专利名称：用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及材料化学和电化学领域，具体涉及一种用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术：
肿瘤的发生、增殖是一个逐渐演变的过程，在这个渐变过程中，由恶性肿瘤细胞异常分泌或脱落，或由机体因肿瘤反应而产生的可进入血液或体液中与肿瘤发生和增殖密切相关的物质称为肿瘤标志物(Tumor marker，TM)，粗分为癌胚抗原类、酶类、激素类、糖蛋白类、癌基因类和细胞表面肿瘤抗原类等六大类。对于这类物质的动态监视及测定，可为肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价提供可靠的依据。目前临床血清肿瘤标志物的免疫检测方法主要有放射免疫法、标记抗体的免疫发射法、酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫荧光法、时间分辨荧光免疫法等，虽然这些方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但仍无法避免放射污染、耗时、无法在社区医院普及等缺点。生物传感器由识别元件和信号转换器组成，识别元件以适当的方式固定在转换器的表面，当待测分子与识别元件结合时，产生一个物理或化学信号，转换器将此信号转换成一个可定量的输出信号通过监测输出信号实现对待测分子的实时测定。构成生物传感器的生物分子有酶、抗体、微生物、组织甚至完整的器官；转换器有电极、场效应晶体管、光纤、热敏电阻和压电晶体等。生物传感器由于其高灵敏度和特异性，受到广泛关注。免疫传感器是耦联含有抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器的一种新型生物传感器，具有高灵敏度、高特异性、使用简便、适于在社区医院普及的优点，成为肿瘤标志物检测的有效方法。 但生物分子固有的缺陷，即对使用环境要求较高，难以长期保存等，使生物传感器在实际应用中遇到很多不易克服的障碍。同时，生物分子来源于生物活体，由于制备和纯化繁琐、昂贵，因此，识别元件难以得到也是限制生物传感器发展的一个重要因素。获得廉价、稳定的识别元件，是生物传感器进一步发展的关键之一。通过对抗原抗体、酶和底物反应原理的研究和理解，科学家大胆提出了通过化学反应合成模拟抗体的设想，开创了一项崭新的技术——分子印迹技术(molecular imprinting technique,MIT) fflil MIT(molecularly imprinted polymers, MIPs)被称为“塑料抗体”，科学家因此实现了不依赖生物活体获得“抗体”的宿愿，MPs与生物识别元件(如酶、抗体、核酸等)相比具有很多优点①MIP的稳定性好，能反复使用50次以上；在室温干燥环境中可保存数年，水中保存4周以上不会影响其性质； 用酸性、碱性、金属离子和其它多种溶液处理时不会降低其识别特性；能耐受一定的机械强度、高温及高压；②MIP具有很高的选择性，对印记分子而言是“量身定做”的，而且理论上任何一个分子均可制备相应的MIP ；③生物识别元件来自于生物源，在生产过程中往往要使用动物，而分子印记技术完全是化学合成过程；④生物分子识别系统不易建立批量生产工艺，所以价格昂贵，而MIP费用低，对于某些小分子化合物如药物来说，制备其MIP相当简单和省时，容易建立大规模生产。以此“塑料抗体”取代生物分子作为识别元件研制分子印迹仿生传感器(MPs生物传感器)的工作在20世纪90年代后逐渐成为传感器领域的研究执占。MIPs的制备包括3个步骤(1)通过共价键或/和非共价键使模板或印迹分子(即待测分子)与功能单体形成官能团和空间结构互补的复合物，所用的功能单体须带有能与印迹分子发生作用的功能基。常用的功能单体有丙烯酸、甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸及苯乙烯等；( 加入交联剂，在印迹分子-功能单体复合物周围产生聚合反应，将官能团和空间结构互补的形式固定在聚合物中。常用的交联剂有双甲基丙烯酸乙二醇酯、季戊四醇三丙烯酸酯及三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯等；(3)从聚合物中除去模板，形成能特异识别、 结合模板的空穴，这个聚合物即MIPs。MII^在与其合成时相似的溶液中与待测分子相遇，通过官能团和空间形状的配合，选择性重新结合待测分子。MPs所具有的优势使其作为识别元件，特别适合于传感器技术。电化学免疫传感器将电化学分析技术和免疫技术相结合，是目前研究最多的较为成熟的一类免疫传感器，广泛应用于肿瘤标志物的检测。然而，用MPs这种“人工抗体”来代替天然抗体来实现精确检测在很多小分子(维生素，氨基酸，醛类，辅酶，留醇类，药物吗啡等)的检测中获得成功，但是对蛋白质等大分子的分子印迹研究得比较少，至今科学家研究的MPs所用的底物最大只能达到多肽级别(3kD以下)，未达到达到蛋白质级别(20kD以上)。如何将蛋白质作为印记分子制备MPs成为实现MPs-生物传感器的关键。

发明内容
本发明的目的是克服大分子物质印迹难的问题，提供一种能够选择性和特异性识别肺癌肿瘤标志物，可用于肺癌肿瘤标志物检测的分子印记聚合物。为实现上述目的，本发明提供了一种简单的用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法。本发明以竞争型电流传感器为基础。由于MPs的选择性主要取决于其官能团和空间形状与底物的配合，有研究表明，对于生物大分子来说，分子印迹聚合物对底物的选择性和亲和力不仅是因为印迹聚合物中有可以与底物进行专一反应的结合位点，更为重要的是功能单体在印迹聚合物上形成了高度有序的结构，这种高度有序的结构与离子或(和) 疏水作用力一起对印迹聚合物的选择性和亲和性起主要作用。所以本发明将重点放在构建具有高度有序结构的MPs上。某些在小分子印迹中影响很大的因素，如溶剂的极性、介电常数、质子化作用及络合作用等，在大分子的印迹中，作为其次的影响因素。本发明选择肺癌肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)为模板，采用扩散/分散聚合法，制备得到特异性的肿瘤标志物的分子印迹聚合物。根据大分子作为印迹分子，其MPs作为传感器识别元件的特殊性。本发明一种用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法，具体方案包括如下步骤(1)模板分子的电化学修饰；选电活性物质甲酸二茂铁3-5mg，缩写为FER，溶解于500-1000 μ L，0. 15M，pH为 7. 3的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，缩写为Na-HEPES，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入8-15mg 1-乙基-3-[3-二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸缩写为EDC和80-120 μ L，500μ g/mL的肿瘤标志物，并于室温下孵育3-5小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存；所述肿瘤标志物为癌胚抗原缩写为CEA、神经原特异性烯醇化酶缩写为NSE或细胞角蛋白19片段抗原缩写为 CYFRA21-1 ；(2)分子印迹聚合物的制备；将模板分子即甲酸二茂铁-肿瘤标志物，功能单体，交联剂溶于致孔剂， 将溶液移入水中，搅拌，乳化；然后加入引发剂交联，紫外光聚合，得粒径较均一的球形分子印迹物质，其中模板、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的用量比可选择 mmol mmol mmol mL mg = 1 (8-10) (40-50) (90-100) (3-40)；通过乙醇洗涤离心除去模板分子；所述模板为FER-CEA或FER-NSE或FER-CYFRA21-1 ；所述功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯缩写为EGDMA、甲基丙烯酸甲酯、亚甲基丁二酸、对乙烯苯甲酸或二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸缩写为AMPSA ；所述交联剂为N，N- 二丙烯酰哌嗪、N， N'-亚甲基二丙烯酰胺、3，5_二苯甲酸、3，5_二丙烯酰胺苯甲酸或N，0-二丙烯酰-L-苯丙氨酸；所述致孔剂为四氢呋喃、甲醇、乙醇或丙醇；所述引发剂为偶氮二异丁腈缩写为AIBN 或偶氮二异庚腈缩写为AIHN。分子印迹聚合物的制备简要过程如图1。其中在模板分子的电化学修饰部分生物大分子本身是没有电活性的，不能传导电流，因此，在制备MPs之前，本发明利用电活性物质对模板分子进行修饰，已有的生物分子的电化学修饰多采用二茂铁，硫堇， 壳聚糖等作为电活性物质，本实验中采用甲酸二茂铁作为电活性物质，其同时具备电活性和适用于本实验环境的亲水性。修饰后的电活性物质-模板分子复合物再作为模板分子制备其Mffs。其中在分子印迹聚合物的制备部分由于模板分子为生物大分子，采用扩散/分散聚合法，在常温下利用紫外光照射聚合。该方法一般用于热不稳定性小分子的MPs的制备，在小分子的MPs的制备中技术比较成熟，基本过程是将模板分子(甲酸二茂铁-肿瘤标志物)，功能单体，交联剂溶于有机溶剂(致孔剂)，然后将溶液移入水中，搅拌，乳化。然后加入引发剂交联，紫外光聚合， 得粒径较均一的球形分子印迹物质。然后通过乙醇洗涤离心除去模板分子，简要过程如图 1所示。提高扩散速度，缩短响应时间，主要是通过减少交联剂用量、增加致孔剂用量以增大聚合物链间的空隙。蛋白质为具有一定形状的模板分子，故交联剂的用量要适量低一点。 模板分子的用量不能超过5%。在该方法中，关键因素为模版分子、功能单体的比例，交联剂、致孔剂的比例，紫外光照时间三个因素，其他溶剂的量为相对次要因素，引发剂的量可根据制备的容器的大小来选择量的多少，其主要影响反应时间，对制备效果影响不大。去除印迹聚合物中的模板分子，需加入与水相混溶的有机溶剂可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。血清与水溶性有机溶剂的体积比为1 (1 3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，洗掉蛋白质沉淀和甲酸二茂铁。将本发明中的分子印迹聚合物制作为电流传感器以备应用，具体操作采用丝网印刷技术。本发明的分子印迹聚合物，经检测发现，将该分子印迹聚合物制备的生物传感器用于肿瘤标志物的检测，对CEA的检测限为0. 22ng/mL，线性范围为0. 50-25ng/mL，相关系数为0. 9981，响应时间为35min，在112ng/mL以下与其他蛋白质物质无交叉反应，CEA浓度-电流曲线如图2所示；对NSE的检测限为0. 29ng/mL，线性范围为0. 53j9ng/mL，相关系数为0. 9990，响应时间为^min，在231ng/mL以下与其他蛋白质物质无交叉反应，NSE浓度-电流曲线如图3所示；对CYFRA21-1的检测限为0. 41ng/mL，线性范围0. 63-27ng/mL, 相关系数为0. 9986，响应时间为32min，在89ng/mL以下与其他蛋白质物质无明显交叉反应，CYFRA21-1浓度-电流曲线如图4所示，。与现有技术相比，本发明具有如下效果(1)本发明制备的是生物大分子蛋白质的分子印迹聚合物，并且对相应的底物分子具有较高的特异性，同时预留了电活性物质的结合位点。(2)本发明采用水溶性的二丙烯酰哌嗪(diacrylylpiperazine)作为交联剂，在水中合成了并可在亲水环境(10% 100%水)中使用的MIPS。(3)本发明的检测采用竞争性电流检测法，应用电活性物质二茂铁做探针来代替传统免疫传感器中的标记底物。(4)本发明所采用的悬浮/分散聚合法，及紫外光引发聚合，均为较常用，操作简单，并且与丝网印刷技术和流动注射技术相结合，既实现了芯片一次性实用的特点，又使得检测方便快速有效。


图1是分子印迹聚合物的制备简要过程。图2是CEA浓度-电流曲线图。图3是NSE浓度-电流曲线图。图4是CYFRA21-1浓度-电流曲线图。图5是改变交联剂，致孔剂，引发剂比例后CEA浓度-电流曲线图。图6是改变紫外聚合时间后CEA浓度-电流曲线图
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1用于检测CEA的分子印迹聚合物(1) CEA的电化学修饰取甲酸二茂铁(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 缓冲液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CEA并于室温下孵育4小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存。(2)分子印迹聚合物的合成所述的分子印迹聚合物采用由紫外光引发的自由基聚合方法制备而成。模板分子为(1)中所得到的模板分子，功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交联剂为二丙烯酰哌嗪，致孔剂为甲醇，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。其过程为取(1)中所制得的模板复合物溶液0. Immol与3mg的引发剂AIBN溶于8mL致孔剂甲醇中，加入3mL交联剂二丙烯酰哌嗪4. 5mmol和400 μ L的单体EGDMAlmmol，震荡混勻10-30分钟，形成均勻溶液，喷点于丝网印刷电极的工作电极上，通2分钟氮气排除氧气，于紫外灯下照射2小时，90%-95%乙醇洗涤2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印迹聚合物性能测定将所制得的MIPs-传感器芯片与电流传感器的信号收集系统相连接，注入不同浓度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分别注入等量的甲酸二茂铁溶液，记录电流脉冲信号。做出CEA浓度-电流信号的标准曲线，如图2 所示，做为检测样品时读取数据依据。实施例2用于检测NSE的分子印迹聚合物(I)NSE的电化学修饰取甲酸二茂铁(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 缓冲液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸) (EDC)和90 μ L的500 μ 1 g/mL的模板分子NSE并于室温下孵育4小时，超滤除去未结合
的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存。(2)分子印迹聚合物的合成所述的分子印迹聚合物采用由紫外光引发的自由基聚合方法制备而成。模板分子为(1)中所得到的模板分子，功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交联剂为二丙烯酰哌嗪，致孔剂为甲醇，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。其过程为取(1)中所制得的模板复合物溶液(0. Immol)与3mg的引发剂AIBN溶于8mL致孔剂甲醇中，加入3mL交联剂二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的单体EGDMA(Immol)，震荡混勻10-30分钟，形成均勻溶液，喷点于丝网印刷电极的工作电极上，通2分钟氮气排除氧气，于紫外灯下照射2小时， 90% -95%乙醇洗涤2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印迹聚合物性能测定将所制得的MIPs-传感器芯片与电流传感器的信号收集系统相连接，注入不同浓度的 NSE (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL, 25ng/mL)，然后再分别注入等量的甲酸二茂铁溶液，记录电流脉冲信号。做出NSE浓度-电流信号的标准曲线，如图3 所示，做为检测样品时读取数据依据。实施例3用于检测CYFRA21-1的分子印迹聚合物(1)CYFRA21-1的电化学修饰取甲酸二茂铁(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 缓冲液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CYFRA21-1并于室温下孵育4小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存。(2)分子印迹聚合物的合成所述的分子印迹聚合物采用由紫外光引发的自由基聚合方法制备而成。模板分
7子为(1)中所得到的模板分子，功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交联剂为二丙烯酰哌嗪，致孔剂为甲醇，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。其过程为取(1)中所制得的模板复合物溶液(0. Immol)与3mg的引发剂AIBN溶于8mL致孔剂甲醇中，加入3mL交联剂二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的单体EGDMA(Immol)，震荡混勻10-30分钟，形成均勻溶液，喷点于丝网印刷电极的工作电极上，通2分钟氮气排除氧气，于紫外灯下照射2小时， 90% -95%乙醇洗涤2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印迹聚合物性能测定将所制得的MIPs-传感器芯片与电流传感器的信号收集系统相连接，注入不同浓度的 CYFRA21-1 (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL, 25ng/mL)，然后再分别注入等量的甲酸二茂铁溶液，记录电流脉冲信号。做出CYFRA21-1浓度-电流信号的标准曲线，如图4所示，做为检测样品时读取数据依据。实施例4用于检测CEA的分子印迹聚合物(1) CEA的电化学修饰取甲酸二茂铁(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 缓冲液(0. 15Μ，ρΗ7· 3)，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸) (EDC)和90 μ L的500 μ 1 g/mL的模板分子CEA并于室温下孵育4小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存。(2)分子印迹聚合物的合成所述的分子印迹聚合物采用由紫外光引发的自由基聚合方法制备而成。模板分子为(1)中所得到的模板分子，功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交联剂为二丙烯酰哌嗪，致孔剂为甲醇，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。其过程为取(1)中所制得的模板复合物溶液(0. Immol)与aiig的引发剂AIBN溶于IOmL致孔剂甲醇中，加入2mL交联剂二丙烯酰哌嗪(3mmol)和400 μ L的单体EGDMA (Immol)，震荡混勻10-30分钟，形成均勻溶液，喷点于丝网印刷电极的工作电极上，通2分钟氮气排除氧气，于紫外灯下照射2小时，90%-95% 乙醇洗涤2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印迹聚合物性能测定将所制得的MIPs-传感器芯片与电流传感器的信号收集系统相连接，注入不同浓度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分别注入等量的甲酸二茂铁溶液，记录电流脉冲信号。做出CEA浓度-电流信号的标准曲线，如图5 所示。实施例5用于检测CEA的分子印迹聚合物(1) CEA的电化学修饰取甲酸二茂铁(FER)4mg,溶解于 800 μ L Na-HEPES 缓冲液(0. 15Μ，ρΗ 7. 3)，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入10mg(l-乙基_3_[3- 二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸) (EDC)和90 μ L的500 μ g/mL的模板分子CEA并于室温下孵育4小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存。(2)分子印迹聚合物的合成所述的分子印迹聚合物采用由紫外光引发的自由基聚合方法制备而成。模板分子为(1)中所得到的模板分子，功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯(EGDMA)，交联剂为二丙烯酰哌嗪，致孔剂为甲醇，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。其过程为取(1)中所制得的模板复合物溶液(0. Immol)与3mg的引发剂AIBN溶于8mL致孔剂甲醇中，加入3mL交联剂二丙烯酰哌嗪(4. 5mmol)和400 μ L的单体EGDMA(Immol)，震荡混勻10-30分钟，形成均勻溶液，喷点于丝网印刷电极的工作电极上，通2分钟氮气排除氧气，于紫外灯下照射4小时， 90% -95%乙醇洗涤2-6次。干燥所得聚合物，4°C冰箱保存。(3)分子印迹聚合物性能测定将所制得的MIPs-传感器芯片与电流传感器的信号收集系统相连接，注入不同浓度的 CEA (0. Ing/mL, Ing/mL, 5ng/mL, 8ng/mL, 12ng/mL, 18ng/mL，25ng/mL)，然后再分别注入等量的甲酸二茂铁溶液，记录电流脉冲信号。做出CEA浓度-电流信号的标准曲线，如图6 所示。参考文献[l]Kriz D,Mosbach K. Competitive amperometric morphine sensorbased on an agarose immobilised molecularIyimprinted polymer[J]. Ahal Chim Acta,1995,300 71-75.[2]Kobayasni T, Wang H U, Fuj N. Molecular imprint membranes of poly2 acrylonitriIe copolymer with differentacrylic acid segments[J]. Anal Chim Ac-ta,1998,365 :81.[3]Surugiu I,Ye L,Yilmaz E,et al. An enzyme-linked molecularly imprinted sorbent assay[J]. Analyst,2000,125 (1) :13-16.[4]Kempe M, Glad M, Mosbach K. An approach towards surface imprinting using the enzyme ribonuclease A[J]. J Mol Recognit，1995，8(1/2) :35-39.[5]Z. Yang et al. A chemiluminescent immunosensor based on antibody immobilized carboxylic resin beads coupled with micro-bubble accelerated immunoreaction for fast flow-injection immunoassay [J]. Biosensors and Bioelectronics,2008,24 :35-40.[6]J. Wu et al. A disposable electrochemical immunosensor for flow injection immunoassay of carcinoembryonic antigen[J]. Biosensors and Bioelectronics,2006,22 :102-108.[7]G.P. Gonzalez et alA ΜΙΡ-based flow-through fluoroimmunosensor as an alternative to immunosensors for the determination of digoxin in serum samples[J], Anal Bioanal Chem，2009，394 :963-970.[8]Jie Wu et al.Disposable Reagentless Electrochemical Immunosensor Array Based on a Biopolymer/SoI-Gel Membrane for Simultaneous Measurement of Several Tumor Markers[J]. Clinical Chemistry,2008,54(9) :1481-1488.[9]P. S. Sharma et al. Highly Sensitiye and Selective Detection of Creatinine by Combined Use of MISPE and a Complementary MIP-Sensor [J]. Chromatographia,2007，65 :419-427.[10]Lei Ye · Karsten Haupt. Molecularly imprinted polymers as antibody and receptor mimics for assays,sensors and drug discovery[J]. Anal Bioanal Chem,2004，378 :1887-1897.[ll]01ivier Y. F. et al. Optical interrogation of molecularly imprinted polymers and development of MIP sensors -.a review [J]. Anal Bioanal Chem, 2005, 382 :947-956.[12]Shradha Prabhulkar et al. Amperometric micro-immunosensor for the detection of tumor biomarker[J]. Biosensors and Bioelectronics,2009,24 3524-3530.
权利要求
1. 一种用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括步骤(1)模板分子的电化学修饰；选电活性物质甲酸二茂铁3-5mg，缩写为FER，溶解于500-1000 μ L，0. 15Μ，ρΗ为7. 3的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，缩写为Na-HEPES，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，加入8_15mg 1-乙基-3- [3-二甲胺基丙胺]碳化二亚胺-盐酸缩写为EDC和80-120 μ L，500 μ g/mL的肿瘤标志物，并于室温下孵育3-5小时，超滤除去未结合的甲酸二茂铁，直到滤出液中不再含有甲酸二茂铁为止。制得模板复合物于4°C保存；所述肿瘤标志物为癌胚抗原缩写为CEA、 神经原特异性烯醇化酶缩写为NSE或细胞角蛋白19片段抗原缩写为CYFRA21-1 ；(2)分子印迹聚合物的制备；将模板分子即甲酸二茂铁-肿瘤标志物，功能单体，交联剂溶于致孔剂，将溶液移入水中，搅拌，乳化；然后加入引发剂交联，紫外光聚合，得粒径较均一的球形分子印迹物质，其中模板、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂的用量比可选择mmol mmol mmol mL mg =1 (8-10) (40-50) (90-100) (3-40)；通过乙醇洗涤离心除去模板分子；所述模板为FER-CEA或FER-NSE或FER-CYFRA21-1 ；所述功能单体为二羟甲基丙烯酸乙酯缩写为EGDMA、甲基丙烯酸甲酯、亚甲基丁二酸、对乙烯苯甲酸或二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸缩写为AMPSA ；所述交联剂为N，N- 二丙烯酰哌嗪、N，N'-亚甲基二丙烯酰胺、3，5- 二苯甲酸、3，5- 二丙烯酰胺苯甲酸或N，0- 二丙烯酰-L-苯丙氨酸；所述致孔剂为四氢呋喃、甲醇、 乙醇或丙醇；所述引发剂为偶氮二异丁腈缩写为AIBN或偶氮二异庚腈缩写为AIHN。
全文摘要
本发明公开一种用于检测肺癌肿瘤标志物的分子印迹聚合物的制备方法。该方法基本过程为将模板分子(甲酸二茂铁-肿瘤标志物)，功能单体，交联剂溶于有机溶剂(致孔剂)，然后将溶液移入水中，搅拌，乳化。然后加入引发剂交联，紫外光聚合，得粒径较均一的球形分子印迹物质。然后通过乙醇洗涤离心除去模板分子得到对肺癌肿瘤标志物具有特异性的分子印迹聚合物，并用于生物传感器的识别元件，提出了一种新的肿瘤诊断的方法。
文档编号G01N27/26GK102268119SQ20101052803
公开日2011年12月7日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者刘殿奎, 张阳德, 李异凡, 李辉莹, 陈福韬 申请人:中南大学, 中南大学肝胆肠外科研究中心