长的微孔，称为微通孔(道)84(0rifice)，如图8所示，这就是流式细胞盒。激光束81从水平方向射入并聚焦在微通孔84的中心，当粒子沿垂直方向通过微通孔84的中心时，就会和激光相互作用，产生前向、侧向和后向等各个方向的光散射(LightScattering，缩写为LS)，即前向光散射(forwardlightscatter)，侧向或90°光散射(sidelightscatter)，和后向光散射(backlightscatter)，一般缩写为FLS，SLS和BLS。侧向或90°光散射可由90°光散射或荧光探测装置79来检测，而前后向光散射和轴向光损失可由前后向光散射和轴向光损失检测装置710来检测(在参见图7)。82表示鞘套流束，85表示样本(粒子)流束。5在图7所示的仪器中，照明方式是激光光源77的光束的转播方向(图中是水平方向)与粒子的流动方向(图中是垂直方向)相互正交，这里我们称之为正交照明方式，以便与本发明的共轴照明方式加以区别。现今世界上所有基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪都是用这种正交照明方式。为了能使粒子一个一个相继的通过微通孔的中心，除了适当的稀释悬浮粒子的溶液的浓度外，还需用鞘流束流体包围含有被测粒子的样本(粒子)流束，这就是通称为流体聚焦法(HydrodynamicFocusing)。在上下两个圆锥内各安装一个电极73，当粒子通过微(通)孔72时，就会产生前述的库尔特直流脉冲(DC)，微孔电流74。这样，当每一个粒子通过微通孔72时，就可以同时得到三个以上的信号，如DC，FLS和SLS。如在上述的两个电极上再加上高频电源，就可以同时多得到一个信号，这也是库尔特先生的另一个重大发明，(USPatent3502974)称为射频法，简称为(RF)JPRadioFrequency的缩写。图中，71.是流式细胞盒；75是鞘套流束；76是样本(粒子)流束；78是表示聚焦透镜；79.90°光散射或荧光探测装置；710是前向光散射及轴向光损失检测装置。对粒子内部组成成分和结构敏感的测试方法有90度光散射(SLS)，射频法(RF)，荧光染色技术，后向光散射(BLS)等。其中又以后向光散射最为敏感，只是由于技术上的瓶颈目前还没有解决，至今在市场上的高端血液分析仪器只利用了其它几种方法，如CoulterMAXM、STKS等用VCS技术，即Volume(DC)，Conductivity(RF/DC)，和Scattering(FLS)。SysmexSE-9000,XE-2100等则用了DC、LS和荧光染色技术，ABBOTT则有90度光散射的专利，它的仪器一般用DC、FLS和SLS。本发明的高端血液分析仪器只用DC、FLS和BLS，是迄今世界上第一次把后向光散射用于商业化的实用高端血液分析仪器。6、后向光散射在激光散射粒子分析技术中，相对于其它方向的散射，后向散射对粒子的内部结构具有更高的敏感性。1979年，KerkerM，参考文献幻等指出，只有后向光散射对细胞内部形态和结构有敏感性，1983年Kerker，参考文献幻，从对弹性光散射理论基础的回顾进一步指出，有关细胞的形状和内部结构的信息可以最好的从后向的光散射信号来获得。1986年，Sloot和Figdor，参考文献4)在其理论文章中指出，为了最优化的探测混杂在一起的有核血细胞中不同的细胞类型，需要同时探测前向、侧向和后向的散射光。文中的计算表明，后向散射光的强度取决于细胞核对细胞质的比例及细胞核和细胞质的光学密度的变化。文中的分析特别强调了后向散射光的强度与细胞核的透明度之间的直接相关性。2004年DakotaWatson，参考文献5)等也对各个方向的光散射强度与细胞形态的关系作了较详细的论述，并作了相应的实验。在以上这些工作的基础上，近年也有一些关于后向光散射的美国专利，如USPatent6743634B2(Kramer,June1，2004)和USPatent6869569B2(Kramer,March22,2005)0这些专利所给出的方法，都是用多根光纤和多个光电倍增管作后向散射光信号的探测，其结构和成本都与实用的商业仪器的要求相距甚远。
发明内容本发明提供了一种创新的照明方式，即对经典的库尔特微孔直接的共轴轴向照明，共轴轴向照明的意思就是光束传播的方向的光轴与库尔特微孔轴重合(同轴)的照明，这种照明方式的采用，可以彻底摒弃现有的基于流式细胞仪原理的血细胞分析仪器中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，使对粒子内部组成成分和结构特别敏感的后向光散射探测首次应用到商业血液分析仪器中，从而极大的提高了仪器的鉴别能力，不仅能完成血细胞的五分类分析计数，还能提供更多参数的综合检测和分析，使本发明的仪器成为一台高性价比的高端血液分析仪器(HematologyAnalyzer)。本发明的高端血液分析仪器只用直流脉冲信号(DC)，前向光散射信号(FLS)和后向光散射信号(BLS)，是迄今世界上第一次把后向光散射用于商业化的实用高端血液分析仪器。为了实现上述目的，本发明提供一种全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，它使光散射法可以直接应用于传统的库尔特微孔，其特征在于，将照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴。另外，为使库尔特原理的微孔池能形成光束的通道以照明库尔特微孔，微孔管改制成把微孔池分隔为两部分的微孔板，并在微孔池相对微孔的前后开两个光学窗口。进一步所述微孔池相对微孔的前后的两个光学窗口，每一所述光学窗口可以是一光学平板或一对透镜或其它光学元件。本发明也提供一种库尔特微孔的共轴照明血液分析仪器，它包括照明光学系统、安装有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信号探测光学系统，其特征在于，所述照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴。本发明的优点及达到的技术效果表现在以下几个方面1)定义整个库尔特微孔区为探测敏感区，探测敏感区可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的几个部分的组合。2)由于微孔池壁上的光学窗口离库尔特微孔中心(聚焦激光束的光腰)的距离较远，光学窗口上的激光强度远小于光腰处的激光强度，使从光学窗口上反射的光强度大为降低，从而大为降低了后向散射光探测时的噪音背景。这也是基于流式细胞仪原理的血液分析仪器中探测后向散射光时不可克服的技术瓶颈(usPatent6646742,Gangsteadetal.,Nov.11，2003)。如图8所示，在探测后向散射光时，聚焦激光束要先照到长方柱体的表面(距库尔特微孔中心约2mm)，然后再照到库尔特微孔的园柱形表面(距库尔特微孔中心约25微米)，因为这里的聚焦激光束强度很大，反射的光强度相应也较大，使原本强度就很弱的后向散射光(比前向散射光强度小约3个数量级)的探测因器壁反射产生的噪音背景太大而无法达到可接受的信噪比要求。而本发明的照明方法正可克服这一后向散射光探测的技术瓶颈。3)如
背景技术：
5中所述，现今世界上所有基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪都是用的正交照明方式。在本发明由于照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，这样光束与粒子相互作用的区域就为整个库尔特微孔，这在光束与粒子相互作用的区域和时间上，本发明的共轴照明方式具有绝对的优势。例如，本发明的共轴照明方式中，光束与粒子相互作用的区域为整个库尔特微孔(见图9右，标号4a，约100微米长，直径50微米的圆柱)，而在正交照明方式中，光束与粒子相互作用的区域仅为约20微米的聚焦光束尺寸(见图9左，标号94)。光束与粒子相互作用的时间，本发明的共轴照明方式约为正交照明方式的5倍，所探测到的散射光信号的时间宽度也相应的增宽，这就对探测器的时间响应的要求相应的下降，从而可以使用较大面积的光电探测器，及增加接收角度范围的选择性。4)以上共轴照明方式的优点，可使散射光信号强度至少增加5倍，再结合下述的只对空间某特定区域敏感的信号探测光学系统，可以使后向散射光信号的信号对噪音比(S/N)大为提高，从而大为提高了仪器对不同种类细胞的鉴别能力。5)本发明使用只对空间某特定区域敏感的信号探测光学系统，即只对图5中的探测敏感区中的粒子(图中血细胞B)产生的光散射信号有响应，对探测敏感区外的粒子(图中血细胞A、C、D)，即使处于照明光束中，其所发出的光散射信号也不能到达光电探测器。至于从微孔池壁上的光学窗口(图3、4中元件37)反射的构成后向散射的背景噪音更无法进入光电探测器。这一特殊设计的光学系统使本发明的仪器特别在后向仅有极低的噪音，后向散射光的信号对噪音比(S/N)甚至高于DC的(S/N)，如图13所示。6)本发明是对库尔特微孔直接照明，因而彻底摈弃了现有的基于流式细胞仪原理的血细胞分析仪器中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，所以有“简单的结构、低故障、低成本、易操作“等一系列优点。本发明以独特的照明方法巧妙的结合了库尔特阻抗法和光散射法，不需任何附加的试剂处理和荧光染色等增加仪器操作复杂性的任何方法，以其后向光散射探测而得到的高鉴别率、简单的结构、低故障、低成本、易操作等一系列优点，与世界上现有的占市场主导地位的基于流式细胞仪原理的高端血液分析仪器相比，具有明显的性价比和市场优势。这种方法不仅可以用于血液分析仪器中，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，及对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业等。航空航天工业中同样也可用来检测燃料的纯度等。图1是说明本发明的激光束光轴与库尔特微孔轴同轴的共轴照明。其中标号说明41.库尔特微孔(直径50微米)42.圆片(100微米厚的库尔特微孔板)43.激光光束光轴与库尔特微孔轴(同轴)44.血细胞45.聚焦激光束图2是库尔特原理示意图。其中21.库尔特微孔池22.库尔特微孔管23.血细胞悬浮液24.血细胞25.库尔特微孔26.外电极27.内电极28.微孔电流29.真空图3是具有光通道的库尔特微孔池的示意图。其中，31.库尔特微孔池32.库尔特微孔板33.血细胞悬浮液34.血细胞35.库尔特微孔36.内外电极37.光学窗口38.微孔电流39.真空图4是用透镜做窗口的库尔特微孔池的示意图。其中，31.库尔特微孔池32.库尔特微孔板33.血细胞悬浮液34.血细胞35.库尔特微孔36.内外电极37.透镜用作光学窗口38.微孔电流39.真空图5是光散射信号敏感区的示意图。其中，51.直径50微米的库尔特微孔52.激光束53.敏感区54.敏感区后部55.敏感区中部56.敏感区前部57血细胞A、B、C、D58.激光束光轴与库尔特微孔轴(同轴)59.前向光散射信号510.后向光散射信号511.100微米厚园片库尔特微孔板图6是表示血液的组成成分的示意图。其中，61.血浆62.血液的有形成分63.血小板64.红血球65.白血球0091]66中性粒细胞0092]67.嗜酸粒细胞0093]68.嗜碱粒细胞0094]69.淋巴细胞0095]610.单核细胞0096]图'是分基于流式细胞仪的光散射血分析仪的基本原理图，其中0097]71.流式细胞盒0098]72.库尔特微孔0099]73.电极0100]74.微孔电流0101]75.鞘套流束0102]76.样本(粒子)流束0103]77.激光光源0104]78.聚焦透镜0105]79.90°光散射或荧光探测装置0106]710.前向光散射及轴向光损失检测装置0107]图6是流式细胞盒的示意图，其中0108]81.激光束0109]82.鞘套流束0110]83.园锥0111]84.微通道(Orifice)0112]85.样本(粒子)流束0113]图9是共轴照明方式与正交照明方式的比较示意图。其中0114]91.正交照明方式0115]92.血细胞0116]93.正交照明方式中库尔特微孔中心处的椭园型高斯聚焦激光光斑0117]94.正交照明方式中激光与细胞(粒子)相互作用区域0118]4a.共轴照明方式中激光与细胞(粒子)相互作用区域0119]95.库尔特微孔壁0120]96.库尔特微孔0121]97.流式细胞盒中库尔特微孔的长度0122]98.库尔特微孔直径0123]99.圆锥0124]910.共轴照明方式0125]911.共轴照明方式中库尔特微孔的长度0126]912库尔特微孔直径0127]913.共轴照明方式中聚焦激光束光腰0128]图10是使用本发明的共轴照明方式的检测系统的具体实施例，其中0129]1.微孔电流2.电极3.库尔特微孔4.血细胞5.血细胞悬浮液6.光学窗口7.聚焦激光束8.照明光学系统9.照明激光强度的实时监测光学系统10.后向散射光接收光学系统11.分光板12.光纤13.激光器14.前向散射光接收光学系统图11是使用本发明的共轴照明方式的检测系统的另一具体实施例，其中1.微孔电流2.电极3.库尔特微孔4.血细胞5.血细胞悬浮液6.光学窗口7.聚焦激光束8.照明光学系统9.照明激光强度的实时监测光学系统10.后向散射光接收光学系统11.分光板12.光纤13.激光器14.前向散射光接收光学系统图12是本发明的照明方法的标准粒子的前向散射光和直流脉冲信号的示波器记录图，其中，下轨迹为直流脉冲(DC)信号，上轨迹为前向散射光(FLS)信号。前向的直流背景920毫伏。图13是本发明的照明方法的标准粒子的后向散射光和直流脉冲信号的示波器记录图，其中，下轨迹为直流脉冲(DC)信号，上轨迹为后向散射光(BLS)信号。后向的直流背景9.60毫伏。图14是本发明的照明方法的质控血样的后向散射光和直流脉冲信号的示波器记录图，其中，下轨迹为直流脉冲(DC)信号，上轨迹为后向散射光(BLS)信号。中轨迹为后向散射光(BLS)经滤波后的信号。后向的直流背景M毫伏。具体实施方法下面结合附图及其实施例，对本发明的作详细描述。11本发明的实施主要是把照明光学系统、安装有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信号探测光学系统等直接涉及本发明的部分，按仪器设计要求与仅用基于库尔特阻抗法的三分类仪器适当合理的整合起来，从而成为一台仅用库尔特阻抗法和光散射法的具有高鉴别力的高端全功能血液学分析仪器。本发明的区别特征在于所述照明光束传播方向与库尔特微孔的轴线一致。参见图1，在本发明中，照明激光光束45的传播方向的光轴与库尔特微孔41的轴线同轴，它使光散射法可以直接应用于经典的库尔特微孔。在一片几毫米直径、厚100微米的红宝石圆片42的中心打一个50微米直径的通孔41，就成了一个经典的库尔特微孔。把沿库尔特微孔轴传播的光束45聚焦到微孔41的中心(如图1所示)。这种照明方式在库尔特原理发明至今近60年的世界血液分析仪器历史上尚属首创。其优越性在本说明书的其余部分将得到充分的阐述。血细胞44可以通过通孔41。当然，上述圆片42的材料和尺寸、微孔的直径可根据具体要求设定。再参见图1，由于照明光束45的传播方向的光轴与库尔特微孔41的轴线同轴，所以图中轴线43既是照明光束45转播方向的光轴，也是空心圆柱型的库尔特微孔41的圆柱的中心轴。上述方法使用的照明光源，可以是激光器(气体激光器，如He-Ne激光器，Ar离子激光器，半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器等)，也可以是发光二极管(LED)，气体放电光源、自灼光源等。上述使用的光源的波长范围，根据不同的应用，可以从紫外、可见到红外波段中的一种或几种。当照明光束沿库尔特微孔轴传播时，应使用适当的光学系统把光束聚焦到均勻地充满整个库尔特微孔。当使用的光源为激光器时，应使聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于库尔特微孔的直径，而其瑞利范围(RayleighRange)则大于几个库尔特微孔的长度。图3是根据库尔特原理(参见图2、的微孔池能形成光束的通道以照明库尔特微孔，将图2的微孔管22改制成把微孔池31分隔为两部分的微孔板32，并在微孔池31相对微孔35的前后开两个光学窗口37，如图3所示，窗口37上可以是如图3所示的一对光学平板，也可以是如图4所示一对透镜或其它光学元件。该光学元件可将光源的光束聚光到微孔35中。由此可见，本发明的微孔池31可以在常用的库尔特原理微孔池上稍加改进。在图3、图4中，33表示血细胞悬浮液，34代表血细胞，36.代表内外电极，38是产生的微孔电流。微孔池31表示真空39(例如，真空度可为6”Hg)。由此可见，由于上述微孔池壁上的光学窗口37离库尔特微孔35的中心(聚焦激光束的光腰)的距离较远，光学窗口37上的激光强度远小于光腰处的激光强度，使从光学窗口37上反射的光强度大为降低，从而大为降低了后向散射光探测时的噪音背景。这也是基于流式细胞仪原理的现有的血液分析仪器中探测后向散射光时不可克服的技术瓶颈(USPatent6646742,Gangsteadetal.，Nov.11,2003)。再如图8所示，在现有技术的情况，在探测后向散射光时，聚焦激光束要先照到长方柱体的表面(距库尔特微孔中心约2mm)，然后再照到库尔特微孔的园柱形表面(距库尔特微孔中心约25微米)，因为这里的聚焦激光束强度很大，反射的光强度相应也较大，使原本强度就很弱的后向散射光(比前向散射光强度小约3个数量级)的探测因器壁反射产生的噪音背景太大而无法达到可接受的信噪比要求。而本发明的照明方法正可克服这一后向散射光探测的技术瓶颈和技术缺陷。大为降低了后向散射光探测时的噪音背景。如图5所示，本发明的整个库尔特微孔区可以定义为探测敏感区53，探测敏感区53可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部55、微孔的前部56、微孔的后部M，或微孔的几个部分的组合。它的光源可采用激光束52。从而可产生的前向光散射信号59、后向光散射信号510。激光束52的光轴与圆片511的库尔特微孔51的轴方向同轴，当然，本文中所谓的“共轴”或“同轴”实际上是表明方向上的一致，都是在一定的加工和调校的精度下所能实际达到的限度内而言的，不可能是几何上、理论上的100%的共轴或同轴。本实施例中，圆片511是采用100微米厚园片库尔特微孔板。当然，上述圆片的材料和尺寸、微孔的直径可根据具体要求设定。再参见图5，由于激光光束52的传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，所以图中轴线58既是激光光束转播方向的光轴，也是空心圆柱型的库尔特微孔的圆柱的中心轴。本发明的信号探测系统具有只对某特定空间区域敏感的特点，即只对图5中的探测敏感区中的粒子产生的光散射信号有响应，对探测敏感区外的粒子，即使处于照明光束中，其所发出的光散射信号也不能到达光电探测器。本发明的只对某特定空间区域敏感的信号探测系统包括，但不限于，光学的、机械的、电子学的、光-电的、光-机的、及以上几种结合的方法，或其它可以这到对某特定空间区域敏感的任何方法加以实现。本发明所用的光学探测接收系统，具有对空间特定区域选择性接受散射光信号的特点，从而实现了后向光散射信号的成功探测。对前向、后向散射光信号信号的探测，可以是对不同角度区间，或几个不同角度区间的组合的探测。前向的光信号包括前向散射光、轴向光损失(AxialLightLoss，简称ALL)等信号。对前向、后向散射光信号的探测，可以是单波长的探测，也可以是多波长光谱仪分光探测。也可以在前向、后向进行单色或多色的荧光信号探测，或非弹性光散射信号，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信号探测。参见图9，与现有的正交照明方式91相比，本发明的共轴照明方式910在光束与粒子相互作用的区域和时间上具有绝对的优势。如图9所示，在本发明的共轴照明方式中，光束与粒子相互作用的区域为整个库尔特微孔(见图9右，标号4a，约100微米长，直径50微米的圆柱)。而在正交照明方式中，光束与粒子相互作用的区域仅为约20微米的聚焦光束尺寸(见图9左，标号94)。另外，光束与粒子相互作用的时间，本发明的共轴照明方式约为正交照明方式的5倍，所探测到的散射光信号的时间宽度也相应的增宽，这就对探测器的时间响应的要求相应的下降，从而可以使用较大面积的光电探测器，及增加接收角度范围的选择性。图9中，92表示血细胞；93表示正交照明方式中库尔特微孔中心处的椭园型高斯聚焦激光光斑；9表示库尔特微孔壁；96表示库尔特微孔；97表示流式细胞盒中库尔特微孔的长度；98表示库尔特微孔直径；9表示圆锥；910表示共轴照明方式；911表示共轴照明方式中库尔特微孔的长度；912表示库尔特微孔直径；913表示共轴照明方式中聚焦激光束光腰。图10、图11是本发明提供的两个具体实施例的示意图，它们是在图3或图4的微孔池的基础上，采用本发明的共轴照明方式的检测系统的实施例的示意图。该实施例仅是举例说明，但实际应用可不限于这些实施例。具体如下实施例1)参见图10，激光器13，例如光纤藕合激光器，的输出经光纤12输出的光经分光板11进入照明光学系统8，聚焦光束7经微孔池光学窗口6(右边的)聚焦到微孔中心的血细胞4上。照射光与血细胞相互作用产生的前向散射光(FLS)或轴向光损失(ALL)经微孔池光学窗口6(左边的)进入前向散射光接收光学系统14。照射光与血细胞4相互作用产生的后向散射光(BLS)经微孔池窗口6返回进入后向散射光接收光学系统(包括照明光学系统8、分光板11和后向散射光接收光学系统10)，照明激光强度的实时监测光学系统9用于实时监测照明激光的强度变化。于是，每个血细胞通过微孔时，就可以同时得到至少3到4个有关血细胞信息的信号(DC、FLS、BLS、ALL)，这些信号即以其高鉴别力用于血细胞的五分类和其他多项参数的测量。图中，5是血细胞悬浮液。1是微孔池产生的微孔电流。图中，A、B为库尔特微孔池被库尔特微孔分隔成的两个部分。实施例2):参见图11，本实施方法与具体实施方法1)的不同在于照明光学系统和后向散射光接收光学系统没有共用的部分，微孔池的设计也不同于上述实施方法1)。光纤藕合激光器13的输出经光纤12先进入照明光学系统8，然后经分光板11后变成聚焦光束7经微孔池的光学窗口6(右边的)聚焦到微孔中心的血细胞4上。照射光与血细胞相互作用产生的前向散射光(FLQ或轴向光损失(ALL)经微孔池光学窗口6(左边的)进入前向散射光接收光学系统14。照射光与血细胞4相互作用产生的后向散射光(BLS)经微孔池窗口6(右边的)返回，由分光板11反射进入后向散射光接收光学系统10。照明激光强度的实时监测光学系统9用于实时监测照明激光的强度变化。于是，每个血细胞通过微孔时，就可以同时得到至少3到4个有关血细胞信息的信号(DC、FLS、BLS、ALL)，这些信号即以其高鉴别力用于血细胞的五分类和其他多项参数的测量。部分实验结果示例1)直径7微米的标准粒子的库尔特直流脉冲信号(DC，下轨迹)与前向散射光信号(FLS，上轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，见图12。注意前向光散射信号的直流背景为920毫伏。2)直径7微米的标准粒子的库尔特直流脉冲信号(DC，下轨迹)与后向散射光信号(BLS，上轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，参见图13。3)质控血样的库尔特直流脉冲信号(DC，下轨迹)与后向散射光信号(BLS，下轨迹，经滤波后的BLS，中轨迹)的示波器记录显示(实验结果)，参见图14。注意后向光散射信号的直流背景仅为M毫伏。对比前向光散射信号的直流背景920毫伏，降低了34倍。后向光散射信号的信号噪音比(S/N)甚至比直流脉冲的(S/N)还高，这充分说明本发明的照明方式和后向光学探测系统的设计的无比优越性。通过上述实施例，可以看出，本发明是对库尔特微孔直接照明，因而彻底摈弃了现有的基于流式细胞仪原理的血细胞分析仪器中所必不可少的昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，所以有“简单的结构、低故障、低成本、易操作”等一系列优点。当然，利用本发明的库尔特微孔的共轴照明方法，不仅可以用于上述血液分析仪器中，还可制成各种测量和检测仪器来应用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，及对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业等。航空航天工业中同样也可用来检测燃料的纯度等。参考文献DHaematologyTimetable(1995),JanePittaway,MedLabPrac1CXAlOl,UCDavis.2)KerkerΜ,etal.，“Lightscatteringandfluorescencebysmallparticleshavinginternalstructure.",JHistochenCytochem,1979Jan；27(1)250-63.3)KerkerΜ,"Elasticandinelasticlightscatteringinflowcytometry",Cytometry,1983.Tul；4(1):1_10。4)P.Μ.A.SlootandC.G.Figdor,"Elasticlightscatteringfromnucleatedbloodcells:rapidnumericalanalysis",AppliedOptics,Vol.25,Issue19,pp.3559-3565(1986).5)Dakotaetal.,"ElasticLightScatteringfromSingleCellsOrientationalDynamicsinOpticalTrap",BiophysicalJournal,Vol.87,August2004，ppl298-1306.权利要求1.全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，它使光散射法可以直接应用于经典的库尔特微孔，其特征在于，将照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴。2.根据权利要求1所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，所述照明光束的照明光源，可以是下列任一种或几种激光器、发光二极管(LED)，气体放电光源、自灼光源；所述激光器可以是下列任一种或几种气体激光器，如He-Ne激光器，Ar离子激光器，半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器。3.根据权利要求1所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，所述照明光束的照明光源的波长范围，根据不同的应用，可以从紫外、可见到红外波段中的一种或几种。4.根据权利要求1到3任一所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，当照明光束沿库尔特微孔轴传播时，光束聚焦到均勻地充满整个库尔特微孔。5.根据权利要求1到3任一所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，当使用的光源为激光器时，聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于库尔特微孔的直径，而其瑞利范围(RayleighRange)则大于几个库尔特微孔的长度。6.根据权利要求1所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，为使库尔特原理的微孔池能形成光束的通道以照明库尔特微孔，微孔管改造成把微孔池分隔为两部分的微孔板，并在微孔池相对微孔的前后开两个光学窗口。7.根据权利要求6所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，所述微孔池相对微孔的前后的两个光学窗口，每一对所述光学窗口可以是一对光学平板或一对透镜或其它光学元件。8.根据权利要求1、4和5所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，整个库尔特微孔区为探测敏感区，探测敏感区可以包括整个库尔特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的几个部分的组合。9.根据权利要求1和8所述的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，信号探测系统具有只对某特定空间区域敏感，即只对探测敏感区中的粒子产生的光散射信号有响应，对探测敏感区外的粒子，即使处于照明光束中，其所发出的光散射信号也不能到达光电探测器。10.根据权利要求9的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，只对某特定空间区域敏感的信号探测系统可以是光学的、机械的、电子学的、光-电的、光-机的、及以上几种的结合的方法，或其它可以达到对某特定空间区域敏感的任何方法加以实现。11.根据权利要求9的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，具有对空间特定区域选择性接受散射光信号的特点，从而实现了后向光散射信号的成功探测。12.根据权利要求9和11的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，对前向、后向散射光信号信号的探测，可以是对不同角度区间，或几个不同角度区间的组合的探测。13.根据权利要求9、11、12的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，前向的光信号包括前向散射光、轴向光损失(AxialLightLoss，简称ALL)等信号。14.根据权利要求9、11、12、13的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，对前向、后向散射光信号的探测，可以是单波长的探测，也可以是多波长光谱仪分光探测。15.根据权利要求9、11、12、13的全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法，其特征在于，也可以在前向、后向进行单色或多色的荧光信号探测，或非弹性光散射信号，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信号探测。16.一种库尔特微孔的共轴照明血液分析仪器，它包括照明光学系统、有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信号探测光学系统，其特征在于，在微孔池中所述照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线一致。17.—种库尔特微孔的共轴照明的应用，所述照明光束传播方向的光轴与库尔特微孔的轴线同轴，它不仅可以用于血液分析仪器中，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，及对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业的检测以及航空航天工业中可用来检测燃料的纯度等。全文摘要一种库尔特微孔的共轴照明方法及其血液分析仪器，以与库尔特微孔的轴线同轴的照明光束直接对库尔特微孔进行共轴照明的特殊设计，使对粒子内部组成成分和结构特别敏感的后向光散射探测应用到商业血液分析仪器中成为可能，从而极大的提高了仪器的鉴别能力；它不需昂贵的流式细胞盒和复杂的流体聚焦系统，它也不需附加的试剂处理和荧光染色等增加仪器操作复杂性的任何方法，仅用库尔特阻抗法和光散射法，就不仅能完成血细胞的五分类分析计数，还能提供更多参数的综合检测和分析。与世界上现有的占市场主导地位的基于流式细胞仪原理的高端血液分析仪器相比，具有明显的性价比和市场优势。文档编号G01N15/12GK102087197SQ20101014250公开日2011年6月8日申请日期2010年3月9日优先权日2009年12月8日发明者龚维燕申请人:龚维燕