专利名称：通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白的糖基化变化诊断癌症的方法及使用其诊断癌症的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质来诊断癌症的方法，及使用其的诊断试剂盒，更具体地，涉及通过检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的糖基化变化，尤其是蛋白质的N联糖链的变化，来诊断癌症的方法及使用其的诊断试剂盒。
背景技术：
为了分析蛋白质的功能，长期以来一直使用双向电泳。但最近，由于质谱仪象MALDI-TOF的发展以及N-末端氨基酸序列测定的简便方法的建立，蛋白质组学-一种后基因组功能分析方法取代了双向电泳的位置。可是，蛋白质组学限于应用在由高度复杂的信号转导所造成的癌症的研究中，因为尽管人体处于动态过程，蛋白质组学却可选择性的用于某一时间点的功能分析中。为了检测癌症，监测信号转导所造成的表达增加或翻译后修饰比观察染色后新斑点的出现更重要。双向电泳可探测到的蛋白质量太小了，不足以通过单一染色进行分析。观察蛋白质的糖基化有助于克服上述问题和纠正由于翻译后修饰所造成的分析误差。当将癌症病人组与对照组相比较时，通过普通的电泳难以发现两组之间的斑点差异，而在此同时，通过分析凝集素的糖基化变化却可能描绘出两组之间的清晰曲线图。这种方法现在被称之为糖组学(glycomics)，它是一种改良的分析方法，克服了蛋白质组学分析中的困难，其特征在于追踪进行翻译后的修饰时蛋白质的糖基化变化。
通过观察肿瘤发生和转移过程中细胞的生物学变化，可以得到这样的结论细胞膜表面的各种糖蛋白或糖脂被来自原癌基因的特异信号所诱导而经历“异常的糖基化”，导致糖链改变，连续引起细胞间粘附和识别的变化，从而造成个体的肿瘤发生和转移(Hakomori和Kannagi，1983，J.Natl.Cancer Inst.，71231-251；Feizi，1985，Nature，31453-571)。当外部刺激物进入时，信号通过原癌基因ras、转录因子ets-1转送从而刺激N-乙酰葡萄糖胺转移酶V(GnT-V)的表达。GnT-V是催化N-乙酰葡萄糖胺附着于糖蛋白碱性糖链的β1，6位点上反应的酶，已知此酶与癌症入侵和转移直接相关(Dennis等，1987，Science，236582-5853)。至于糖蛋白，碱性糖链是在蛋白质合成后形成于内质网(RE)中的，随后转移到高尔基体中。然后，在那由细胞的多种重要活动所产生的各种糖转移酶(glycotransferase)将糖加到蛋白上。通过6种N-乙酰葡萄糖胺转移酶(I-VI)的催化作用形成初级糖链，尤其是形成β1，6-N-乙酰葡萄糖胺糖链的GnT-V被认为与肿瘤发生和转移有密切的关系。GnT-V位于高尔基体。此酶通过引起糖链的改变使靶蛋白进入或从细胞表面分泌出来。与此同时，糖蛋白识别靶细胞的表面蛋白质并随后粘附其上，引起癌症。
1987年，Dennis等人的报告首次注意到了GnT-V，他们发现β1，6支链显著表现为癌症组织正在生长或处于转移期间(Dennis等，1987，Science，236582-5853)。细胞表面蛋白质gp130是GnT-V的主要靶蛋白之一并且在添加β1，6-N-乙酰葡萄糖胺时显示出高度的转移活性。GnT-V基因敲除小鼠已被建立，在其胚胎干细胞(ES)中GnT-V缺失，且多瘤病毒中部T抗原(下文表示为“PyMT”)病毒原癌基因被引入其中以诱发癌症。因此，与其它只有PyMT被过表达的正常小鼠组相比，PyMT诱发的癌症生长和转移在GnT-V基因敲除小鼠中被显著抑制(Granovsky等，2000，Nature Med.，6306-312)，且β1，6支链的生长引起高度的转移，尤其是在患乳腺癌的小鼠中。最近的研究支持，GnT-V对33种肝细胞癌(HCC)组织的活性是对正常组织活性的50倍，是对癌症周围组织的4倍(Yao等，1998，J Cancer Res.Clin.Oncol.，12427-307)。在将GnT-V过表达的大肠癌细胞系WiDr引入免疫缺陷小鼠以引发大肠癌时，或在利用受精卵通过CAM分析研究血管发生时，GnT-V的高转移活性都再次得到了证实(Miyoshi等，2001，未发表的结果)。因此，GnT-V被认为与转移相关并对任何组织类型都具有高转移活性。GnT-V酶纯化自人肺癌细胞和小鼠肾细胞，而此酶的cDNA克隆及基因组结构和启动子的分析都已完成(Gu等，1993，J Biochem，113614-619；Soreibah等，1993，J Biol.Chem.，26815381-15385；Kang等，1996，J Biol.Chem.，27126706-26712)。本发明人还在最近的研究中还报告了转录因子ets-1与GnT-V的表达有密切的关系(Ko等，1999，J Biol.Chem.，274(33)22941-22948)。由于饮食生活方式的趋于西化和癌症发展的持续增长，对于大肠癌，目前在男人和女人最高发病率中排名第四。不过，迄今为止，除了内窥镜检测法之外还无准确诊断结肠癌的方法。
因而，本发明人在癌症诱发细胞中检测到了通过GnT-V而被附加了糖的β1，6-N-乙酰葡萄糖胺，并发现了通过用质谱仪分析氨基酸序列显示其中有糖链改变的新糖蛋白。本发明人开发了由检测待测样品中上述蛋白质的糖链改变来诊断癌症的方法及使用其的癌症诊断试剂盒，从而完成了本发明。
发明详述本发明的一个目的是提供了通过检测肿瘤发生和转移相关的蛋白质的糖链改变来诊断癌症的方法及使用其的诊断试剂盒。
为了完成上述目的，本发明提供了通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白质的糖链改变来诊断癌症的方法。
本发明还提供了利用上述方法的诊断试剂盒。
本发明的进一步特征将在下文详述。
为了实现上述目的，本发明提供了通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白质的糖链改变来诊断癌症的方法。
上述癌症可选自由结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌和胰腺癌组成的组，但并不局限于此。
本发明提供了检测癌症细胞和转移细胞中蛋白质糖链支链改变的方法，表现为与正常细胞相比，β1，6-N-乙酰葡萄糖胺的变化，即N-联(N-linked)糖链的变化。形成β1，6-N-乙酰葡萄糖胺糖链的GnT-V与所有组织的肿瘤发生和转移都有关联，而β1，6-N-乙酰葡萄糖胺糖链可用凝集素植物凝集素-L4(下文表示为“L4-PHA”)进行检测。
转移是由细胞间的识别和粘附引起的。与细胞间识别和粘附有关的糖蛋白位于细胞表面或分泌自细胞表面。因此，可通过检测来自血或尿之类的体液的初步标志来诊断癌症。在本发明的优选实施方案中，为了确定大肠癌的特异标记，使用了GnT-V表达相当低的结肠癌细胞系WiDr，并利用了一种过表达GnT-V的细胞系GnT-V/WiDr作为结肠癌的模型系统进行糖组学的研究。在本发明中，用双向电泳分析了转移的癌症细胞的培养液。结果得到了两板胶。一板胶用考马斯亮兰染色，另一板胶用凝集素印迹处理。最终，癌症细胞和转移细胞而不是正常细胞中的糖链被改变了的蛋白质被分离开(见图5和图6)。用识别β1，6-N-乙酰葡萄糖胺分支的凝集素印迹在癌症细胞中探测到了具有强的暗斑点的某些区域。相应于这些斑点的蛋白质被证实与肿瘤发生和转移有关并显示出了糖链的变化。
本发明人切下这些斑点，然后再次切割这些蛋白质。用电喷射离子化(ESI)/四倍飞行时间(Q-TOF)质谱仪确定这些肽的氨基酸序列，从而证实了SEQ.ID.Nosl-15所代表的肽序列。通过将它们与已建立的蛋白质数据库进行比较来鉴别这些具有准确名称的肽序列并进一步分析各序列、分子量和等电点(见表1)。
基于N-联糖链位于序列Asn-Xaa-Thr/Ser中的Asn上的事实证实了上述蛋白质(Varki等，1999，Essentials of glycobiology，Cold SpringHarbor Laboratory，纽约，美国，85-100页)。
由SEQ.ID.No 1和2所代表的上述被分析的肽序列是PDF(来源于前列腺的因子)的一部分。同时，已知PDF是BMPs(骨形成蛋白)的一种，BMPs是TGF-β(转化生长因子β)家族的一员，并通过诱发软骨形成而与骨的发育和再生相关(Paralkar，V.M.等，1998，J Biol.Chem，27313760-13767)。且此肽具有两个保留完好的N-联糖链位点。上述蛋白质已以PDF、MIC-1(巨噬细胞抑制细胞因子-1)、PLAB(胎盘骨成形蛋白)、GDF-15(生长/分化因子15)等名称被许多研究小组所发现。
已知由SEQ.ID.No 3和4所代表的上述被分析的肽序列是T细胞亲环蛋白，也称为肽基脯氨酸顺反异构酶。所保留的N-联糖链可发现于众所周知作为抗氧化剂系统要素的序列的3个位点上。
通过与已建立的完整数据库相比较，证实了由SEQ.ID.Nos 6-11所代表的上述被分析的肽序列是一种新的蛋白质。该蛋白质在其第四个肽段上具有Asn-Xaa-Ser序列，提示了它可能包含N-联糖链。
已知由SEQ.ID.No 12和13所代表的上述被分析的肽序列具有许多名称，galectin结合蛋白、L3抗原、Mac-2-结合蛋白、血清蛋白90K、肿瘤相关蛋白90K等，并且从癌症或艾滋病病人的血液中探测到。RNA印迹的结果显示该蛋白质多表达于初级癌症组织及肿瘤相关细胞系中，尽管表达随疾病类型的不同而变化。该蛋白质被证实具有7个保留的N-联糖链位点(Ullich，A.等，1994，J Biol.Chem.，26918401-18407)。
已知由SEQ.ID.No 14和15所代表的上述被分析的肽序列是TIMP-1(基质金属蛋白酶-1的组织抑制物)，而迄今为止已发现4种TIMPs(1-4)。作为一种小分子蛋白质，这些蛋白质的分子量为22K-30K，且蛋白质具有40-50％的同源性。TIMP-1采取了糖基化的形式，因为其分子量似乎是高的(见图7)。且N-末端被附着于MMPs上，导致了对基质金属蛋白酶活性的抑制。此蛋白质在两个位点具有N-联糖链(Gomls-Reuth，F.等，1997，Nature，38977-81)。
即使已经已知上述五种蛋白质中的两种-galectin结合蛋白(肿瘤相关抗原90K)和TIMP-1与肿瘤发生和转移直接相关，但目前仍未出现关于癌症和上述两种细胞诱发β1，6-N-乙酰葡萄糖胺的糖链分支变化的明确报道。
上文所探测出的反映了其糖链变化与肿瘤发生和转移有关的蛋白质是糖蛋白，它们位于细胞表面或分泌自细胞表面，因此可通过检测血或尿之类体液中这些蛋白质的表达和N-联糖链的变化来诊断癌症。
用肿瘤发生和转移相关蛋白来诊断癌症的方法包括以下两步从病人身上取样(步骤1)；然后检测上述样品中与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的N-联糖链的变化及其表达(步骤2)。
上述步骤1中的样品可取自血或尿，优选用常规的血清分离方法制备。
至于上述步骤2中的检测方法，每一种基于抗原-抗体反应原理的分析方法都可使用。尤其优选使用ELISA(酶联免疫吸附试验)和免疫印迹这类用于分析抗原-抗体反应的最普通的方法。
为了诊断癌症，本发明人提供了在相应蛋白质抗体产生后检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的N-联糖链变化及其表达的方法。
用ELISA检测这些蛋白质的N-联糖链变化及其表达的方法包括以下步骤1)将抗肿瘤发生和转移相关蛋白质的抗体粘附在基质上；2)在上述基质上加入样品血清引起反应，然后对其进行洗涤；3)加入标记的同种抗体或标记的L4-PHA以进行进一步的反应；4)洗涤上述基质后，在上面加入结合了显色酶或荧光物质的二抗以进一步反应；并5)在用显色底物溶液将其显色后，用ELISA读数器检测其光密度。步骤1中的基质可选自由硝酸纤维素膜、用聚乙烯树脂合成的96孔板、用聚苯乙烯合成的96孔板和载玻片组成的组，本发明所选用的是96孔板。
生物素之类的化学化合物(或其衍生物)可用作上述步骤3的标记物。用生物素标记的相同抗体可分析与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的表达，并可用生物素标记的L4-PHA检测β1，6-N-乙酰葡萄糖胺的糖链分支的变化，即N-联糖链的变化。
过氧化物酶或碱性磷酸酶可用作与步骤4的抗体结合的显色酶，而FITC或RITC可用作荧光物质。特别是，与抗体结合的过氧物酶可用于本发明中。
ABTS[2，2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)]、OPD(邻-苯二胺)和TMB(N-四甲联苯胺)可用作步骤5的显色底物溶液，特别地，用过氧化物酶显色的OPD被用于本发明中。
本发明诊断癌症的方法可用于利用生物微型芯片和自动微阵列系统进行的样品质量分析中。
本发明还提供了通过检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的糖链变化及其表达来诊断癌症的试剂盒。
上文所提及的癌症包括大肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌和胰腺癌，但并不局限于此，即，任何类型的癌症都可作为本发明的靶目标。
与肿瘤发生和转移相关的蛋白质可选自由PDF、肽基脯氨酸顺反异构酶、galectin结合蛋白、L3抗原、Mac-2-结合蛋白、血清蛋白90K、肿瘤相关抗原90K、TIMP-1以及包含SEQ.ID.Nos 6-11所代表的肽序列的蛋白质。
本发明的诊断试剂盒可用于上述蛋白质表达的定性分析或定量分析，并可用于检测N-联糖链的变化，准确的说是β1，6-N-乙酰葡萄糖胺糖链分支的变化，ELISA可用于此检测中。例如，所用的诊断试剂盒可供ELISA，此ELISA所用的96孔微量滴定板已包被了抗上述蛋白质的抗体。
本发明的诊断试剂盒可包括抗上述蛋白质的抗体、基质、缓冲溶液、显色酶或荧光物质所标记的二抗、显色底物，及尤其是L4-PHA以检测β1，6-N-乙酰葡萄糖胺糖链分支的变化。
至于基质，可使用硝酸纤维素膜、用聚乙烯树脂合成的96孔板、用聚苯乙烯树脂合成的96孔板和载玻片。至于显色酶，可用过氧化物酶和碱性磷酸酶。至于荧光物质，可用FITC和RITC，而至于显色底物溶液，可用ABTS[2，2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)]、OPD(邻-苯二胺)和TMB(N-四甲联苯胺)。
为了用本发明的诊断试剂盒诊断癌症，可采取利用了生物微型芯片的自动分析方法。例如，制备蛋白质芯片和同时检测蛋白质的那些糖链的变化来构成诊断试剂盒，所述蛋白质芯片通过将其中由于与肿瘤发生和转移相关而改变糖链的蛋白质固定到载玻片的表面而获得。此诊断试剂盒还包括蛋白质、缓冲溶液和L4-PHA等。
附图简述

图1显示了通过6种与N-联糖链有关的糖基转移酶的作用而获得的糖链，图2是一套图表，显示了用糖基转移酶GnT-V将β1，6-N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAcβ1)加到糖链上的过程，图3是一套照片，显示了三个细胞系(Mock/WiDr、ets-1/WiDr、GnT-V/WiDr)的双向电泳获得的胶用考马斯亮兰染色后的结果，图4是一套照片，显示了凝集素与三种细胞系双向电泳获得的胶进行印迹杂交的结果，图5是一套照片，显示了来自三种细胞系的无血清介质在双向电泳后用考马斯亮兰染色的结果，图6是一套照片，显示了来自三种细胞系的无血清介质在双向电泳后与L4-PHA凝集素进行印迹杂交的结果，图7显示了用ESI/Q-TOF对timp-1氨基酸序列进行分析的结果。
实施例如以下实施例所示，本发明实践上的及目前优选的实施方案是例证性的。
不过，在考虑到此公布内容的基础上，本领域的技术人员可以在本发明的精神和范围内进行修饰和改善。
实施例1细胞系的双向电泳和凝集素印迹杂交本发明人用GnT-V/WiDr细胞系进行蛋白质组学的研究，考虑将此细胞系作为大肠癌的模型系统。具体地，就是首先培养细胞，然后在细胞内和细胞外分泌蛋白质中找出由于与所述酶相联系而引起癌症恶化的特异蛋白质组。在补充了10％FCS的RPMI培养基(Gibco BRL)中培养Mock/WiDr，对照组细胞系，ets-1/WiDr，过表达ets-1的细胞系，和GnT-V/WiDr，过表达GnT-V的细胞系。为了制备过表达的细胞系，将真核过表达质粒(Ko等，1999，J.Biol.Chem.，274(33)22941-22948)、转录因子ets-1和糖基转移酶GnT-V引入大肠癌细胞系WiDr(由美国典型培养物保藏中心提供；ATCC，美国)。用G418(350μg/ml)处理细胞以相应于新霉素抗性基因。菌落形成时，利用抗体进行蛋白质印迹杂交探测ets-1，并利用cDNA进行RNA印迹杂交探测GnT-V。2-3天后，当在二氧化碳培养箱中细胞铺满培养板底部90％的面积(汇合)时，用PBS(磷酸盐缓冲的盐水)洗细胞两次以上以去除残留的血清。用刮刀收集细胞并用PBS洗涤。将细胞悬浮于1ml PBS中，然后用超声发生器将其进行超声(三次，每次1分钟)。在上述破碎细胞中加入含TCA(三氯乙酸)的丙酮(终浓度10％)以仅沉淀蛋白质。用丙酮将其洗涤三次以上以去除残留的TCA，然后干燥。加入胶上样缓冲溶液(8M尿素、2％Triton X-100、20mM二硫苏糖醇、0.5％载体两性电解质、溴酚蓝染料)将其新溶解并用Multiphor-II(Pharmarcia公司)进行单向电泳(18厘米干条，pH3-10)。
在用含SDS和2-巯基乙醇的平衡缓冲溶液平衡所获得的单向电泳胶后，用Protean II(Bio-Rad公司)在12％聚丙稀酰胺凝胶上进行双向电泳。得到两板胶一板用生物安全染色溶液(Bio-Rad公司)进行考马斯亮蓝染色，另一板则用半干燥转移仪(Bio-Rad公司)转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。使识别β1，6-N-乙酰葡萄糖胺支链的生物素标记的L-PHA与具有该支链的糖蛋白粘附在一起，然后将HRP-标记的链霉抗生物素蛋白附着其上。通过ECL荧光反应将其暴露于胶片上。
为了与对照组(Mock/WiDr)进行比较，在相同条件下进行这些实验，即，首先进行单向电泳(等电点分离)，然后用考马斯亮蓝染色(图3)，将胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，随后用GnT-V特异的L4-PHA进行凝集素印迹杂交(图4)。进行3次以上的双向电泳并用计算机软件(PDQUEST，Bio-Rad公司)分析细胞内蛋白质表达的变化。结果，在蛋白质表达图谱上未发现差异显示4倍以上的蛋白质，在凝集素印迹杂交中也未发现显著的改变(图4)。
实施例2无血清培养基的双向电泳和凝集素印迹杂交本发明人将细胞系培养于无血清培养基中，从中研究糖链的变化。具体地，就是将Mock/WiDr细胞系、ets-1/WiDr细胞系和GnT-V/WiDr细胞系培养于含10％FCS的RPMI培养基(Gibco BRL)中。2-3天后，当在二氧化碳培养箱中细胞铺满培养板底部约80％的面积时，用PBS洗两次以上以去除残留的血清。然后加入无血清的RPMI进一步培养48小时，收获培养液。浓缩培养液后，加入含TCA(三氯乙酸)的丙酮(终浓度10％)使蛋白质沉淀。用丙酮将其洗涤三次以上以去除残留的TCA，然后干燥。加入凝胶上样缓冲溶液(8M尿素、2％Triton X-100、20mM二硫苏糖醇、0.5％载体两性电解质、溴酚蓝染料)将其溶解。用与上述实施例1相同的方法进行单向电泳和双向电泳。
完成双向电泳后，探测到少量的FCS，而预期PIM(翻译后修饰)会有广泛的变化，因此几乎不能将表达与有限的软件进行比较。与此同时，L-PHA凝集素印迹杂交的结果证实了与对照组相比，ets-1过表达细胞系中检测到了较暗的斑点，而在GnT-V过表达细胞系中则观察到最暗的斑点(图5和图6)。切下所有上述斑点中的12个并对其中的5个进行鉴别。
实施例3用ESI/Q-TOF质谱仪进行蛋白质序列分析为了鉴别位于上述5个斑点处的蛋白质，本发明人用考马斯亮蓝将已暴露于X-射线胶片PVDF膜(凝集素印迹杂交)进行染色，然后再次将其附着于已感光的胶片上，从而确定斑点的准确位置，随后切下与考马斯亮蓝染色的胶的那些相对应的斑点。用30％甲醇和100％乙腈对其脱色后，加入10个单位的胰蛋白酶(Promega公司)然后在37℃切割肽过夜。用乙腈提取肽，用离心冷冻干燥器将其冷冻干燥，然后用ESI/Q-TOF(电喷射离子化/四倍飞行时间)质谱仪测定氨基酸序列。ESI可分离各种肽，而从串联质谱(tandom mass)就可能进行序列分析。
结果，用ESI/Q-TOF测定了SEQ.ID.Nosl-15所代表的肽序列，并在与蛋白质数据库进行对比后对它们进行了鉴别。每个序列、分子量(MW)和等电点(pI)如下表(表1)所示。
<表1>
它们的特征解释如下。基于N-联糖链位于序列Asn-Xaa-Thr/Ser中的Asn上的事实证实了上述蛋白质(Varki等，1999，Essentials ofglycobiology，Cold Spring Harbor，纽约，美国，85-100页)。
上表1中的a包含SEQ.ID.No 1和2所代表肽序列，它是PDF(来源于前列腺的因子)，是TGF-β(转化生长因子β)家族的BMPs蛋白质(骨形成蛋白)中的一种，具有两个保守的N-联糖链位点。该蛋白质除PDF外，还以MIC-1(巨噬细胞抑制细胞因子-1)、PLAB(胎盘骨成形蛋白)、GDF-15、PTGFP等许多名称被多个研究小组所发现。
已知b是含SEQ.ID.No 3、4和5所代表的肽序列的T细胞亲环蛋白，也称为肽基脯氨酸顺反异构酶。它有三个保守的N-联糖链位点。
通过与已建立的数据库相比较，证实了包含由SEQ.ID.Nos 6-11所代表的肽序列的c是一种新的蛋白质。因为该蛋白质在其第四个肽段上具有Asn-Xaa-Ser序列，它也被认为具有N-联糖链。
已知包含SEQ.ID.No 12和13所代表的肽序列的d具有许多名称，如galectin结合蛋白、L3抗原、Mac-2-结合蛋白、血清蛋白90K、肿瘤相关蛋白90K等，并且具有7个保守的N-联糖链位点。
已知包含SEQ.ID.No 14和15所代表的肽序列的e是TIMP-1(基质金属蛋白酶-1的组织抑制物)，且是用ESI/Q-TOF所鉴别的上述timp-1的一个实施例(图7)。如图7所示，TIMP-1形状为由糖基化形成的长队，因此其分子量看上去较大。TIMP-1也具有两个N-联糖链位点。
实施例4蛋白质糖链分支的变化或其表达的检测为了通过检测上文所鉴别的蛋白质的糖链变化及其表达来诊断癌症，本发明人用ELISA来检测所述蛋白质的糖链变化及其表达。
首先，获得靶蛋白的cDNA，然后将其克隆到真核基因表达载体中。将其克隆到WiDr细胞系中。纯化来自上述培养溶液的蛋白质(各1mg)。将它们与佐剂混合，皮下注射入兔子体内，进行多克隆抗体的制备。按要求分别将需要量的抗体粘附于两个96孔板上。准确的说，就是在含100μl的0.1M碳酸钠(pH9.6)条件下用来源于细菌的蛋白A包被96孔板(Maxisorb Nunc)，1μg/孔。用TBS-T(Tris-缓冲的盐水-吐温、0.2MTris-Cl、0.4M NaCl、0.05％吐温-20)洗涤96孔板，然后将上文所制备的抗体粘附其上。用TBS-T再次洗涤，然后封闭未粘附抗体的部分，制备稳定的抗体系统。为了保证重复性和统计处理，在向培养板中加入血液或其它待测样品后进行连续稀释，然后用TBS-T将其洗涤3次。此时，靶蛋白将被粘附于其特异抗体上。用标记了生物素的相同抗体证实该蛋白质的表达，用凝集素证实β1，6N-乙酰葡萄糖胺的糖链变化，其中利用了生物素标记L-PHA。为了制备生物素标记的抗体，在23℃下、250ml SBRB(琥珀酰亚胺生物素反应缓冲液)中将抗体(5-10mg/ml)透析6小时。在DMSO(二甲亚砜)中将NHS-生物素(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)或NHS-LC-生物素(长链磺基琥珀酰亚胺6-(生物素酰胺)己酸酯衍生物生物素)的浓度调节至2-4mg/ml，将抗体和生物素溶液以1∶30(抗体∶生物素)的比率混合，然后在37℃进行搅拌。放置1小时使生物素和抗体结合。在BBS(硼酸盐缓冲的盐水)中进行透析后制备生物素标记的抗体。至于凝集素，则使用了购买的生物素标记的L-PHA。用购买的抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂盒检测生物素标记的抗体和凝集素。确切的说，加入H2O2和邻-苯胺，过氧化物酶的一种底物，然后测定490nm处的光密度。测定癌症病人血液样品中蛋白质的表达及β1，6N-乙酰葡萄糖胺的糖基化改变，然后与正常对照组的数据进行比较。
结果，癌症病人血液中的β1，6N-乙酰葡萄糖胺糖基化程度比正常血液中的提高了10-20倍。
工业适用性如下文所述，本发明的通过检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的糖链改变来诊断癌症的方法以及使用其的诊断试剂盒可有效地用于诊断包括大肠癌在内的癌症。
序列表序列表<110> 韩国生命工学研究院<120>通过检测肿瘤发生和转移相关蛋白的糖基化变化诊断癌症的方法及使用其诊断癌症的试剂盒<130> 2fpo-12-01<150> KR2001-88090<151> 2001-12-29<160> 1<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 1Gly Val Ser Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys1 5 10<210> 2<211> 13<212> PRT<213> 人<400> 2Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg1 5 10<210> 3<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 3Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys1 5<210> 4<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 4Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys1 5<210> 5<211> 19<212> PRT<213> 人<400> 5Asn Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Leu Ala Val Asp Gly Glu Pro1 5 10 15Leu Gly Arg<210> 6<211> 8<212> PRT<213> 人<400> 6Phe Thr Gly Gly His Glu Val Lys1 5
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<210> 14<211> 9<212> PRT<213> 人<400> 14Ser Glu Glu Phe Leu Leu Ala Gly Lys1 5<210> 15<211> 6<212> PRT<213> 人<400> 15Gln Ala Leu Gly Asp Ala1 51权利要求
1.一种诊断癌症的方法，其包含以下步骤i)从病人身上取样；和ii)用上述样品检测与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的N-联糖链变化。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品取自血或尿。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由大肠癌，胃癌，肺癌，肝癌，子宫癌，乳腺癌和胰腺癌组成的组。
4.如权利要求1所述的方法，其中的糖链变化是N-联β1，6N-乙酰葡萄糖胺的糖链分支的变化。
5.如权利要求1所述的方法，其中的蛋白质选自由PDF，肽基脯氨酸顺反异构酶，galectin结合蛋白，L3抗原，Mac-2-结合蛋白，血清蛋白90K，肿瘤相关抗原90K，TIMP-1和含SEQ.ID.Nos 6-11所表示的肽序列的蛋白质组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中的检测方法是ELISA或包括免疫印迹的利用抗原-抗体结合应答的方法。
7.一种通过检测上述蛋白质的糖链改变及其表达来诊断癌症的试剂盒，其由抗与肿瘤发生和转移相关的蛋白质的抗体，基质，缓冲液，显色酶或荧光物质标记的二级抗体，显色底物和标记的抗体或标记的L4-PHA组成。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述癌症选自由大肠癌，胃癌，肺癌，肝癌，子宫癌，乳腺癌和胰腺癌组成的组。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述癌症是大肠癌。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其中的糖链变化是N-联β1，6N-乙酰葡萄糖胺的糖链分支的变化。
11.如权利要求7所述的试剂盒，其中的蛋白质选自由PDF，肽基脯氨酸顺反异构酶，galectin结合蛋白，L3抗原，Mac-2-结合蛋白，血清蛋白90K，肿瘤相关抗原90K，TIMP-1和含SEQ.ID.Nos 6-11所表示的肽序列的蛋白质组成的组。
12.如权利要求7所述的试剂盒，其中的基质选自由硝酸纤维素膜，用聚乙烯树脂合成的96孔板，用聚苯乙烯树脂合成的96孔板和载玻片组成的组。
13.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述显色酶选自由过氧化物酶和碱性磷酸酶组成的组，所述显色底物溶液选自由ABTS[2，2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)]，OPD(邻-苯二胺)和TMB(N-四甲联苯胺)组成的组。
14.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述标记的抗体是生物素(或其衍生物)-标记的抗体，所述标记的L4-PHA是生物素(或其衍生物)-标记的L4-PHA。
全文摘要
本发明涉及通过检测肿瘤发生和转移相关的蛋白质来诊断癌症的方法，及其应用此法的诊断试剂盒，尤其是涉及通过检测蛋白质的糖基化变化来诊断癌症的方法及使用该方法诊断癌症的试剂盒。本发明的方法和试剂盒可有效地应用于包括结肠癌、胃癌、肺癌和肝癌在内的癌症的灵敏诊断。
文档编号G01N33/53GK1610831SQ02826502
公开日2005年4月27日 申请日期2002年12月28日 优先权日2001年12月29日
发明者高正宪, 黄寿英, 孙昊成, 吴世正, 李贞婲, 李尚澈, 刘钟信, 李大实 申请人:韩国生命工学研究院