专利名称：用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉 及一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
肾移植后排斥反应是受者免疫系统识别异体移植肾抗原后所发生的一系列体液 和细胞免疫反应，其中超急性、急性、慢性排斥反应的区分主要是根据发生时间的早晚、病 程进展的快慢。急性排斥反应可发生于移植后任何时间，并以最初一个月内最为多见。急 性排斥反应的发病机理多为迟发性过敏性细胞免疫，其病理则主要有以下两型细胞性排 斥反应为主者多为肾间质水肿和大量免疫活性细胞浸润，体液性排斥反应为主者多为中、 小动脉血管壁纤维蛋白样坏死和血管炎，部分病例可兼有上述两种反应。相比于其他各类 排斥反应，急性排斥反应的发生最多见，所有尸体肾移植和非同卵孪生亲属肾移植病人都 有可能发生急性排斥反应。由于急性排斥反应的高发生率，医学界对于该问题一直保持着 密切的关注。除此之外，急性排斥反应还具有发生时间不定、临床表现多样等特点，目前临 床上对于急性排斥反应应早期诊断、早期治疗，以减轻排斥对于移植肾的损害。鉴于以上所 述几点，探索具有诊断价值的新型简易生物标记物不仅有益于急性移植肾排斥的早期诊断 和早期干预，还会带来巨大的社会效益和经济效益。临床上肾移植后病人多数长期使用环孢素，而使用环孢素后，多数急性排斥反应 的临床表现多不典型，程度轻。同时，由于病理的不确定，其实验室检查多无特异。因此，传 统意义上的临床表现和实验室检查并不能很好的协助急性排斥反应的诊断。目前常用的诊 断方法包括移植肾细针穿刺活检，移植肾组织穿刺活检，移植肾多普勒超声肾血管阻力测 定。但血管阻力的测定只能为一辅助指标，对于确诊的意义相对并没有穿刺大。穿刺活检 是诊断的金标准，但在目前仍有许多不便之处。首先，肾活检有滞后性，进行肾活检需要有 一定的指证，而这些指证的出现，往往表示肾功能的损害已经发生。其次，肾活检多为排除 其他疾病可能后的选择，而排除过程中的检查和诊断又需耗去大量的时间，造成不必要的 经济损失和医疗资源浪费。再者，肾活检手续较为繁琐，其前期检查、手术操作、后期处理都 有相关的要求，施行不便，因此，定期随访肾活检对于肾移植患者而言往往较难接受。综上 所述，如能有更为灵敏、特异、方便的指标代替肾活检进行肾移植后急性排斥反应的诊断， 将为医护人员、病人带来极大的便利，也必然拥有极为广阔的应用市场。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒，其 特征在于，由生物蛋白及其酶标抗体，PH值为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐 缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组 成；
其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8 (Protein S100-A8)，蛋白S100-A9(Protein S100-A9)， ITIH3 前 体(Isoform 1 of Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 precursor)， IGFBP2 前 体(Insulin-like growth factor-binding protein 2 precursor)，血红素结合蛋白前体(Hemopexin precursor)，AlBG 前体(alpha ΙΒ-glycoprotein precursor)，AP0A4 前体(Apolipoprotein A-IV precursor)，纤维蛋 白原 β 链前体(Fibrinogen beta chain precursor)，结合珠蛋白前体(Haptoglobin precursor)，C0L1A2 前 体(Collagen alpha-2 (I) chain precursor)，ITIHl 前 体(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain Hl precursor)， COLlAl 前 体 (Collagen alpha-1 (I) chain precursor)，SERPINC1 抗凝血酶 III 变异体(SERPINC1 Antithrombin III variant), SERPINC1 蛋白(SERPINC1 protein)，纤连蛋白 1 同工异型 体 4 前蛋白原(fibronectin 1 isoform 4 pr印roprotein)，SERPINA3 α-1-抗 疑乳蛋 白酶前体(SERPINA3 Alpha-l-antichymotrypsin precursor)，C3 前体(Complement C3 precursor)，C9 前体(Complement component C9 precursor)，纤维蛋白原 α 链同工异 型体前体(Isoform 1 of Fibrinogen alpha chain precursor)，维生素 D 结合蛋白前体 (vitamin D-binding protein precursor)在内的 20 禾中生物蛋白。本发明的优点是
1.本发明首次提出包括补体，细胞因子，纤维蛋白，结合蛋白等多种生物蛋白类别在内 的20种生物蛋白或与其它临床指标组合可成为肾移植后急性排斥反应的主要指标。2.包括补体，细胞因子，纤维蛋白，结合蛋白等多种生物蛋白类别在内的20种生 物蛋白作为预测指标较目前用于诊断肾移植后急性排斥反应的超声指标及其他临床指标 更为客观可靠，而且测定此类蛋白表达水平相较于肾穿更为简单易行。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。 实施例一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒，由生物蛋白及其酶标抗体，PH值 为9. 6的碳酸盐缓冲液，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联 苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；
其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8，蛋白S100-A9，ITIH3前体，IGFBP2前体，血 红素结合蛋白前体，AlBG前体，AP0A4前体，纤维蛋白原β链前体，结合珠蛋白前体，C0L1A2 前体，ITIHl前体，C0L1A1前体，SERPINC1抗凝血酶III变异体，SERPINC1蛋白，纤连蛋白 1同工异型体前蛋白原，SERPINA3, C3前体，C9前体，纤维蛋白原α链同工异型体前体，维 生素D结合蛋白前体在内的20种生物蛋白。所述pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液为将1. 59克碳酸钠和2. 93克碳酸氢钠加至IL 蒸馏水中而得。所述PH值为7. 4的磷酸盐缓冲液为0. 2克磷酸二氢钾，2. 9克十二水合磷 酸氢二钠，8. O克氯化钠，0.2克氯化钾，0. 5ml吐温_20加至IL蒸馏水中而得。所述血清蛋 白稀释液为将0. 1克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至100ml pH值为7. 4磷酸盐缓冲液而 得。所述终止液为2M硫酸溶液。所述四甲基联苯胺底物溶液为将0. 5ml四甲基联苯胺的无 水乙醇溶液(10mg/5ml)，10ml pH值为5. 0底物缓冲液与32ul过氧化氢水溶液(0. 75vol%)
4混合而得，PH值为5. O底物缓冲液为含0. 2M磷酸氢二钠和0. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。上述试剂盒的使用方法如下
1、包被用PH值为9. 6碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为Ι-lOug/ml。在 每个聚苯乙烯的反应孔中加0. 1ml，于4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用pH值为7. 4的磷 酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。2、加样分别加一定血清蛋白稀释液稀释后的待检样品、正常人血清和阳性对照 血清0. Iml至上述已包被的反应孔中，置37°C孵育1小时后用PH值为7. 4磷酸盐缓冲液洗 3次，每次3分钟。3、加辣根过氧化物酶标抗体在各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标抗 体0. 1ml，37°C孵育0. 5-1小时后用PH值为7. 4磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。4、加底物液显色在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液0. lml，37°C下孵育 10-30分钟。5、终止反应在各反应孔中加入2M硫酸0. 05ml。6、结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。 若大于规定的阴性对照OD值2. 1倍，即为阳性。
以正常对照品蛋白表达水平作为衡量标准，肾移植后急性排斥反应患者血清蛋白谱表 达量除以此标准，从而确定患者蛋白谱相对于正常人的表达比例。其中，大于或等于2. 4为 增高，小于2. 4为降低。本发明通过收集5例肾移植后急性排斥患者血浆、8例肾移植后功 能稳定者，应用蛋白质芯片技术检测血清内多种生物蛋白，同时以肾移植后功能稳定患者 血浆中蛋白表达水平作为衡量标准，筛选肾移植后急性排斥患者血浆蛋白谱中上调的生物 蛋白。最终确定肾移植后急性排斥患者血浆蛋白谱中有20种生物蛋白表达与肾移植后功 能稳定者血浆比较存在差异，其中包括20种生物蛋白上调的表达改变(表1)。
表1、多种生物蛋白在肾移植后急性排斥患者、肾移植后功能稳定者血浆中的表达变化
表
权利要求
一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒，其特征在于，由生物蛋白及其酶标抗体，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100 A8，蛋白S100 A9，ITIH3前体，IGFBP2前体，血红素结合蛋白前体，A1BG前体，APOA4前体，纤维蛋白原β链前体，结合珠蛋白前体，COL1A2前体，ITIH1前体，COL1A1前体，SERPINC1抗凝血酶III变异体，SERPINC1蛋白，纤连蛋白1同工异型体前蛋白原，SERPINA3，C3前体，C9前体，纤维蛋白原α链同工异型体前体，维生素D结合蛋白前体在内的20种生物蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种用于诊断肾移植后急性排斥反应的试剂盒，其特征在于，由生物蛋白及其酶标抗体，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；其中，所述的生物蛋白是包括蛋白S100-A8，蛋白S100-A9，ITIH3前体，IGFBP2前体，血红素结合蛋白前体等的20种生物蛋白。本发明首次提出包括补体，细胞因子，纤维蛋白，结合蛋白等多种生物蛋白类别在内的20种生物蛋白或与其它临床指标组合可成为肾移植后急性排斥反应的主要指标。
文档编号G01N33/68GK101937001SQ20101026607
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者戎瑞明, 朱冬, 朱同玉, 武多娇, 王向东, 许明 申请人:复旦大学附属中山医院