专利名称：采用时间辨别的分子传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子传感器，具体地但非限制地，涉及生物传感器。
背景技术：
公知的是为分子或粒子提供传感器，其中粒子通过某种机制，如化学键，键合至传感器的表面，并且从而改变传感器的特性。通过例如电路检测这种特性的改变实现检测。作为示例，不同范围的生物传感器，也就是说，检测生物活性粒子或分子的传感器是已知的，其中所述特性通常为电特性，如电阻或电容。通过确保仅目标类型或种类的粒子可以恰当地键合至传感器，通常在这种传感器中实现不同类型的粒子之间的辨别。在生物传感器的情况中，这可以通过为传感器的检测表面设置生物受体粒子而实现。如果生物受体可以被配置为使得它将仅键合至目标生物分子，且不键合至其它粒子，则检测将针对该目标分子。目标分子不与生物受体唯一相关联的其它可行的方案是将标签粘附至目标分子。在该情况中，生物受体可以被形成为专门键合至标签。这种传感器可以便利地集成在电子元件中，并且具体地，可以受益于硅エ艺技术的数十亿美元的投资，以产生有成本效益的且高度可制造的传感器。然而，并不总是这么简单，并且在一些情况中，甚至可能不能提供高水平的特异性用于将任何特定目标粒子键合至传感器。基于飞行时间的检测方法是已知的，特别是飞行时间质谱測定法(TOFMS)。然而，这种传感器以气相操作，并且因此通常不便于操作，以及涉及昂贵且复杂的设备，如连接至二次发射倍増器的微通道板。典型地，辨别限于质荷比的改变。因此将希望为粒子特别是为生物分子提供便宜的传感器，其不依赖于键合事件的特异性，用于目标分子和其它非目标分子之间的辨别。

发明内容
本发明的目标是提供这种传感器。根据本发明，提供了如在权利要求I中限定的传感器装置。替代地，该传感器装置也可以被称为分子传感器，因为它适于检测作为单个粒子或粒子组的粒子。将会认识到，与其它检测方法相反，特别是与采用诸如荧光之类的功能化珠子(functionalised beads)的方法相反,根据本发明的传感器装置有利地可以实时操作,而不象常规电泳的那样要求后处理分析。在实施例中，所述多个传感器的配置包括至少1000个传感器，或至少10000个传感器，或至少65000个传感器。因此该传感器装置可以为大量并行的。在实施例中，传感器在传感器的主表面设置成阵列，每个传感器占据主表面的不大于100 μ m2的表面积。 在实施例中，该传感器装置被配置为在粒子在相应纳米电极上的第一组键合事件和粒子在相应纳米电极上的第二组键合事件之间在时间上辨别，其中第一组键合事件和第ニ组键合事件隔开大于1ms，或大于100ms，或大于10s。将会认识到，在各组之间不需要间隔，特别是当各组包括明显的时间展宽时，辨别可以基于単独的峰值的识别，即使在各组的分布重叠时。在实施例中，第一组键合事件和第二组键合事件中的至少ー个涉及键合不多于1000个粒子，或者不多于50个粒子，或者甚至仅键合单个粒子。在后一种实施例中，传感器装置可以被设置为计算单个键合事件。将会认识到，仅采用多个键合事件能够实现可靠的时间辨别，因为任何单个键合事件的定时可以由单独的粒子的热运动扰乱(或者甚至阻止)，即使热能平均明显小于驱动所述辨别的场能(field energy)。优选实施例包括被配置为检测生物活性分子或粒子的生物传感器。在实施例中，纳米电极被配置为借助于自组装单层和生物受体粒子中的至少ー种键合生物活性粒子。在实施例中，传感器装置还包括输送装置，其用于将多个种类的粒子从贮存器输送至纳米电极，其中不同种类的粒子分别花费不同的时间从贮存器穿越输送装置到达纳米电极。在实施例中，输送装置被配置使得不同种类的粒子由于包括淘析(也熟知为重力沉降)、电泳、磁泳、电磁泳、热泳和层析法的现象组中的ー种现象而分别花费不同的时间从贮存器穿越输送装置到达纳米电极。将会认识到，本发明的ー些实施例不需要将探针生物分子固定在传感器上。这通常借助于自组装单层执行，自组装单层连接至电极，因此这种实施例在很大程度上简化了生物传感器的处理并増加其搁置寿命。而且，由于在不需要标签的实施例中，检测通常不依赖于特定探针粒子或生物受体，可以避免选择或制备生物受体或在传感器上复用它们的费用和不便。根据以下描述的实施例，本发明的这些和其它方面将变得明显，并且參照以下描述的实施例说明本发明的这些和其它方面。


将參照附图，仅以举例的方式描述本发明的实施例，在附图中图I说明检测阵列，其中该阵列的多个区域针对不同的粒子；图2为如图I所示的检测阵列的平面图；图3为穿过传感器阵列的一部分的示意性横截面；图4示意性地说明本发明的实施例；以及图5示出来自根据本发明的实施例的传感器阵列的示例性时间响应，以及图6说明珠子的功能化的过程，用于粒子的标记检測。应当注意到，附图是概略的且未按比例绘制。这些图中的部件的相对尺寸和比例已经被示出为尺寸放大或缩小，用于在附图中清楚和方便起见。在修改的和不同的实施例中相同的附图标记通常用来指对应或相似的特征。
具体实施方式
近来，本申请人已经开发了一种传感器，作为生物传感器具有特定的应用，并且是为大量并行检测提供的。大量并行是指传感器可以单独地或成组地检测至少1000个粒子。大量并行检测是复用或多个被分析物检测的子集；复用传感器可以单独地或成组地检测多个分子或粒子(通常至少5个分子或粒子)，在共同未决专利申请公开号W02008/132656中公开的这种传感器依赖于阻抗检测，并且基于粒子、典型地是生物分子键合至电极时的阻抗改变。通过将传感器电极提供为纳米电极(也就是说，电极占据传感器表面上的小于I μ m2的面积，并因此是纳米尺寸的电极，而非例如微米或毫米)，该生物传感器可以包括数万个单独的传感器的阵列。在示例性原型实施例中，该传感器包括65200个单独的纳米电扱。该阵列的不同区域中的纳米电极可以对不同的目标粒子或生物分子敏感。这在图I中示意性地示出，其示出了传感器阵列10，具有単独的传感器的阵列，每个传感器具有纳米电极11。在示出的示例性附图中，该阵列为8X8阵列。连接到每个纳米电极的是受体分子12，其通常为生物受体。在该阵列的不同区域中，不同的生物受体12a，12b，12c和12d连接至或键合至纳米电扱。在示例性附图中，该阵列包括四个区域，每个区域具有4X4的传感器子阵列，因此具有4X4的纳米电极子阵列。不同生物受体12a，12b，12c和12d对各个不同的生物分子13a，13b，13c(未示出)和13d敏感。每个不同的生物分子可以仅与合适的生物受体键合，且不与任何其它生物受体键合。纳米电极11与生物受体12 —起，并且带有或不带有键合的生物分子，形成纳米电极结构14,14a。当包含生物分子13a，13b，13c和13d中的一个或多个种类的样本被分析物在传感器阵列10上方经过时，生物分子键合至相应的生物传感器。在示出的示例中，被分析物包括分子13a、13c和13d，但不包括13b类型的分子，因此没有生物分子键合至阵列10的该区域。当生物分子键合至生物受体，因此将纳米电极结构14改变成修改的纳米电极结构14a时，该传感器通过检测由纳米电极结构、被分析物和对电极(未示出)形成的电容的改变而工作。图2示出了生物传感器阵列的一部分的平面图。如图所示，传感器便利地设置成笛卡尔(Cartesian)或X_Y栅格配置，使得对应于单独的传感器的单独的纳米电极11可以通常行22和列21寻■址。图3示出了传感器阵列10的一部分的示意性横截面。纳米电极11借助于已知的镶嵌结构从传感器阵列的表面延伸到半导体31的体积中。纳米电极在传感器阵列的表面32上的顶部Ila因此与纳米电极的底部Ilb在环境上隔离。如在共同未决专利申请公开W02008/132656中描述的那样，底部Ilb可以形成为电子电路的一部分。上文的參考文献共同未决专利申请中描述的电子电路快速地响应。所述检测因此可以被认为是“实时的”，并且不依赖于数据的大量前处理，或“前后对照”測量(也就是说，在键合事件之前和之后进行的測量，具有指示键合事件的差异)。这是因为大部分数据处理是在检测芯片上进行，这是可行的，因为生物传感器直接设置在标准CMOS的顶部上；因此 使得能够实时监测65000个单独的电极。进ー步，能够以高的精确度确定生物分子在生物受体上键合出现的时刻。因此能够在不同时刻出现的多组键合事件之间进行区分。将会理解，甚至在缺少电子电路的特别快的响应的情况中，只要响应时间是稳定的，就仍然可以确定键合事件出现的相对时间。而且，电子电路也将特别敏感，使得能够检测少量的键合事件。采用已知的电路，能够检测少至100个或者甚至10个键合事件。在对电路进行合适的优化的情况中，可能够检测甚至单个键合事件。图4在图4a、图4b、图4c和图4d处示意性地示出根据本发明的实施例的、处于将被分析物引入传感器阵列配置之后的不同时刻b，t1； t2和t3的传感器阵列配置40。传感器阵列配置40包括微流部41以及传感器阵列部42。微流部41包括微流通道43。在其长 度的一部分的范围内，微流通道与传感器阵列部42接触，具体地与传感器阵列的敏感区10接触。为简单起见，敏感区被示出为单个区块；然而，本领域技术人员将认识到，敏感区10由多个单独的传感器构成，每个传感器具有纳米电极11，其从传感器的与微流通道43接触的表面延伸到传感器阵列部42的本体中。传感器阵列部42可以被便利地制造为电子元件，并且通常基于硅芯片。如在图4a处所示，在时刻b处，包括分子类型或种类45和46的被分析物被引入微流通道43的起始处。典型地，分子种类45和46将是不同的种类。种类45和46中的一种的存在，或者甚至浓度可以是已知的，并且用作參考种类。被分析物可以包括可以键合至传感器阵列的敏感区10的两种不同的感兴趣种类，或者更大数量的不同种类。如以下将更详细地说明的那样，不同的分子类型或种类45和46可以以不同的速率(基于诸如它们的尺寸的之类的特性的差异)穿越微流通道43，并且因此在稍微的时刻h，分子45已经行进得比分子46远，如图4b所示。图4c示出了处于又ー个稍后时刻t2的传感器阵列配置40。此时，行进较快的分子45已经到达传感器阵列42的敏感区10 ;然而，移动较慢的分子46仍在飞行中。飞行是指它还未到达敏感区并且因此仍在运送中。传感器可以检测単独的分子45在形成传感器阵列的一部分的纳米电极结构上的键合。然而，即使传感器不够敏感来检测单独的分子45的键合，它将检测多个分子45的键合事件组，如下文进ー步讨论的那样。最后，如在图4d处所示，其它的移动较慢的分子46到达传感器阵列部42的敏感区10，并且键合至纳米电扱。此时，t3，传感器将检测另ー键合事件。因此，传感器能够基于不同类型的分子在微流通道43中的不同飞行时间在不同类型的分子45和46之间进行辨别。将会注意到，在该示例中，仅示出了每种类型45和46的单个分子；为了在两个分子之间成功地辨别，传感器的电子元件必须足够敏感以能够检测单个键合事件。然而，通常，根据被分析物内的每种类型的分子的浓度，每种单独的类型的45和46将存在数百、数千、数百万、或者甚至数十亿的分子将到达敏感区。只要任何单独类型的分子45或46的飞行时间是相对恒定的，如下文将更详细地描述的那样，则可以预期类型分子45中的大多数将到达传感器阵列的敏感区，即大概在同一时刻t2，并且其它类型的分子45的大多数可能将大概在同一时刻t3到达传感器阵列的敏感区。因此，传感器仅需要能够检测对应于到达传感器阵列的敏感区的预期数量的分子45和46的下限的一组键合事件。如图4所示，微流通道43的长度相对于传感器阵列42的敏感区10的尺寸是小的。然而，本领域技术人员将认识到，该示意图在很大程度上是示意性的，并且在大多数实际结构中，微流通道将明显长于敏感区的长度，以允许在不同类型的分子之间具有飞行时间的合适水平的辨别。在优选的实际配置中，将被设置为使得在传感器阵列的敏感区的隔开最远的单独的纳米电极之间行进的分子花费的时间小于到达敏感区的两种类型的分子的通过飞行时间辨别实现的预期时间差。图5为示意性地示出来自传感器阵列的电子元件的输出信号的表示的图示。该信号(在纵坐标轴或y轴上)表示检测活动已经发生的电极数量的差异，根据时间(在横坐标轴或X轴上)绘制。存在第一电容改变，其出现在时刻t2附近并对应于第一种类型或种类的分子45到达敏感区。这由曲线的第一部分51 (在图5中被绘制为虚线)示出。在第二、稍后的时刻t3附近，存在差分信号的另ー个峰值，对应于由于第二种类型或种类的分子46的到达引起的传感器阵列中的电容的另一次増加。第一和第二峰值二者的扩展是由每种类型的分子的键合时刻的扩展引起的。这首先源自下述事实，即单个模型将在可以处于被分析物引入其中的距微流通道43的起始位置不同距离处的単独部位处键合，并且因此单独的分子在键合之前行进不同的距离。其次， 由于正如本领域的技术人员理解的那样不仅由于扩散机制，単独的分子没有以恰好相同的速度穿越微流通道，因此，在単独的分子的到达时刻方面将存在着扩展。在其它实施例中，微流通道由改变朝向传感器表面的速度的凝胶体或色谱柱代替。这可以使效果更加清晰可见，虽然它需要一些采样准备。信号中的峰值的相对尺寸表示键合的分子的数量。因此该信号可以用来提供相对浓度的指示，或者甚至在某些情况下，如采用合适的校正，提供绝对浓度的指示，或者提供分子种类的指示。这可能是事实，甚至在其中传感器不够敏感来检测单独的键合事件的实施例中。当然，在其中传感器足够敏感来检测单独的键合事件的实施例中，作为测量模拟信号的替代，如信号51、52的峰值以下的区域，能够通过数字计数键合事件来确定分子45或46的相对或绝对浓度的指示。因此，对本发明的实施例重要的是下述事实，即针对不同类型的分子，能够在到达敏感区的到达时间之间进行区分。这种功能可以在微流部中执行，如图4所示微流部可以与传感器阵列集成在一起。然而，用来实现部分类型的分子之间的辨别的微流部可以与传感器阵列的敏感区实体地分离或隔开，或者可以在单独的元件或子单元(如凝胶体或色谱柱)中实现辨别。通过多种不同机制中的一种或它们的组合实现所述辨别；现在将被考虑的这种示例性机制是辨别的第一种方法是层析法层析法时本领域技术人员公知的。具有用于检测的分子的液态被分析物在到达敏感区之前首先通过色谱仪。具有较短保留时间的分子将较早地从色谱仪中出来并且比具有较长保留时间的分子较早地到达敏感区。其它机制涉及场的施加。在通过淘析(其也可以被称为重力沉降)、电泳和磁泳进行的各种辨别的情况中，所述场可以为重力场、电场、磁场。施加合适的场以形成沿朝向敏感区的运动。所述场可以施加在微流通道中，或者施加在该通道的上游。分子将根据它们的尺寸和它们在所述场中的响应(质量、电荷、磁化率)移动。通常，带电较多的分子将比带电较少的分子移动得快，在带电较少的分子之前到达传感器的敏感区，并且在带电较少的分子之前被检测到。在分子为球形的近似下，随后，通过平均摩擦力6 π nav，得到给定场中运动的球形分子的恒定漂移速率V，其中η为粘度，a为分子的半径，驱动カF为F = 6 31 n av (I)使得漂移速率取决于外加力和分子的尺寸V = F/6 η a (2)然而，如果热能=kT比外加力的功高，外加力的影响将可以忽略并且热运动将占支配地位。在电场的情况中，与粒子在电场中的运动相关联的功为W = ZeEh(3)Ze为粒子的电荷，E为电场，h为距离。电カ的功可以为高于热能的幅度的量级。通过改变溶液的PH值并因此改变分子的电荷，或者通过调整电场可以调整所述功。已知的是，电泳在凝胶体中比在简单水介质中更好地工作。在该情况中，像DNA的线性生物分子的迁移率与其分子长度成反比，并且因此容易可行的是在诸如不同DNA链之类的不同种类的分子之间进行辨别。在重力场的情况中，与粒子在重力场中的运动相关联的功为W = mgh = 4/3 π a3 ( P - P 液体)gh (4)其中m为粒子的质量，P为它的密度，P li(iuid为液体密度，g = 9. 81m/s2, h为垂
直距离。对于IOnm分子(这是最感兴趣的生物分子的典型尺寸)，热能为4E-21J，而对于
0.3mm的重カ功为5E-25J。因此热运动将占据主要地位，并且因此重力场不足以启动未被标记的生物分子。标记生物分子是本领域技术人员公知的。典型地，标签为具有化学基团或生物分子的功能化纳米珠子。它们必须被选择为键合至感兴趣的生物分子，并且与它们预混合，如现在将參照图6描述的那样。在图6 (a)处示出的是ー种溶液，具有两种类型的生物分子61，62和具有对应于被怀疑存在于该溶液中的生物分子的探针功能化珠子63，64，65。在图6 (b)处，所述珠子生物分子混合。在图6(c)处，示出的是，所述珠子捕获对应于它们的功能的探针生物分子。示出的是与生物分子61键合(或通过生物分子61功能化)的珠子63，以及与生物分子62键合(或通过生物分子62功能化)的珠子64 ;不存在使第三种珠子类型65功能化的任何生物分子。根据已知的技术(例如它们的功能团可以键合至其它种类的生物分子)，或者通过层析法，滤出未被键合的珠子。对于500nm的珠子，热能为4E-21J，而对于O. 3mm距离的重力功为4E-19J。这意味着重力运动将占据主要地位。漂移速度为V = mg/6 τι η a = 4/3 π a3 ( P - P 液体)g/6 π η a = 2/9a2(p -p 液体)g/ n (5)采用參数的典型值，对于500nm珠子和400nm珠子的时间差为约10分钟，这是容
易测量的。至少对于被标记分子可以施加磁场功能化的纳米珠子通常具有磁芯，并且可以·采用磁场启动。在该情况中，作用カ为,.P (Z2-Zr-B-(VB)…
_5] Fmag =----(6)其中X 2为磁性粒子的体积磁化率，X I为周围介质的体积磁化率，μ为自由空间的磁化率，V为珠子的可磁化体积，B为磁通量。也就是说，所述作用力取决于珠子的磁化率和它们的尺寸。珠子的尺寸和磁场优选被选择为使得数个珠子之间的辨别成为可能。而且，除了如上所述施加对未被标记的分子施加电场之外，还可以对标记分子施加电场电カ的功可以为比热能高的幅度的量级。通过改变溶液的PH值并因此改变分子的电荷，或者通过调整电场可以调整所述功。漂移速度为 V = zeE/6 π η a (7)这意味着粒子的运动将取决于它们的电荷z和半径a之间的比z/a。由于对于功能化珠子，每单位表面的电荷密度是恒定的(z与a2成比例)，这意味着速率实际上与珠子的半径a直接成比例。采用參数的典型值，对于500nm珠子和400nm珠子的时间差为约5分钟，这是容易測量的。总之，随后，从ー个观点看，公开了ー种传感器装置，其依赖于目标分子至纳米电极的键合事件组在时间上辨别。目标分子可以处于液相或位于悬浮液中。纳米电极形成具有多个传感器的传感器配置的一部分。传感器装置被设置为，采用诸如层析法或施加诸如电场、磁场或重力场之类的场的技术，使得不同种类的目标分子在不同的时刻到达纳米电扱。分子可以被标记或不被标记。本发明特别适合但不限于检测生物分子。通过阅读本公开内容，其它变型和修改对本领域技术人员将是明显的。这种变型和修改可以涉及分子传感器领域中已知的，且可以用来代替在此已经描述的特征或除了在此描述的特征之外的等同物和其它特征。虽然随附权利要求涉及特征的特定组合，应当理解，本发明的公开内容的范围还包括任何新颖性特征或在此明确地或隐含地公开的特征或其任何概括的任何新颖性组合，不管它是否涉及与如目前在任何权利要求中要求相同的发明，或者它是否减轻与本发明相同的任何或全部技术问题。如在此使用的术语粒子包括但不限于单分子粒子。类似地，术语生物分子将被以宽泛的含义进行解释以包括包含多个分子的粒子，仅仅在它具有影响其与其它生物分子相互作用的三位结构方面该粒子是“生物活性”的。在单独的实施例的上下文中公开的特征也可以被以组合方式提供在单个实施例中。相反，为简要起见在单个实施例的上下文中描述的特征也可以被单独地或以任何子组
合提供。因而申请人告知，在本申请或由此得到的任何其它申请的保护期间，新的权利要求可以被明确地表示这些特征和/或这些特征的组合。为了完整，还声明的是，术语"包括"不排除其它元件或步骤，术语“ー个”不排除多个，并且权利要求中的附图标记没有必要比解释为限制权利要求的范围。
权利要求
1.一种传感器装置，包括被配置为用于检测生物活性粒子的生物传感器，该传感器装置包括 多个传感器(10)的配置，用于检测处于液相或悬浮液或凝胶体中的至少ー种的被分析物，每个传感器包括纳米电极(11)并被配置为检测定位或键合到纳米电极的粒子(13a，13b，13c，13d)的存在， 其中传感器被配置为在时间上辨别粒子在相应纳米电极上的键合；和 输送装置，用于将多个种类的粒子从贮存器输送至纳米电极，其中不同种类的粒子分别花费不同的时间从贮存器穿越输送装置到达纳米电极。
2.根据权利要求I所述的传感器装置，其中输送装置被配置使得不同种类的粒子由于包括淘析、电泳、磁泳、电磁泳、热泳和层析法的现象组中的ー种现象而分别花费不同的时间从贮存器穿越输送装置到达纳米电极。
3.根据权利要求I或2所述的传感器装置，其中所述多个传感器的配置包括至少1000个传感器，或至少10000个传感器，或至少65000个传感器。
4.根据前述权利要求中任一项所述的传感器装置，其中传感器在传感器的主表面设置成阵列，每个传感器占据主表面的不大于IOOym2的表面积。
5.根据前述权利要求中任一项所述的传感器装置，被配置为在粒子在相应纳米电极上的第一组键合事件和粒子在相应纳米电极上的第二组键合事件之间在时间上辨别，其中第一组键合事件和第二组键合事件隔开大于1ms。
6.根据权利要求5所述的传感器装置，其中第一组键合事件和第二组键合事件隔开大于 100ms。
7.根据权利要求5所述的传感器装置，其中第一组键合事件和第二组键合事件隔开大于 10s。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的传感器装置，其中第一组键合事件和第二组键合事件中的至少ー个包括键合不多于1000个粒子。
9.根据权利要求8所述的传感器装置，其中第一组键合事件和第二组键合事件中的至少ー个包括键合不多于50个粒子。
10.根据权利要求8所述的传感器装置，其中第一组键合事件和第二组键合事件中的至少ー个包括仅键合单个粒子。
11.根据前述权利要求中任一项所述的传感器装置，其中纳米电极被配置为借助于自组装单层和生物受体粒子(12a，12b，12c，12d)中的至少ー种键合生物活性粒子。
全文摘要
本申请公开了一种传感器装置，其依赖于目标粒子在纳米电极上的多组键合事件之间在时间上的辨别。目标粒子可以处于液相或处于悬浮液中。纳米电极形成具有多个传感器的传感器配置的一部分。该传感器装置被配置为，采用诸如层析法或诸如电场、磁场或重力场的施加的技术，使不同种类的目标粒子在不同的时刻到达纳米电极。粒子可以是标记的或未标记的。本发明特别适合但不限于检测生物粒子。
文档编号G01N27/327GK102680548SQ20121006544
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月13日 优先权日2011年3月16日
发明者埃弗利娜·格里德莱特, 希尔柯·瑟伊, 菲利浦·弗雷德里 申请人:Nxp股份有限公司