专利名称：含有ape1/ref-1的膀胱癌诊断用组合物及利用其的膀胱癌诊断仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌诊断用组合物及利用其的膀胱癌诊断仪。
背景技术：
膀胱癌是在泌尿系统癌症中最常见的癌症，其产生原因也较多地被查明。主要被认为吸烟或者各种化学物质(例如，皮革等染色涂料、大气污染物、人造甜味剂、硝酸盐)被吸入到体内后，通过小便排泄出来的同时刺激膀胱壁，从而诱发癌症。在传统的膀胱癌检查中使用从小便中找出非正常细胞的方法，但是其精确度低。此外，将导液管(导管)插入到膀胱后，摘除并检查疑似癌变组织的膀胱镜检查是侵入式方法，从而具有较高的精确度。通常，如果在早期诊断出膀胱癌，则患者的生存率高，但是实际上不易在早期诊断出膀胱癌。现有使用的膀胱癌诊断方法是使用切开身体的一部分的方法，但是其很难在早期诊断出膀胱癌。膀胱癌根据是否侵袭到膀胱肌层来区分为浅表性或者浸润性癌症，在诊断时平均大约30%的患者属于浸润性膀胱癌。由此，如果要延长患者的生存期，则最好在病变范围小时进行早期诊断。由此，迫切需要开发与现有的各种膀胱癌诊断方法相比更有效率的诊断方法，换句话说，膀胱癌特异性生物标记物，其可进行早期诊断，并且可大量处理临床标本，并且灵敏度及特异性高。另夕卜，APEl/Ref-1 (apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1)是由包括氧化还原区(redox region)、DNA修复区(DNA repair region)的318个氨基酸构成的多功能蛋白质。上述蛋白质被认为具有如下功能:在DNA损伤时复原损伤部位的APEl的功能，以及如AP-1、NF-kB 一样的转录因子的还原性调节功能(redox function)(Gurusamy, Malik et al.2007)。APEl/Ref-1的转录因子还原性调节功能在许多转录因子的DNA结合区中将作为氧化型半胱氨酸(cysteine)的残余物进行还原，从而执行易于转录的作用(Xanthoudakis, Miao et al.1994; Tell, Damante et al.2005)。APEl/Ref-1存在于所有的细胞及组织，并且细胞内表达位置被认为根据细胞而有所不同。在转录阶段及转录后阶段的水平时对ΑΡΕΙ/Ref-l的表达调节进行调节。增加ΑΡΕΙ/Ref-l的表达的主要原因是活性氧簇(reactive oxygen species ;R0S)。在巨卩遼细胞及淋巴球对过氧化氢及次氯酸(hypochlorous acid ；H0CI)进行处理时，细胞内APEl/Ref-1的表达会增加，上述APEl/Ref-Ι的表达增加被认为用于保护细胞的毒性及氧化性损伤的细胞的适应反应(R_ana Boldogh et al.1998)。对于APEl/Ref-Ι的细胞内位置的报告有各种各样。如果对ΑΡΕΙ/Ref-l的蛋白质序列进行分析，则可想到上述各种细胞内位置的多样性。在APEl/Ref-Ι的氨基酸末端部位(endsite)存在有核定位信号(nuclear localization signal; NLS ) (Jackson, Theriotet al.2005)，并且被认为在作为半胱氨酸的93号和310号氨基酸的氮化合中存在有核输出信号(nuclear export si gnal; NES)，上述核输出信号将存在于核内的ΑΡΕΙ/Ref-l移动至细胞质(Qu，Liu et al.2007)。另外，在线粒体中也被确认有ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质的表达(Chattopadhyay, Wiederhold et al.2006)。生成于细胞内的APEl/Ref-Ι蛋白质可游离至细胞外。在巨噬细胞中，根据内毒素的细胞活性及炎症反应将ΑΡΕΙ/Ref-l游离至细胞外。由此，正确测定ΑΡΕΙ/Ref-l的能力被认为在心脑血管疾病、传染疾病及肿瘤等许多生物学过程中对ΑΡΕΙ/Ref-l的潜在性作用等进行理解时很重要。但是，到目前为止还没有对于ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质是否作为膀胱癌诊断用标记物进行作用的报告，与此相关的研究也处于全无的状态。由此，迫切需要生物标记物的开发，其在健康检查时，从血液中简便地早期诊断出膀胱癌，从而可增加患者的生存率。

发明内容
本发明者在对早期可迅速简便正确地诊断出膀胱癌的生物标记物进行研究中，APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度在与正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质的浓度相比较，在膀胱癌患者的血清中，特别是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明显地增加，并且与复发次数无关，对如下进行确认后完成了本发明:APE1/Ref-1蛋白质的浓度在膀胱癌患者的血清中增加。本发明提供含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌诊断用组合物。另外，本发明提供膀胱癌诊断仪，其含有特异性地结合于ΑΡΕΙ/Ref-l的抗体。另外，本发明提供一种测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，该方法通过利用了特异性地结合于膀胱癌标记物即APEl/Ref-Ι的抗体的抗原-抗体结合反应在生物试样中测定APEl/Ref-Ι 的浓度。本发明的APEl/Ref-Ι的浓度与正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度相比较，在膀胱癌患者的血清中，特别是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明显地增加。另外，在膀胱癌复发的情况下，与复发次数无关，APEl/Ref-Ι的蛋白质浓度与未复发的初期膀胱癌患者的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的蛋白质浓度相比较，在膀胱癌患者的血清中有明显地增加。由此，本发明的ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质可早期预测膀胱癌的诊断或者预后，因此可有效地使用为膀胱癌诊断用标记物。


图1是表示ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质的酶联免疫吸附测定(ELISA)标准曲线的图。图2是在膀胱癌患者和正常人的血清中通过夹心酶联免疫分析(SANDWICHELISA)法测定APEl/Ref-1蛋白质的浓度后进行比较的图。图3是表示根据膀胱癌各个阶段的膀胱癌患者的血清中APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度的图。图4是表示根据膀胱癌的复发次数及病变数的膀胱癌患者的血清中APEl/Ref-1蛋白质的浓度的图[(A)Rtl:未复发，R1:复发次数为I次，R3:复发次数为3次，R7:复发次数为7次；⑶single:单发性 ，multiple:多发性]。
具体实施方式
本发明提供含有ΑΡΕΙ/Ref-l的膀胱癌诊断用组合物。另外，本发明提供含有抗体的膀胱癌诊断仪，上述抗体特异性地结合于APEl/Ref-10另外，本发明提供一种测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，该方法通过利用了特异性地结合于膀胱癌标记物即APEl/Ref-Ι的抗体的抗原-抗体结合反应在生物试样中测定APEl/Ref-Ι的浓度。以下，对本发明进行详细说明。本发明的APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度在膀胱癌患者的血清中高于正常人的血清中APEl/Ref-Ι蛋白质浓度的1.5 3.5倍，并且患膀胱癌的阶段越高，特别是在2期以上的膀胱癌患者的血清中明显地增加。另外，当膀胱癌复发时，与复发次数无关，ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质的浓度在膀胱癌患者的血清中与在未复发的初期膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度相比较明显地增加。由此，本发明的ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质可早期预测膀胱癌的诊断或者预后，因此可有效地使用为膀胱癌诊断用标记物。另外，利用上述ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质并根据通常使用于所属领域的制造方法可易于制造本发明的膀胱癌诊断仪，本发明的上述膀胱癌诊断仪包括有特异性地结合于APEl/Ref-1的抗体。上述膀胱癌诊断仪可包括与抗体、二次抗体接合物、标志物进行发色反应的发色基质溶液、清洗溶液及酶反应停止溶液等，上述抗体特异性地结合于ΑΡΕΙ/Ref-l，上述二次抗体接合物(conjugate)接合有通过与基质反应而发色的标志物。优选地，上述二次抗体接合物的标志物为进行发色反应的通常的发色剂，并且可使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、喊性憐酸酶(alkaline phosphatase)、胶体金(coloid gold)、异硫氰酸突光素(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)、罗丹明B异硫氰酸盐(rhodamine-B-1sothiocyanate)等突光物质(fluorescein)及色素(dye)等。

优选地，上述发色基质溶液根据标志物进行使用，可使用四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethyl benzidine)、2, 2_联氮-二(3_ 乙基-苯并噻唑_6_横酸)二铵盐(ABTS)、邻苯二胺(o-phenylenediamine)等。此时，更优选地,发色基质在溶解于缓冲溶液(0.1MNaOAc, Ph5.5)的状态下提供。优选地，清洗溶液包括磷酸盐缓冲溶液、氯化钠(NaCL)及吐温20，并且更优选为由0.02M磷酸盐缓冲溶液、0.13M氯化钠(NaCL)及0.05%吐温20构成的缓冲溶液(PBST)。清洗溶液在抗原-抗体结合反应后，将抗原-抗体结合物与2次抗体进行反应，之后将适当量添加于固定体，从而进行3至6次清洗。反应停止溶液可使用为磺酸溶液。另外，本发明中，通过抗原-抗体结合反应在生物试样中测定ΑΡΕΙ/Ref-l蛋白质的浓度，从而可早期预测膀胱癌的诊断或者预后，上述抗原-抗体结合反应利用特异性地结合于作为膀胱癌标记物的APEl/Ref-Ι的抗体。具体地，将生物试样与固定化于固定体的捕获抗体进行接触，并且将从固定化的捕获抗体中剩余的试样进行分离后，将固定化的捕获抗体-分子靶向复合体与检测抗体进行接触。之后，利用可认知检测抗体的检测方法来在生物试样中测定APEI/Ref-1蛋白质的浓度。换句话说，在膀胱癌患者和正常人的血清中测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度后进行比较，从而如果在膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι的浓度高于正常人的血清中的ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度，则诊断为具有膀胱癌或者预测为会具有膀胱癌。特别是，APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度在膀胱癌的阶段越高，优选地，2期以上的膀胱癌患者的血清中有明显增加。上述生物试样可包括从哺乳动物中提取的如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、咳痰、小便一样的试样，但是并不限于此。上述试样在使用之前可通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、阻碍成分的失活、试剂的添加等进行预处理。用于上述抗原-抗体结合反应的固定体可使用硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)、聚乙烯树脂或者由聚苯乙烯树脂合成的96孔板以及形成为玻璃的载片等。上述抗原-抗体结合反应可利用通常的如下方法来执行:酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmnoassay, RIA)、夹心酶联免疫吸附测试法(SANDWICHELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法(immnohi stochemicalstaining)、流式细胞术测定法(Flow Cytometry)、突光活化细胞分类法(FACS)、酶基质发色法、抗原-抗体凝沉法等。本发明中，抗体可以是整体形态的抗体(以下称为“全抗体”)或者其功能性的片段。上述全抗体可以是单体或者是结合有2个以上的全抗体的聚合体的形态。上述抗体的功能性片段为具有全抗体的中链及轻链可变区的抗体，实质上意味着认知与全抗体认知相同的抗原结合区(印itope)。在上述抗体的功能性的片段中包括有单链可变区片段(scFv)、(scFv) 2、Fab、Fab’及F (ab’)2等，但是并不限于此。上述单链可变区(scFv)意味着抗体片段，上述抗体片段中，中链可变区和轻链可变区通过连接肽进行连接，从而具有单链多肽形态。上述抗体结合于如酶、荧光物质、辐射物质及蛋白质等各种分子后可进行变形。变形的抗体可通过化学方法来进行变形并提取。上述变形方法通常使用于所属领域。另外，上述抗体可提取为嵌合抗体(chimeric antibody),上述嵌合抗体结合有来自于非人类抗体中的可变区(variable re gion)和来自于人类抗体中的恒定区(constant region),或者包括有从非人类抗体中诱导的互补性决定区，从而提取为从人类抗体中诱导的结构区(framework region, FR)和结合有不变区的人源抗体(humanized antibody)。上述抗体可利用已知于所属领域的方法来制造。以下，为了易于理解本发明，提供优选实施例。但是以下实施例只是为了更易于理解本发明而提供的，而不是通过实施例限定本发明的内容。实施例1:在膀胱癌患者的血清中测定APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度为了在膀胱癌患者的血清中测定APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度，利用夹心酶联免疫分析法来执行如下所述的实验。1.准备用于酶联免疫吸附测定法(ELSIA)的试样为了测定膀胱癌患者和正常人的血清内的ΑΡΕΙ/Ref-l的量，利用装有阻凝剂的全血采集管来采集正常人和膀胱癌患者的血液。从51名膀胱癌患者和56名为了健康检查而提供帮助的正常人中分别采集IOml左右的血液。将上述采集的血液在常温中进行摇动并放置后，在2500rpm的情况下进行10分钟圆心分离，并且将上层液(即，血浆)进行分离。将分离的上层液在4°C低温中保管后，在执行夹心酶联免疫分析时，每个试样使用100μ I。2.决定用于酶联免疫吸附测定法(ELSIA)的抗体和标准物质
作为认知APEl/Ref-Ι的捕获抗体使用了抗-ΑΡΕΙ/Ref-l多克隆抗体(Abeam, ab64865)。作为认知结合于捕获抗体的ΑΡΕΙ/Ref-l的检测抗体使用了抗-APEl/Ref-1单克隆抗体(Abcam，abl94)。作为ΑΡΕΙ/Ref-l的标志物质将从大肠菌中分离、纯化的再组合人类APEl/Ref-1-His每5倍连续稀释(0_25ng)而使用。3.夹心酶联免疫分析法在涂层缓冲液(05.M碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)中将捕获抗体按照200ng/ml的浓度进行稀释，从而涂层于用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的96孔微孔板(BDFalcon3072，Franklin, NJ)。在4°C中对板进行整夜涂层。为了去除未结合的APEl/Ref-1多克隆抗体，使用清洗溶液(PBS，0.05%Tween20)来将板清洗3次。在清洗后，使用250 μ I封闭溶液(PBS，5%Bovine Serum Albumin, BSA)来在常温下将板封闭一个小时。将每100 μ I膀胱癌患者和正常人的血浆试样分别添加至96孔板，并且在37°C下反应90分钟。利用清洗溶液将板清洗5次。为了调查结合于捕获抗体的ΑΡΕΙ/Ref-l的程度，将检测抗体抗-ΑΡΕΙ/Ref-l单克隆抗体稀释为200ng/ml的浓度，在常温下反应2个小时。利用清洗溶液将板清洗7次。将认知检测抗体的HRP-结合的抗-小鼠IgG 二次抗体按照1:5000进行稀释，并且添加至板上。将板在常温下反应30分钟，并且使用清洗溶液清洗5次。在板中添加了四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)过氧化物酶基质及过氧化物酶溶液(BD555214, Franklin, NJ)0将板在常温下产生变色开始的同时反应4分钟，并且有规则地进行摇动。将2.5M H2SO4作为反应停止液进行添加，并且在450nm的情况下测定了吸光度。4.决定根据本发明的酶联免疫吸附测定(ELISA)的标准范围将纯化并分离的再组合人类APEl/Ref-His在0_25ng范围内连续稀释，从而获得表示直线性的标准曲线，并且表示于表I及图1中。1.在膀胱癌患者和正常人的血清中利用夹心酶联免疫分析法来测定APEl/Ref-1蛋白质的浓度后进行比较的结果表示于表2及图2中，根据处于膀胱癌的各个阶段的膀胱癌患者的血清中的APEl/R·ef-Ι蛋白质的浓度表示于图3中，根据膀胱癌的复发次数及病变数的膀胱癌患者的血清中的APEl/Ref-Ι蛋白质的浓度表示于图4中[(A)Rtl:未复发,R1:复发次数为I次，R3:复发次数为3次，R7:复发次数为7次；(B)single:单发性，multiple:多发性]。表I
APEI/Rcf4iK吸光度零标准值(獅standard |
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I iV 1.K:
00.04900.0480 0.0477!). )0.16<1053110.056() 0.05430.01
0.10,08200.0810 0.0 膨0.04
4I).1 Wli ΟΙΙΟ ΙΟΟΗ3(λ 12
20().54400.5110 0.52970.4S表权利要求
1.一种膀胱癌诊断用组合物，其特征在于，该组合物含有APEl/Ref-1。
2.根据权利要求1所述的膀胱癌诊断用组合物，其特征在于， 上述ΑΡΕΙ/Ref-l在2期以上的膀胱癌中具有特异性。
3.—种膀胱癌诊断仪，其特征在于，该诊断仪含有特异性地结合于ΑΡΕΙ/Ref-l的抗体。
4.一种测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，其特征在于，该方法通过利用了特异性地结合于膀胱癌标记物即ΑΡΕΙ/Ref-l的抗体的抗原-抗体结合反应在生物试样中测定APEl/Ref-1的浓度。
5.根据权利要求4所述的测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，其特征在于，上述生物试样包含选自由从哺乳动物中提取的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、咳痰、及小便组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求4所述的测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，其特征在于， 上述抗原-抗体结合反应利用选自由酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmnoassay, RIA)、夹心酶联免疫吸附测试法(SANDWICH ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法(immnohistochemical staining)、流式细胞测定法(FlowCytometry)、突光 活化细胞分类法(FACS)、酶基质发色法及抗原-抗体凝沉法组成的组中的一种以上方法来进行。
7.根据权利要求4所述的测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，其特征在于， 在膀胱癌患者的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度高于在正常人的血清中ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的1.5 3.5倍。
8.根据权利要求4所述的测定ΑΡΕΙ/Ref-l的浓度的方法，其特征在于， 上述ΑΡΕΙ/Ref-l在2期以上的膀胱癌中具有特异性。
全文摘要
本发明涉及含有APE1/Ref-1的膀胱癌诊断用组合物、含有特异性地结合于APE1/Ref-1的抗体的膀胱癌诊断仪，以及一种测定APE1/Ref-1的浓度的方法，该方法通过利用了特异性地结合于膀胱癌标记物即APE1/Ref-1的抗体的抗原-抗体结合反应在生物试样中测定APE1/Ref-1的浓度。本发明的APE1/Ref-1的浓度与正常人的血清中APE1/Ref-1蛋白质的浓度相比较，在膀胱癌患者的血清中，特别是在2期以上的膀胱癌患者的血清中有明显地增加。另外，在膀胱癌复发的情况下，与复发次数无关，APE1/Ref-1的浓度与未复发的初期膀胱癌患者的血清中APE1/Ref-1的浓度相比较，在膀胱癌患者的血清中有明显地增加。由此，本发明的APE1/Ref-1蛋白质可早期预测膀胱癌的诊断或者预后，因此可有效地使用为膀胱癌诊断用标记物。
文档编号G01N33/574GK103250055SQ201180059177
公开日2013年8月14日 申请日期2011年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者田炳和, 崔星儿, 申珠贤 申请人:忠南大学校产学协力团