专利名称：肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病原生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型抗原检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术：
手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox,A组16、4、5、7、9、10型,B组2、5、 13型)、埃可病毒(Echo)和肠道病毒71型(EV71)引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例的比例较大。肠道病毒呈球形,呈二十面体立体外观,无包膜,直径27 30nm。衣壳由60个相同壳粒组成，它们排列为12个五聚体。每个壳粒由来自一个原始壳粒蛋白VPO的4种多肽(VPU VP2、VP3、VP4)组成。VP1、VP2、VP3暴露于外面，带有中和抗体的特异性抗原位点，VP4位于衣壳内部。肠道病毒基因组为单股正链RNA，长7.2 8. 5kb。基因组两端为保守的非编码区，中间为连续的开放读码框架，编码一个2100 2400氨基酸的多聚蛋白。功能蛋白至少包括RNA聚合酶和两种其他的蛋白酶。此外，5‘端共价结合一个约23氨基酸的基本蛋白VPg,与病毒RNA的合成和装配有关；3端带有约50 nt的polyA尾,与病毒的感染性有关。VPl蛋白是病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性，具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性及较大的变异性，为EV71基因分型的最重要对象，VPl蛋白是最适合建立ELISA方法的抗原。由于针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中，因此，对手足口病病毒尤其是EV71引起的重症患病儿童的早期诊断，可以更经济准确的控制该病流行及重症并发症的出现，从而保证儿童的健康。中国医学科学院医学生物学研究所公开了“EV71型病毒抗原的检测方法”专利(申请号200910094972. 0)，该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了“EV71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利(申请号200910131382. 0)，该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，不适合作早期大规模筛查用。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测肠道病毒71型的快速检测试纸条，用于检测肠道病毒71型的辅助诊断。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案如下肠道病毒71型胶体金检测试纸条，其包含有I)包被肠道病毒71型VPl特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；2)含有胶体金标记肠道病毒71型VPl特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜。本发明的另一目的在于提供上述肠道病毒71型胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤。I、两种EV71单克隆抗体的制备用人工合成SP55和SP70两段VPl的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备两株杂交瘤细胞，分别进行细胞培养后收集培养液，层析纯化后浓缩并冻干，_20°C保存备用，一株用于胶体金标记蛋白的制备，另一株用于包被硝酸纤维膜。2、抗体-胶体金结合垫的制备采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金颗粒，确定单克隆抗体胶体标记的最佳结合pH为8. 5,胶体金和抗体的配比为4. 5ug/ml胶 体金，待标记蛋白最佳缓冲液选择O. 005M、pH8. 2 8. 5的硼酸盐缓冲液,标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37°C恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存。3、半成品膜条的制备^fVPl的另一株单克隆抗体用O. 005M的硼酸盐缓冲液稀释成20(^g/ml，将抗鼠IgG用O. 005M的硼酸盐缓冲液稀释成I. 2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为O. 6-1. 0cm，干燥后于室温干燥保存。4、检测试纸条组装将上述制备好的抗体-胶体金结合垫、半成品膜条、样品垫、吸水垫和反应支持物PVC板组装成检测试纸条。本发明的目的还在于提供上述快速检测试纸条在检测肠道病毒71型中的应用。本发明的原理是采用一株EV71单克隆抗体标记40nm的胶体金制成金标垫,另外一株包被于硝酸纤维膜一端用作检测线，用抗鼠IgG包被于NC膜另一端作为质控线，辅以样品稀释液处理待测样品，采用双抗体夹心法的原理检测样品中的EV71抗原。本发明有益效果是本发明的胶体金检测试纸条操作简单、快捷且无需应用专业仪器设备，适于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断。
具体实施例方式实施例I :EV71单克隆抗体的制备。本产品的关键原料为EV71单克隆抗体和抗鼠IgG，二者的研发及制备地点均为中科院武汉病毒研究所。EV71单克隆抗体制备根据供应商提供的资料EV71单克隆抗体其制备方法如下
用人工合成SP55和SP70(分别包含VPl的第163-177，208-222位氨基酸)两段VPl的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，常规杂交瘤细胞技术进行细胞融合，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价，筛选出具有抗EV71抗体高分泌性、高亲合力的杂交瘤细胞作为原始细胞株准备投入生产，_173°C液氮条件下存放。将按上述方法筛选得到的细胞种子从_173°C液氮罐中取出，尽快融化，在37°C培养获得一级种子液，同样条件培养得二级种子液，然后将种子液移至细胞培养缸中，于37°C的二氧化培养箱中培养，收集培养液。
上述培养液通过离心后获取上清液，再经膜分离系统过滤，收集到的上清液即为含EV71单抗的粗提物。将粗提物分别经过亲和层析，收集抗体，再经浓缩管浓缩至规定浓度。配制的2种包含不同EV71核心位置的抗体溶液，分别灌装、冻干成冻干管，_20°C保存备用。生产时其中一种用于胶体金标记蛋白的制备，另一种用于包被于硝酸纤维膜上。实施例2 :肠道病毒71型胶体金检测试纸条的制备。1、胶体金的制备采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，具体步骤如下1)打开数显搅拌恒温电热套，温度设220°C ；2)取纯化水990ml倒入圆底烧瓶中，加入1%的氯化金10ml，放入数显搅拌恒温电热套里面进行加热搅拌；3)待圆底烧瓶中的溶液至沸30s后，加入1%柠檬酸三钠20ml，观察溶液变成酒红色后，继续煮沸IOmin后停止加热；4)自然冷却到室温后，加纯化水水定容至IOOOml ;5)避光2-8°C保存备用。2、抗体-胶体金结合垫的制备I)量取上述金液250ml加2. 5ml、0. IM的K2CO3,调pH至8. 0-8. 5，搅拌5min ；2)取标金用EV71单克隆抗体lmg，用25ml,O. 005M的硼酸盐缓冲液(PH8. 5)稀释后，倒入上述金液中，搅拌30min ;3)加入2. 5mlU% PEG20000，搅拌30min ;4)装入离心管中，IOOOOrpm离心Ih ;5)弃上清液,每瓶各加125ml、0. 005M的硼酸盐缓冲液(pH8. 5)，混匀后平衡，IOOOOrpm离心Ih ;6)弃上清液，所得沉淀用含l%BSA+0. 5%吐温20的O. 005M的硼酸盐缓冲液(pH8. 5)稀释至一定浓度；7)按每平方厘米100_150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37 °C恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存。3、半成品膜条的制备将VPl的另一株单克隆抗体用O. 005M的硼酸盐缓冲液稀释成20(^g/ml，将抗鼠IgG用O. 005M的硼酸盐缓冲液稀释成I. 2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为O. 6cm，膜条长8cm，宽3毫米，干燥后
于室温干燥保存。4、检测试纸条组装将上述制备好的胶体金结合垫、检测线、质控线、样品垫、吸水垫和反应支持物组装成检测试纸条。实施例3 :检测方法及结果。I、检测方法用棉签取样后，放入盛有500微升样品处理液的试管中，将拭子头部在管中搅动5下，使样本尽量多的保存在米样液中，并于管壁上挤压拭子头，尽量将拭子吸住的采样液挤回管中，再弃去拭子；将试纸插入试管,液面不超过MAX线,5-15分钟内观测结果。2、检测结果本发明的检测试纸条在湖南省儿童医院、湖南省第二人民医院和湖南省疾病预防控制中心进打临床考核，包括手足口病门诊患者、手足口病入院患者、肝病中心住院儿童、感染科各种疾病住院儿童，共考核了 1002名受试者。临床实验验证的结果表明肠道病毒71型(EV71)抗原检测试剂(胶体金法)，准确度高，特异性好，其中粪便拭子准确度为92. 8%，特异度为95. 3%，灵敏度为86. 9%，阳性样本与PCR的符合率为86. 9%，阴性样本与PCR的符合率为96. 9% ;咽拭子准确度为94. 3%，特异度为98. 6%，灵敏度为84. 2%，阳性样本与PCR的符合率为84. 2%，阴性样本与PCR的符合率为99. 4% ;肛拭子准确度为94. 7%，特异度为97. 0%，灵敏度为89. 2%，阳性样本与PCR的符合率为89. 2%，阴性样本与PCR的符合率为98. 3%。从临床适用性来看，该试剂可适用于EV71型粪便拭子、咽拭子、肛拭子的检测，且操作简便、可即时得知结果，非常方便各医疗机构快速辅助鉴别诊断及监测手足口病重症型。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1.一种肠道病毒71型胶体金检测试纸条，其特征在于，包含有 1)包被肠道病毒71型VPl特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜； 2)含有胶体金标记肠道病毒71型VPl特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜。
2.ー种制备权利要求I所述肠道病毒71型胶体金检测试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)两种EV71单克隆抗体的制备用人工合成SP55和SP70两段VPl的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备两株杂交瘤细胞，分别进行细胞培养后收集培养液，层析纯化后浓缩并冻干，_20°C保存备用，一株用于胶体金标记蛋白的制备，另ー株用于包被硝酸纤维膜； 2)抗体-胶体金结合垫的制备采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金颗粒，确定单克隆抗体胶体标记的最佳结合pH为8. 5,胶体金和抗体的配比为4. 5ug/ml胶体金，待标记蛋白最佳缓冲液选择0. 005M、pH8. 2 8. 5的硼酸盐缓冲液,标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37°C恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存； 3)半成品膜条的制备将VPl的另ー株单克隆抗体用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成200Pg/ml，将抗鼠IgG用0. 005M的硼酸盐缓冲液稀释成I. 2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为0. 6-1. 0cm，干燥后于室温干燥保存； 4)检测试纸条组装将上述制备好的抗体-胶体金结合垫、半成品膜条、样品垫、吸水垫和反应支持物PVC板组装成检测试纸条。
3.根据权利要求I所述肠道病毒71型胶体金检测试纸条在检测肠道病毒71型中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型胶体金检测试纸条，该试纸条包括包被肠道病毒71型VP1特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；以及含有胶体金标记肠道病毒71型VP1特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜，本发明原理是应用膜层析双抗体夹心法检测样本中肠道病毒71型。本发明还公开了该胶体金检测试纸条的制备方法和应用。本发明的胶体金检测试纸条操作简单、快捷且无需应用专业仪器设备，适于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断。
文档编号G01N33/577GK102650635SQ20121015166
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者周咏武, 柳克华, 毛金武 申请人:湖南康润药业有限公司