专利名称：：一种测定土壤微生物生物量氮的方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中微生物生物量氮的测定，具体的说是一种改进土壤微生物生物量氮的测定方法。
背景技术：
：土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5jamM0jamS活的微生物总量，其养分占土壤中相应元素的比例很小，但在评价其对作物营养的作用时意义很大。因为它非常活跃并可迅速参与养分循环，既是养分循环过程的动力和进入土壤的有机物质的"转化者"，又是土壤能量和养分特别是C、N、P、S等元素内部供应机制的"源"和"库"(文献l:JenkinsonDS，LaddJN，Microbialbiomassinsoil:Measurementandturnover,SoilBiochemistry,1981，(5):415-471)。微生物量氮是指活的微生物体内所含有的氮，不同土壤类型及生态环境条件下其变异很大，耕层土壤微生物量氮一般为30-60kg，ha—1(文献2:WidmerP，BrookesPC，ParryLC.Microbialbiomassnitrogenmeasurementsinsoilscontaininglargeamountsofinorganicnitrogen.SoilBiologyandBiochemistry,1989，21(6):865—867)，在数量上低于或接近作物的吸氮量；并且周转较快，每年通过微生物周转的氮是土壤微生物量氮的l.5倍以上。^见，大部分矿化的氮主要来自土壤微生物量氮，因此，微生物量氮对土壤氮素供应和循环具有重要的意义(文献3:MacartyGW，MeisingerJJ，JenniskensFMM.Relationshipsbetweentotal—N，biomass—Nandactive-NinsoilunderdifferenttillageandNfertilizertreatments.SoilBiologyandBiochemistry,1995，27(10):1245—1250)。现阶国内外测定土壤微生物量氮的方法多采用氯仿熏蒸浸提法，主要步骤包括①熏蒸-浸提取新鲜土壤30g(相当于干土25g左右)于小烧杯中，放入装有30ml氯仿(带沸石)、30mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3min，关闭阀门。在25"C黑暗条件下培养24h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。另作不熏蒸作为对照。将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤。②测定吸取浸提液30.0ml于消煮管中，加10ml硫酸铬钾溶液和0.3g锌粉，充分混匀，室温下放置至少2h，再加入0.6ml硫酸铜溶液和8ml浓硫酸。缓慢加热(150°C)约2h至消煮管中水分全部蒸发掉，然后高温(硫酸发烟)消煮3h。待溶液完全冷却后，将消煮管接到定氮蒸馏器上，向蒸馏管中加入NaOH溶液，蒸馏，用标准稀HC1溶液滴定硼酸吸收液。(文献4:鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京中国农业科技出版社，2000:228-233)。使用该方法对土壤微生物量氮进行测定有以下缺点①该方法使用硫酸铬钾作还原剂不可取。硫酸铬钾中的Cr"诱发是癌症的因素之一，该类药品在欧洲国家明令禁止施用；土壤中的微生物量氮绝大部分为有机氮，有机氮不需要还原剂就可以被消解成NH4+-N。因此说，该方法使用硫酸铬钾是多此一举。②方法本身耗时K。就拿蒸水歩骤说，将温度调至15(TC，由于消煮管内壁光滑，一定产牛爆沸现象。若阻止爆沸现象的发生，则有两种途径降低温度或放沸石。降低温度至11(TC，则需至少2天2夜才能将水蒸干；若放沸石，则会在转移步骤中引起麻烦。③消煮后的产物为固态，不容易全部转移。消煮结束冷却后，消煮管中的固态产物需要一点一点刮出，因此在向蒸馏瓶中转移的过程中会存在损失。另外，为了加快试验的进程，加入的沸石会凝固在试管底部的中间，这又加剧了转移产物的难度。
发明内容本发明的目的是提供一种重复性好，重现性高，并且简单易行的测定土壤中微生物生物量氮的方法。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案如卜一种测定土壤微生物生物量氮的方法，1)采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理以不熏蒸土样为对照，将熏蒸和不熏蒸土样分别用4倍重量体积的0.5M硫酸钾溶液振荡浸提，过滤，得浸提液，分别进行以下步骤2)-4)中的操作；2)向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速剂l-3g，以及浓硫酸8-10ml，摇匀；3)采用梯度升温的方式对上述溶液进行加热溶液预先加热至lOO-ll(TC，开始梯度升温，依次使溶液于9-10min内升温至120-130°C、10-12min内升温至140-]55°C、11-13min内升温至160-170°C、12-14min内升温至180-195°C、13-15min内升温至200-220°C、14-17min内升温至205-240°C、16-19min内升温至240-260°C、45-65min内升温至340-380°C，恒温3-4h至溶液澄清，冷却；4)将消煮管中的溶液倒入蒸馏瓶中，用蒸馏水洗涤消煮管2-3次，每次蒸馏水用量为10-20ml，同时加入70-100ml10MNaOH溶液进行蒸馏，采用硼酸接收，采用已知浓度的标准盐酸溶液进行滴定，确定所消耗的盐酸溶液的用量；5)配制乙酰苯胺标准溶液取乙酰苯胺试剂1.9296克，加二次蒸馏水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有机氮200mg/1，以此溶液为母液进行逐级稀释至0-40倍；选取稀释后任意浓度的乙酰苯胺溶液5.0ml进行以下歩骤2)-4)中的操作；以蒸馏水5.0ml、混合加速剂l-3g、浓硫酸8-10ml配制的溶液为对照组，将对照组同样进行以下步骤2)-4)中的操作；按如下过程对试验结果的计算a.计算标准物质的回收率回收率％=~^^^^——^-^-x100n标准物质x5其中V^—滴定对照组时所消耗的HC1溶液体积，V—滴定乙酰苯胺溶液时消耗的HC1溶液体积，n标准物质一乙酰苯胺的质量浓度，5—吸取乙酰苯胺溶液的体积。b.有机氮含量的计算(H)xCHclxl4xtSxl000W(JN)=-,,一-回收率。/。xm其中Vws—滴定熏蒸样品时所消耗的HC1溶液体积，V—滴定未熏蒸样品时所消耗的HC1溶液体积，tS—样品的稀释倍数(即总浸提液与步骤2)-4)中所采用的浸提液5.0ml倍数比)，m—烘干土质量(通常土样中的重量含水量为83-85%);C.微生物生物量氮的计算其中Ew—薰蒸土样有机氮量与未薰蒸土样有机氮之差，K^一氯仿薰蒸杀死微生物体中的氮被浸提出来的比例，通常取0.45。采用熏蒸-浸提的方法(参见文献4)对土样进行处理，具体过程为取土壤25-30g，放入带沸石的装有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3-5min，关闭阀门；在室温黑暗条件下培养24-48h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止；另作不熏蒸作为对照；将熏蒸和不熏蒸土样分别用100ml0.5M硫酸钾溶液振荡浸提30-60min，过滤，得浸提液。所述加速剂由K2S04、CuSO^nSe组成，它们的重量比为90-100:9-10:1，歩骤4)中所采用的硼酸重量浓度为1%，用量为10-20ml。使用本发明改进方法对土壤微生物生物量氮进行测定，有如下优点1.该方法安全、环保，有利于生态环境的可持续发展。原方法在消煮过程中使用KCr(S04)2作还原剂，KCr(S04)2中的Cr"诱发是癌症的因素之一，该类药品在欧洲国家明令禁止施用，可想而知，大剂量的倾倒会影响环境威胁人类。而且，若C一+在消煮过程中被氧化成C一+，其对环境的影响会更大。况且，土壤中的微生物量氮绝大部分为有机氮，有机氮不需要还原剂就可以被消解成皿4+^。本发明使用K2S04、CuS04和Se粉作混合加速剂，这三种药品毒性较小或没有，对环境的胁迫较KCr(S04)2小很多。2.该方法省时。原有方法的蒸水步骤需要耗费很长时间，若加入沸石，又会对转移步骤产生影响，二者很难权衡。本发明直接采用吸取浸体液5ml进行消煮，省去蒸水步骤，直接向浸提液中加入催化剂和浓硫酸后消煮，省时省事。3.该方法精密度高，准确性好。原有方法消煮产物为红色沉淀，很难全部转移至蒸馏瓶中，若有沸石则更难转移。本发明方法的蒸馏产物为透明澄清的液体，可以全部转移，消煮管也易清洗。对标准样品的测定结果显示，本发明的方法测定结果平行性更好，准确性也令人满意。具体实施方式实施例1对比原有的方法和改进的方法测定乙酰苯胺标准溶液中的氮含量。参照文献4，使用本发明改进的方法对进口乙酰苯胺标准溶液中的氮含量进行测定。向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速剂3gJ加速剂质量组成为K2SO4:CuSO4:Se二90:9:l)，以及浓硫酸8ml，摇匀；采用梯度升温的方式对溶液进行加热至34(TC，恒温，3h后，冷却；将消煮管中的溶液倒入蒸馏瓶中，用蒸馏水洗涤消煮管2-3次，同时加入NaOH溶液进行蒸镏，硼酸接收，标准盐酸溶液进行滴定。具体过程如下1)配制乙酰苯胺标准溶液取德国进口乙酰苯胺试剂1.9296克，加二次蒸馏水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有机氮200mg/1。将该储备液按40及8倍数稀释，得到5及25mg/1浓度的溶液。以蒸馏水5.0ml、混合加速剂3g、浓硫酸8ml配制的溶液为对照组；2)取3根消煮管，消煮管中分别加入上述溶液5.0ml，混合加速剂(质量比为K2SO4:CuSO4:Se二90:9:l)3g，以及浓硫酸8ml，摇匀；3)采用梯度升温的方式对上述溶液进行加热溶液预先加热至100-ll(TC，开始梯度升温，依次使溶液于9-10min内升温至120-130°C、10-12min内升温至140-155°C、ll-13min内升温至160-170°C、12-14min内升温至180-195°C、13-15min内升温至200-220。C、14-17min内升温至205-240°C、16隱19min内升温至240-260。C、45-65min内升温至340-380°C，恒温3-4h至溶液澄清，冷却至室温；4)将消煮管中的溶液倒入蒸馏瓶中，用蒸馏水洗涤消一煮管2次，每次蒸馏水用量为20ml，同时加入100ml10MNaOH溶液进行蒸馏，用10ml重量浓度为1%硼酸接收，采用0.05M的标准盐酸溶液进行滴定，确定所消耗的盐酸溶液的用量；本方法的原理如下1)乙酰苯胺在消煮的过程中转变成铵态氮C8//9iW^^M/4+2)铵态氮在碱性条件下转变成氨气A^4+^~>AW3t试验结果的计算回收率％=(、滩誠—v加)xc肥X14X1000x!00n标准物质x5乙酰苯胺标准溶液中氮的含量为回收率。/。xn物质；对比例以文献4(鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京中国农业科技出版社，2000:228-233)的原方法对同样的乙酰苯胺标准溶液进行测定。对比原方法和改进方法对乙酰苯胺标准溶液中的氮进行测定，测定的乙酰苯胺标准溶液中氮的含量，结果参见表1所示。由结果可以看出，使用原方法的测定结果既不稳定也不准确，而改进方法灵敏度高准确性也好。表1原方法与改进方法测定乙酰苯胺标准溶液中的氮结果对比氮浓度(5mg/1)氮浓度(25mg/l)原方法编号改进方法原方法编号改进方法4.4714.9523.27524.564.3224.9123.13625.124.3435.0323.47724.834.2645.0224.15824.94编号l-8分别为实验的组数;注使用原方法和改进的方法测定乙酰苯胺中氮含量的差异源于每次加热的方式不尽相同编号l:从IO(TC时开始梯度升温，加热10min升温至120°C，加热1lmin升温至140。C，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热15min升温至200°C，加热14min升温至225°C，加热16min升温至250°C，加热60min升温至34(TC，恒温，3h后，冷却；编号2:从105。C时开始梯度升温，加热9min升温至120°C，加热llmin升温至14(TC，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热15min升温至215'C，加热14min升温至225°C，加热16min升温至250°C，加热60min升温至340。C，恒温，3h后，冷却；编号3:从110°C时开始梯度升温，加热10min升温至130°C，加热1lmin升温至14(TC，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热14min升温至21(TC，加热14min升温至225°C，加热17min升温至255°C，加热57min升温至34(TC，恒温，3h后，冷却；编号4:从IO(TC时开始梯度升温，加热10min升温至12(TC，加热12min升温至15(TC，加热13min升温至170°C，加热13min升温至180°C，加热14min升温至210°C，加热14min升温至225°C，加热16min升温至250°C，加热60min升温至34(TC，恒温，3h后，冷却；编号5:从105。C时开始梯度升温，加热9min升温至120°C，加热llmin升温至140。C，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热14min升温至210°C，加热17min升温至240°C，加热16min升温至260°C，加热50min升温至340。C，恒温，3h后，冷却；编号6:从IO(TC时开始梯度升温，加热10min升温至12(TC，加热llmin升温至14(TC;加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热13min升温至200。C，加热15min升温至220°C，加热16min升温至250。C，加热60min升温至34(TC，恒温，3h后，冷却；编号7:从IO(TC时开始梯度升温，加热llmin升温至125。C，加热10min升温至140。C，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热14min升温至21(TC，加热14min升温至225°C，加热17min升温至255°C，加热57min升温至34(TC，恒温，3h后，冷却；编号8:从105。C时开始梯度升温，加热llmin升温至130。C，加热llmin升温至140。C，加热12min升温至160°C，加热13min升温至180°C，加热14min升温至220°C，加热14min升温至225°C，加热16min升温至250°C，加热60min升温至340。C，恒温，3h后，冷却。实施例2使用改进的方法测定土壤中微生物生物量氮的含量。具体实施过程试验步骤为1)熏蒸-浸提取新鲜土壤30g(相当于干土25g左右)于小烧杯中，放入装有30ml氯仿(带沸石)、30mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3min，关闭阀门。在25'C黑暗条件下培养24h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。另作不熏蒸作为对照。将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤；2)领淀向消煮管中依次加入浸提液5.0ml，混合加速剂(质量比为K2SO4:CuSO4:Se=90:9:l)3g，以及浓硫酸8ml，摇匀；3)采用梯度升温的方式对溶液进行加热，即从iocrc时开始梯度升温，加热10min升温至120°C，加热1lmin升温至140°C，加热12min升温至160°C，加热14min升温至180°C，加热15min升温至200°C，加热16min升温至220。C，加热17min升温至26(TC，加热50min升温至340°C，恒温，3h后，冷却至室温；4)将消煮管中的溶液倒入蒸馏瓶中，用蒸馏水洗涤消一煮管2次，每次蒸馏水用量为20ml，同时加入100ml10MNaOH溶液进行蒸馏，用10ml重量浓度为1%硼酸接收，采用0.05M的标准盐酸溶液进行滴定，确定所消耗的盐酸溶液的用量；试验结果的计算1)计算标准物质的回收率回收车。—(V标准物质—V空fl)xC肥"4x1000^00n标准物质x52)有机氮含量的计算=(Vn-V絲蒸)xCHdXl4xtsx1000回收率y。xm3)微生物生物量氮的计算co(N)=￡N/&使用改进的化学分析方法与仪器分析方法测定土壤中微生物生物量氮含量结果如表2所示，仪器分析过程采用总有机碳自动分析仪进行测定，经t-检验比较，两组结果平均值之间不存在显著性差异，说明以所改进的方法测定土壤中微生物生物量氮结果准确可靠。表2化学分析方法和仪器分析方法测定土壤中微生物量氮结果比较(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.一种测定土壤微生物生物量氮的方法，其特征在于1)采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理以不熏蒸土样为对照，将熏蒸和不熏蒸土样分别用4倍重量体积的0.5M硫酸钾溶液振荡浸提，过滤，得浸提液，分别进行以下步骤2)-4)中的操作；2)向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，混合加速剂1-3g，以及浓硫酸8-10ml，摇匀；3)采用梯度升温的方式对上述溶液进行加热溶液预先加热至100-110℃，开始梯度升温，依次使溶液于9-10min内升温至120-130℃、10-12min内升温至140-155℃、11-13min内升温至160-170℃、12-14min内升温至180-195℃、13-15min内升温至200-220℃、14-17min内升温至205-240℃、16-19min内升温至240-260℃、45-65min内升温至340-380℃，恒温3-4h后，冷却；4)将消煮管中的溶液倒入蒸馏瓶中，用蒸馏水洗涤消煮管2-3次，每次蒸馏水用量为10-20ml，同时加入70-100ml10MNaOH溶液进行蒸馏，采用硼酸接收，采用已知浓度的标准盐酸溶液进行滴定，确定所消耗的盐酸溶液的用量；5)配制乙酰苯胺标准溶液取乙酰苯胺试剂1.9296克，加二次蒸馏水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有机氮200mg/l，以此溶液为母液进行逐级稀释至0-40倍；选取稀释后任意浓度的乙酰苯胺溶液5.0ml进行以下步骤2)-4)中的操作；以蒸馏水5.0ml、混合加速剂1-3g、浓硫酸8-10ml配制的溶液为对照组，将对照组同样进行以下步骤2)-4)中的操作；按如下过程对试验结果的计算a.计算标准物质的回收率其中V空白—滴定对照组时所消耗的HCl溶液体积，V标准物质—滴定乙酰苯胺溶液时消耗的HCl溶液体积，n标准物质—乙酰苯胺的质量浓度，5—吸取乙酰苯胺溶液的体积。b.有机氮含量的计算其中V熏蒸—滴定熏蒸样品时所消耗的HCl溶液体积，V未熏蒸—滴定未熏蒸样品时所消耗的HCl溶液体积，ts—样品的稀释倍数，m—烘干土质量；c.微生物生物量氮的计算ω(N)＝EN/KEN其中EN—薰蒸土样有机氮量与未薰蒸土样有机氮之差，KEN—薰蒸杀死微生物体中的氮被浸提出来的比例，通常取0.45。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理过程为取土壤25-30g，放入带沸石的装有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3-5min，关闭阀门；在室温黑暗条件下培养24-48h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止；另作不熏蒸作为对照；将熏蒸和不熏蒸土样分别用100ml0.5M硫酸钾溶液振荡浸提30-60min，过滤，得浸提液。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述加速剂由K2S04、CuS04和Se组成，它们的重量比为90-100:9-10:1。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)中所采用的硼酸重量浓度为1%，用量为10-20ml。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中溶液最终冷却至室温。全文摘要本发明涉及一种测定土壤微生物生物量氮的方法，采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理以不熏蒸土样为对照，将熏蒸和不熏蒸土样分别用4倍重量体积的0.5M硫酸钾溶液振荡浸提，过滤，得浸提液；向消煮管中依次加入5ml浸提液、3g混合加速剂、以及8ml浓硫酸，摇匀。缓慢加热至硫酸发烟，高温消煮3h至溶液澄清，冷却。将消煮产物无损失的转移至蒸馏瓶中，同时加入NaOH溶液进行蒸馏，硼酸接收，标准盐酸溶液进行滴定。本发明方法重复性好，重现性高，简单易行。文档编号G01N33/50GK101419226SQ20071015766公开日2009年4月29日申请日期2007年10月24日优先权日2007年10月24日发明者桦周,宇万太,璐张,强马申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所